Çözülmüş dondurularak saklanmış kan örneğini kültürledikten sonra, oda sıcaklığında gerekli X-ışını dozları ile ışınlayın. Ardından, her bir oyuğa 1.62 mililitre ılık RPMI kültür ortamı ekleyin. T lenfositlerinde hücre bölünmesini uyarmak için, her bir oyuğa 40 mikrolitre fitohemaglutinin ekleyin ve iyice yeniden süspanse edin.
Plakayı 23 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Ertesi gün, sitokinezi bloke etmek için oyuk başına sekiz mikrolitre sitokalasin B ekleyin. 70 saat sonra, plakayı inkübatörden çıkarın ve hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.
Her birini iki mililitre PBS ile durulayın ve bu PBS'yi 15 mililitrelik tüpe ekleyin. Hücre süspansiyonunu sekiz dakika boyunca 180 G'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın ve pelet üzerinde 500 mikrolitre bırakın. Peletin girdabını girdaplarken tüpe iki mililitre soğuk potasyum klorür ekleyin.
Yine, daha önce gösterildiği gibi süpernatanı santrifüjleyin ve atın. İki mililitre soğuk fiksatif 1'i yavaşça ekleyerek peleti vorteksleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, süpernatanı santrifüjleyin ve atın.
Peleti damla damla girdaplarken tüpe iki mililitre soğuk fiksatif 2 ekleyin. Tüpü gece boyunca dört santigrat derecede bırakın. Numuneyi santrifüjleyin ve hücreleri pelet boyutuna göre konsantre etmek için süpernatanı başka bir tüpe aktarın.
Slaytları izopropanol ile temizleyin ve uygun şekilde etiketleyin. Peletin girdaplandırılmasından sonra, bir slayt üzerine 40 mikrolitre sabit hücreli süspansiyon ekleyin. Kuruduktan sonra, slaytı bir dakika boyunca akridin turuncu lekesine batırın.
Ardından, slaytı bir dakika boyunca bir fosfat tamponuna koymadan önce damıtılmış suyla hızlı bir şekilde yıkayın. Slaytın arkasını kurutun ve temiz kağıt mendil üzerine yerleştirin. Sürgünün üzerine 20 mikrolitre fosfat tamponu ekleyin ve hava kabarcıklarını önleyerek temiz bir kapak kılıfı ile örtün.
Slaytı silikon çimento ile kapatın. Slaytı bir floresan mikroskobu altına yerleştirin ve iki çekirdekli hücreleri inceleyin. Son olarak, mikronükleusları manuel olarak sayın.
Yuvarlatılmış iki çekirdekli hücrelerin varlığı, dondurularak saklanmış tam kan örneklerinden sağlıklı canlı hücrelerin başarılı bir şekilde alındığını gösterdi. Artan radyasyon dozları ile, mikronükleus veriminde doğrusal bir kuadratik artış gözlendi. Sahte ışınlanmış kontrol örneklerinde arka plan mikronükleus verimleri, esas olarak gecikmeli kromozomlardan kaynaklanmıştır.
