Ex Vivo Calcium Imaging of Flat-Mounted Rat Retina upon Electrical Stimulation

MEA'ya monte edilmiş GCaMP 5G eksprese eden sıçan retinasını, GCL mikroskop tablasındaki elektrotlara bakacak şekilde yerleştirin. Perfüzyon sistemini bağlayın ve parametreleri, numune banyosunu oksijenli AMS ortamı ile sürekli olarak perfüze edecek şekilde ayarlayın. Ardından, bir floresan lamba, bir FITC filtresi ve bir CMOS kamera ile donatılmış ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu kullanarak retinayı inceleyin.

Uyarıcı elektrotların ve GCaMP eksprese eden hücrelerden gelen floresanın görülebildiği bir alan arayın. Darbe üreteci cihazları yazılımında, uygulama için darbelerin şekli, genliği, süresi, faz gecikmesi ve frekansı gibi elektriksel stimülasyon parametrelerini yapılandırın. Çıkış tetikleme sinyalini kullanarak kamerayı darbe üretecine bağlayın ve kamera yazılımının çekim modunu harici başlatma tetikleyicisine ayarlayın.

Harici bir tetikleyicinin başlamasını beklemek için kamera yazılımındaki başlat düğmesine basın. Darbe üreteci yazılımını kullanarak görüntü alma işlemini başlatın ve yakalanan görüntüleri kaydedin, dosya adının uygulanan tüm elektriksel stimülasyon parametrelerini içerdiğinden emin olun. Şimdi J görüntüsünü açın ve alan seçim araçlarını kullanarak ilgilendiğiniz bölgeyi bölümlere ayırın, ROI yöneticisine ekleyin ve ROI yöneticisi menüsünü kullanarak bir zip klasörü olarak kaydedin.

Daha fazlasına gidip çoklu ölçü'ye tıklayarak hücre somalarından ortalama gri değeri çıkarın. Sütunların ROI'lere ve satırların zaman dilimlerine karşılık geldiği tek bir tablo elde etmek için 600 dilimin tümünü ve dilim başına bir satırı ölç seçeneklerini etkinleştirin. Ardından, measure komutunu kullanarak ROI'lerden centroid'i çıkarın.

Fotoğraf ağartma efektini düzeltmek ve arka planı en aza indirmek için, her seri çekimden önce uyarıcı olmayan aralıklardan yaklaşık 15 ila 20 kare seçin ve optimum veri analizi sağlamak için bu kareleri doğrusal bir eğriye sığdırın. 60 saniyelik bir görüntü elde etme sırasında her 10 saniyede bir beş nabız dizisi patlaması üzerine hücre somalarının kalsiyum izleri gösterilmektedir. Uyarıcı olmayan dönemlerden kareler, foto ağartma etkisini düzeltmek için kullanılır.

Hücreleri aktive etmek için gereken akım ile uyarıcı elektrottan uzaklık arasındaki ilişki, uyarıcı elektrota daha yakın bulunan hücrelerin bir yanıt uyandırmak için daha düşük akım değerlerine ihtiyaç duyduğunu gösterdi.