Constructing the 3D Human-Stem-Cell-Derived In Vitro Blood Brain Barrier

Ayrışmış endotel hücrelerini, parazitleri ve astrositleri kullanarak insan pluripotent kök hücre türevli kan-beyin bariyerini veya iBBB'yi birleştirin, Pipetleme hatalarını hesaba katmak için hesaplanan hücre sayısından %10 daha fazlasını dahil ederken üç hücre tipini konik bir tüpte birleştirin. Hücre karışımını üç dakika boyunca 300 g'da döndürün. Süpernatanı aspire edin, hücre peletini yaklaşık 50 mikrolitre ortamla bırakın.

Bir P200 pipeti kullanarak, tek hücreli bir bulamaç oluşturmak için artık ortamdaki hücre peletini nazikçe yeniden süspanse edin. Elde edilen hücre bulamacını içeren tüpü buz üzerine yerleştirin ve istenen sayıda iBBB başına yeterli miktarda azaltılmış GF Bazal Membran Matrisi ekleyin. Hücreleri herhangi bir hava kabarcığı oluşturmadan homojen bir şekilde karıştırın.

Elde edilen hücre matrisi karışımından 50 mikrolitreyi 48 oyuklu veya 96 oyuklu cam tabanlı bir kültür kabının bir kuyucuğuna pipetleyin ve tabağın dibine eşit olarak dağıtın. Hücreleri kapsüllerken matrisi polimerize etmek için çanağı 37 santigrat derecede 30 ila 40 dakika inkübe edin. Son olarak, kuyuya 500 mikrolitre takviye edilmiş astrosit ortamı ekleyin ve iBBB'leri kültürde tutun.

96 oyuklu bir plaka için, tipik olarak iki hafta süren aşağı akış tahlilleri için yeterince gelişene kadar kuyuya 100 ila 150 mikrolitre ortam ekleyin. Düzgün bir şekilde oluşturulmuş iBBB, parlak alan mikroskobu altında katılaşmış, tek yarı saydam bir disk olarak ortaya çıktı. 24 saat sonra, eşit olarak dağılmış tek hücreler tanımlandı.

İki hafta sonra, tanımlanması zor olsa da daha belirgin yapılar görüldü.