Injecting bOpto-BMP/Nodal Constructs into Zebrafish Embryos

Başlamak için, ışığa maruz kalmayı ve sıcaklığı kontrol etmek için bir ışık kutusu oluşturmak için bir inkübatör ve bir LED Mikroplaka Aydınlatıcı kullanın. Ardından, inkübatörün üst rafına altı oyuklu bir plaka yerleştirin ve ışık huzmesinin onu eşit şekilde sarıp sarmadığını kontrol edin. Işık kapsamının dağılımını görselleştirmek için bir sayfa kağıt kullanın.

Işınımı ve uzamsal tekdüzeliği ölçmek için bir ışık ölçer kullanın. Enjeksiyonlardan en az bir gün önce, enjeksiyon kapları ve agaroz kaplı altı kuyucuklu plakalar yapın. Bir enjeksiyon kabı kalıbını embriyo ortamı ile durulayın ve yavaşça tüy dökücü ve agaroz üzerine yerleştirin.

Agaroz katılaştıktan sonra, kalıbı çıkarmak için tırnağı nazikçe kullanın. Daha sonra, klorsuz embriyolar üzerinde immünofloresan deneyleri için alevli cam pipetler hazırlayın. Bir cam pipetin ucunu bir topuz ve brülör alevine yerleştirin ve kenarları pürüzsüz hale gelene kadar sürekli döndürün.

Burada gösterilen mRNA'ları kullanarak bir enjeksiyon karışımı hazırlayın. Fenotipleme tahlili için, iğneyi bir hücre aşamasında doğrudan hücrenin merkezine sokun ve enjeksiyon karışımının bir nanolitresini enjekte edin. Bir immünofloresan testi yapıyorsanız, kaplanmış embriyo hücresinin merkezini bir hücre aşamasında hedefleyin.

Her iki tahlil için, maruz kalmamış enjekte edilmemiş, maruz kalmamış enjekte edilmiş, maruz kalmış enjekte edilmemiş ve maruz kalmış enjekte edilmiş embriyolar için yeterli embriyo hazırlayın. Koşul başına en az 30 embriyo seçin. İmmünofloresan testi için, gelişim aşamalarının ilerlemesini değerlendirmek için bir vekil olarak enjekte edilmemiş embriyoları içeren ek bir tabak hazırlayın.

Enjeksiyondan sonra, embriyoları Petri kaplarında 28 santigrat derecede inkübe edin.