Bu protokolün finansmanı NICHD Intramural Programı tarafından KWR'ye (ZIA HD009002-01) sağlanmıştır. Aydınlatıcı geri bildirimleri için Jeff Farrell ve laboratuvarına, mükemmel teknik destek için Will Anderson'a, protokolü stres testi için Leanne Iannucci'ye ve zebra balığını sağlıklı tutmak için sıkı çalışmaları için NIH Shared Zebrafish tesisine teşekkür ederiz.

Zebra Balıklarında Optogenetik Sinyal Manipülasyonu ile Gelişimin İncelenmesi

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

mRNA enjeksiyonu, zebra balığı embriyolarına bOpto-BMP/Nodal vermek için mevcut stratejidir. Bu yöntemin birkaç dezavantajı vardır. İlk olarak, uygun mRNA miktarı laboratuvarlar arasında değişir. Kullanılan miktar, ışığa maruz kalarak sinyalleşmeyi sağlam bir şekilde etkinleştirmek için yeterli olmalıdır, ancak yanlışlıkla karanlık aktivasyon olmadan. Optimal mRNA seviyelerini bulmak için birkaç miktarı test etmek iyi bir fikirdir ve bir kez kurulduktan sonra, aynı miktarda mRNA'yı tekrarlanabilir bir şekilde eklemek için bir ana karışımın alikotlarını oluşturun. İkincisi, enjekte edilen mRNA'nın eşit olmayan dağılımı, eşit olmayan sinyal aktivasyonuna yol açabilir. Hücrenin merkezine (yumurta sarısına değil) enjekte edilmesinin mRNA dağılımını bile desteklediği düşünülmektedir. Son olarak, enjekte edilen mRNA zamanla bozulduğundan, bu yaklaşım daha yaşlı embriyolarda yapılan deneyler için uygun olmayabilir. Gelecekte, bu problemler, maternal veya ilaca bağlı bir promotör ile her yerde bOpto-BMP / Nodal eksprese eden transgenik zebra balığı hatları ile ele alınabilir. Potansiyel olarak ışığa duyarlı yetişkin zebra balığı ile çalışmak bu bağlamda zor olsa da, optogenetik araçları barındıran zebra balığı 61,62 ve Drosophila 22,34,35,63 transgenikler başarıyla geliştirilmiştir.
İstenmeyen fotoaktivasyondan kaçınmak, optogenetik araçlarla ilgili genel bir zorluktur. Basitlik için, 1.5 hpf'den daha eski enjekte edilen embriyoları ışığa duyarlı olarak tedavi edin. Yanlışlıkla ışığa maruz kalma, genellikle plakaları veya tabakları alüminyum folyo ile sararak önlenebilir. Bununla birlikte, 1.5 hpf'den daha eski canlı embriyoların görsel gözlemini gerektiren deneyler için, kırmızı ışık kaynaklarını kullanmak veya beyaz ışık kaynaklarını LOV-dimerize dalga boylarını bloke eden ucuz jel filtre kağıdı ile kaplamak mümkündür (Malzeme Tablosu).
Burada açıklanan ışık kutusu, ışık ışınımı seviyeleri, dinamikleri ve dalga boyları üzerinde hassas kontrol gerektiren özel uygulamalar için tasarlanmıştır (Şekil 2). Bu ışık kutusunun diğer faydaları arasında tek tip ışığa maruz kalma, ihmal edilebilir yanlışlıkla numune ısıtması, birden fazla 6 oyuklu plaka için geniş alan ve uzun ömürlü, spektral olarak iyi karakterize edilmiş ışık kaynakları yer alır. Bununla birlikte, araştırma uygulamasına bağlı olarak farklı ışığa maruz kalma stratejileri tercih edilebilir. Birçok laboratuvar, inkübatörlerin LED şeritlerle kaplanması, LED panellerin numunelerin üzerine asılması veya LED'lerin kültür kabı kapaklarına dahil edilmesi dahil olmak üzere daha küçük ayak izlerine sahip daha basit ve daha uygun maliyetli tek tip ışığa maruz kalma sistemleri geliştirmiştir 32,38,39,40,64,65,66. Daha da önemlisi, bu protokolde kullanılan ışık kutusu, kullanıcıların bireysel kuyuları bağımsız olarak düzenlemesine (Bugaj ve ark.52'nin aksine) veya ışığa maruz kalma üzerinde uzamsal kontrol sağlamasına izin vermez. Uzamsal olarak lokalize optogenetik aktivasyon, sırasıyla SPIM veya konfokal sistemlerde lazerler kullanılarak bOpto-BMP38 ve bOpto-Nodal39 ile gösterilmiştir ve ayrıca çeşitli model sistemlerde diğer birçok optogenetik strateji ile gerçekleştirilmiştir (Rogers ve Müller12'de tartışılmıştır). Hatta bazı yaklaşımlar hücre altı uzamsal çözünürlüğeulaşmıştır 29,30,31. Mekansal olarak lokalize ışığa maruz kalma sistemlerinin uygulanması bu protokolün kapsamı dışında olsa da, dijital mikro ayna cihazları veya maskeleme yaklaşımları gibi özel ekipmanlarla bOpto-BMP/Nodal ile mekansal aktivasyon deneyleri teorik olarak mümkündür. Okuyucular, bir ışığa maruz kalma stratejisine başlamadan önce optogenetik deneyler için DIY ışık kutuları hakkındaki kapsamlı literatürü keşfetmeye teşvik edilir (bkz. örneğin, Gerhardt ve ark.51, Bugaj ve ark.52, Kumar ve Khammash 53 ve https://www.optobase.org/materials/'da daha fazlası).
Moleküler optogenetik stratejiler, mutantlar, ektopik gen ekspresyonu, rekombinant proteinler ve ilaçlar gibi tarihsel yaklaşımlara kıyasla genellikle biyolojik süreçler üzerinde daha yüksek derecede uzay-zamansal kontrol sunar. Optogenetik yaklaşımların faydalarıyla ilgilenen okuyucular, zebra balığı ve diğer organizmalarda bulunan diğer yayınlanmış araçları keşfedebilir. Bunlar, ek sinyal yollarını 32,65,67,68 manipüle etmek, gen ekspresyonunu 61,64,66,69,70,71 düzenlemek, protein lokalizasyonunudeğiştirmek 31,72 ve apoptozu aktive etmek için araçlar içerir 62. Bu araçlar ve diğerleri, moleküler optogenetik yaklaşımları için küratörlüğünde bir web kaynağı olan OptoBase'de uygun bir şekilde kataloglanmıştır28. Yeni optogenetik araçlar oluşturmak için ilham alanlar için, kaynak aynı zamanda yeşil, kırmızı ve yakın kızılötesi dalga boylarına yanıt veren ışığa duyarlı proteinler de dahil olmak üzere çok çeşitli stratejilerde kullanılan ışığa duyarlı proteinlerin yararlı tanımlarını da içeriyor. Bilim camiasının moleküler optogenetik yaklaşımların tam potansiyelini gerçekleştirmesi için heyecanlıyız.

Sinyal yolları, hücrelerin çevrelerine yanıt vermelerine ve doku ve organizma çapında ölçeklerde aktiviteleri koordine etmelerine olanak tanır. Embriyonik gelişim için çok önemli olan sinyaller arasında TGF-beta süper aile üyeleri kemik morfogenetik proteini (BMP) ve Nodal 1,2,3 bulunur. Embriyogenez sırasında, bu sinyaller ve diğerleri tarafından düzenlenen yollar, çeşitli doku ve organların düzgün bir şekilde gelişmesini ve arayüz oluşturmasını sağlamak için gen ekspresyonunu ve ek süreçleri kontrol ederek vücut planını şekillendirir. Doğum kusurları ve kanser de dahil olmak üzere patolojiler, sinyalleşme veya sinyalleşmeye verilen tepkiler bozulduğunda ortaya çıkabilir 4,5,6,7. Sinyalizasyonla ilgili titiz araştırmalara rağmen, seviyelerin ve dinamiklerin çeşitli bağlamlarda nasıl çözüldüğü hakkında keşfedilecek çok daha fazla şey var 8,9,10,11, özellikle geliştirme sırasında 12,13,14,15,16,17,18,19.
Sinyalleşmenin nasıl çözüldüğünü anlamak için ideal bir deney, sinyal seviyelerini, zamanlamayı ve/veya dinamikleri - yüksek derecede uzamsal ve zamansal kontrol ile - manipüle etmek ve sonuçları değerlendirmek olacaktır. Örneğin, gelişmekte olan dokuları modellemek için hassas uzamsal sinyal gradyanları önerilmektedir20,21. Sinyal gradyan uzamsal dağılımlarını değiştirmek, bu hipotezi test etmeye yardımcı olacaktır22. Ek olarak, çeşitli hücresel tepkiler oluşturmada sinyal dinamiklerinin önemi daha net hale geliyor: Aynı sinyal yolu, hücrelere sinyal frekansına bağlı olarak farklılaşma veya çoğalma talimatı verebilir, örneğin 9,23. Sinyal dinamiğinin kolayca manipüle edilebileceği deneysel paradigmalar, dinamikler ve hücre kaderi kararları arasındaki ilişkiyi araştırmak için değerli olacaktır8,12,13,14,15.
Tarihsel olarak, gelişimsel bağlamlarda sinyalleşmeyi manipüle etmek için birden fazla yöntem kullanılmış ve bu da temel keşiflereyol açmıştır 1,2,3. Sinyalleşme, fonksiyon kaybı mutantları, ektopik inhibitör ekspresyonu veya antagonist ilaçlar kullanılarak bloke edilebilir. Sinyallemeyi aktive etme yöntemleri arasında agonist ilaçlar, rekombinant ligandlar, ligandların veya yapısal olarak aktif reseptörlerin ektopik ekspresyonu ve yol inhibitörü fonksiyon kaybı mutantları bulunur. Bu yöntemler, deneysel kontrolün sürekliliği boyunca değişir. Örneğin, mutantlar ve ektopik ekspresyon sürekliliğin balyoz tarafına düşebilir: Bu yaklaşımlarla, yol aktivitesindeki dramatik, sistemik değişiklikler erken ölüme neden olabilir ve daha sonraki aşamalarda araştırmaları engelleyebilir veya zamanla çözülmesi zor olan pleiotropik etkilere neden olabilir. Ek olarak, seviye veya süre gibi bir seferde bir sinyal özelliğini bağımsız olarak manipüle etmek genellikle zordur. Sürekliliğin diğer ucuna doğru, numuneleri ilaçlara veya zamansal ve bazen uzamsal kontrole sahip rekombinant proteinlere maruz bırakan mikroakışkan cihazlar gibi bazı yöntemlerdaha hassas deneysel kontrol sunar 18,24,25 veya benzer faydalar sağlayabilen ısı şoku ile indüklenebilir ve dokuya özgü promotörler dahil olmak üzere genetik yöntemler16,26,27. Ancak, bu yöntemlerin yürütülmesi zor olabilir, geri döndürülemeyebilir, nispeten yavaş kinetiklere veya düşük çözünürlüğe sahip olabilir ve bazı model sistemlerde kullanılamayabilir.
Moleküler optogenetik yaklaşımlar bu araç setine güçlü bir katkı sağlar. Bu yaklaşımlar,sinyal 8,12,13,14,15 dahil olmak üzere biyolojik süreçleri manipüle etmek için farklı ışık dalga boylarına yanıt veren proteinleri kullanır ve hücre kültüründen bütün hayvanlara kadar çeşitli sistemlerde kullanılmak üzere onlarca yıldır geliştirilmiştir12,13,28. Tarihsel yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, moleküler optogenetik genellikle biyolojik süreçler üzerinde daha yüksek derecede uzay-zamansal kontrol sunabilir: Optogenetik sistemlerdeki kontrolör ışıktır ve ışık dalga boyu, yoğunluğu, süresi ve maruz kalma sıklığının kontrolü nispeten basittir. Konfokal ve iki fotonlu mikroskoplar gibi gelişmiş sistemlerle, hücre altı aralıkta uzamsal kontrol mümkündür 29,30,31. Sinyalleri optogenetik olarak manipüle etmek için araçlar geliştirilmiş ve Johnson ve ark.22, Čapek ve ark.32, Krishnamurthy ve ark.33 ve Huang ve ark.34'te açıklananlar dahil olmak üzere çeşitli sistemlerde uygulanmıştır. Örneğin, optogenetiğin sağladığı uzamsal kontrolden yararlanan bu strateji, yakın zamanda Drosophila embriyolarında bir sinyal gradyanını değiştirmek için kullanıldı ve sinek embriyogenezinin bu gradyandaki değişikliklere şaşırtıcı derecede sağlam olduğunu gösterdi22. Optogenetik sinyal aktivatörlerinin tersine çevrilebilirliği ve hızlı açma/kapama kinetiği, onları sinyal dinamikleri 8,12,13,14,15,34,35,36'nın kodunun çözülmesini araştırmak için çekici araçlar haline getirmiştir.
Erken zebra balığı embriyosu, optogenetik çalışmalar için çok uygun bir in vivo sistemdir, çünkü dışarıdan döllenmiş, şeffaf, mikroskopi dostu ve genetik olarak izlenebilirdir. Işığa maruz kalmanın annenin dışında gelişen embriyolara verilmesi daha kolaydır, ışık opak olmayan dokularına nüfuz edebilir ve bunlara erişebilir, canlı zebra balığı embriyoları görüntülemeyi iyi tolere eder (şeffaf olmanın yanı sıra) ve mevcut genetik yöntemler, yararlı transgeniklerin geliştirilmesine ek olarak, yıkım ve aşırı ekspresyon deneyleri için basit fırsatlar sağlar37.
Son zamanlarda, mavi ışığa maruz kalan zebra balığı embriyolarında BMP38 ve Nodal39 sinyalini aktive etmek için optogenetik araçlar geliştirilmiştir (Şekil 1). Bu araçları bOpto-BMP ve bOpto-Nodal (mavi ışıkla aktive edilen b ve optogenetik için Opto) olarak adlandırıyoruz. bOpto-BMP/Nodal, benzer yol aktivasyon mekanizmalarına dayanmaktadır. BMP veya Nodal ligandlarının ilgili reseptör serin-treonin kinazlarına bağlanması, sinyal efektörlerinin fosforilasyonuna yol açan reseptör kinaz alanı etkileşimlerini yönlendirir (BMP için Smad1/5/9 ve Nodal için Smad2/3). Fosforile sinyal efektörleri daha sonra çekirdeğe translokasyon yapar ve hedef gen ekspresyonunudüzenler 3 (Şekil 1A, D). Bu reseptör kinaz etkileşimleri, reseptör kinazların ışığa duyarlı dimerize edici proteinlere bağlanmasıyla ışığa duyarlı hale getirilebilir: Işığa maruz kaldığında, bu kimerik proteinler dimerize olmalı ve reseptör kinaz alanlarının etkileşime girmesine ve sinyalleşmeyi aktive etmesine neden olmalıdır (Şekil 1B, C, E, F). Önemli olarak, endojen reseptörlerin aksine, bOpto-BMP / Nodal, liganddan bağımsız aktivite sağlayan hücre dışı ligand bağlama alanları içermez (Şekil 1C, F). Bu optogenetik aktivasyon stratejisi ilk olarak reseptör tirozin kinazlar40,41,42 ile sağlanmış ve daha sonra reseptör serin-treonin kinazlara uygulanmıştır.
bOpto-BMP/Nodal, Vaucheria fridiga AUREO43,44 alglerinden mavi ışığa duyarlı (~450 nm) homodimerize edici ışık-oksijen-voltaj algılama (LOV) alanını kullanır. Bu yapılar, bir LOV alanına kaynaşmış BMP veya Nodal reseptör kinaz alanlarını takip eden bir membran hedefleme miristoilasyon motifinden oluşur (Şekil 1B, E). Mavi ışığa maruz kalma, ilgili Smad fosforilasyonuna ve yol aktivasyonuna yol açan reseptör kinaz alanı etkileşimlerine neden olan LOV homodimerizasyonuna neden olmalıdır (Şekil 1C, F). bOpto-BMP için, Acvr1l (Alk8 olarak da bilinir) ve BMPR1aa'dan (Alk3 olarak da bilinir) tip I reseptör kinaz alanları ve BMPR2a'dan tip II reseptör kinaz alanı ile yapıların bir kombinasyonunun sinyal38'i en iyi şekilde aktive ettiği bulunmuştur (Addgene #207614, #207615 ve #207616). BOpto-Nodal için, Acvr1ba'dan tip I reseptör kinaz alanı ve Acvr2ba'dan tip II reseptör kinaz alanı ile yapıların bir kombinasyonu kullanılır39.
bOpto-BMP/Nodal, tek hücreli aşamada mRNA enjekte edilerek erken zebra balığı embriyolarına dahil edildi ve Nodal yorumunda39 sinyal süresinin rolünü araştırmak, zebra balıklarının Nodal45'e yanıt verme yeteneğini neden kaybettiğini belirlemek ve BMP hedef genlerinin farklı BMP sinyal seviyelerine nasıl tepki verdiğini incelemek içinkullanıldı 38. Bu araçların gelecekteki çeşitli araştırmalarda faydalı olmaya devam etmesi muhtemeldir. Bununla birlikte, optogenetik sinyal aktivatörlerinin gücü aynı zamanda zayıflıklarıdır: ışığa duyarlı numuneler, yanlışlıkla ektopik sinyal aktivitesini önlemek için dikkatli bir şekilde tedavi edilmelidir. Oda ışığına veya güneş ışığına maruz kalmak bOpto-BMP/Nodal'ı etkinleştirebilir.
Bu protokol, erken zebra balığı embriyolarında mRNA kodlu LOV tabanlı BMP ve Nodal aktivatörlerin kullanılması için pratik öneriler sunar. Tek tip ışığa maruz kalmayı ve sıcaklığı kontrol etmek için bir ışık kutusu oluşturmak için bir stratejiyi detaylandırarak başlar (Şekil 2, Ek Dosya 1, Ek Dosya 2, Ek Dosya 3, Ek Dosya 4, Ek Dosya 5, Ek Dosya 6, Ek Dosya 7, Ek Dosya 8). Daha sonra, bir optogenetik sinyal aktivatörünün beklendiği gibi davranıp davranmadığını, yani yalnızca ışığa maruz kaldığında yol aktivitesini aktive edip etmediğini belirleyen iki temel kontrol deneyini açıklar (Şekil 3). İlk kontrol testi, ışığa maruz kalan ve maruz kalmayan embriyolarda döllenmeden bir gün sonra fenotiplerin incelenmesini içerir (Şekil 3A). mRNA enjekte edilen ışığa maruz kalan embriyolar, ancak maruz kalmayan embriyolar fenoskopi BMP veya Nodal aşırı ekspresyonu olmalıdır (Şekil 4A,B; Özellikle BMP fenotipleri bu zaman noktasında açıkça ayırt edilebilir46). Bu tahlil, hızlı bir aktivite okuması sağlar. İkinci kontrol tahlilinde, fenotiplerin spesifik olarak aşırı BMP veya Nodal sinyallemeden kaynaklanıp kaynaklanmadığını belirlemek ve sinyal seviyelerindeki değişikliği doğrudan gözlemlemek için, fosforile sinyal efektörlerini tespit etmek için immünofloresan boyama kullanılır (sırasıyla pSmad1/5/9 veya pSmad2/3) geç blastula / erken gastrulasyon evresi civarında 20 dakikalık bir ışığa maruz kaldıktan sonra, sinyal aktivitesi iyi tanımlandığında12, 16,17,47,48,49,50 (Şekil 3B ve Şekil 4C). (Hem bOpto-BMP38 hem de bOpto-Nodal39 için uzamsal olarak lokalize aktivasyon gösterilmiş olmasına rağmen, bu protokolün yalnızca tek tip ışığa maruz kalma ve sinyal aktivasyon stratejilerini tanımladığını unutmayın.) İdeal yerel deney koşullarını belirlemek için belirli araştırma sorularına bOpto-BMP/Nodal uygulamadan önce bu kontrol deneylerinin yapılması tavsiye edilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Building a light box &#38; Light exposure protocol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#8 x 1&#34; Hex Self-drilling Screw</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>99663A222</td>
			<td>1.4.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Optical Power and Energy Meter</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td>1.7 
			4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (142 liters)</td>
			<td>Boekel Scientific</td>
			<td>139400</td>
			<td>1.3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Panel Mount (1/4&#34; thick cast black acrylic)</td>
			<td>Custom part / Piedmont Plastics</td>
			<td>Incubator_panel</td>
			<td>1.4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large HSS Spiral Groove Step Drill Bit</td>
			<td>CO-Z</td>
			<td>SDB0001TA</td>
			<td>1.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED lens gasket, Incubator gasket; 1/32&#34; thick black silicone</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>5812T12</td>
			<td>1.4.3 
			1.4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED microplate illuminator</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>NA</td>
			<td>1.1 
			1.4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 10mm Cube Standoff</td>
			<td>Newark Eletronics</td>
			<td>005.60.533</td>
			<td>1.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3 x 10mm 316SS Flat Head Screw</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91801A156</td>
			<td>1.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M6 x 10mm 316SS Flat Head Screw</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>91801A305</td>
			<td>1.4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Memory card thermometer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>15-081-111</td>
			<td>1.9 
			3.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide Power Meter Sensor Head (150 mW)</td>
			<td>ThorLabs</td>
			<td>S170C</td>
			<td>1.7 
			4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red gel filter paper #E106</td>
			<td>Rosco / B&#38;H Foto &#38; Electronics</td>
			<td>110084014805-E106</td>
			<td>4.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Side Brackets (1/4&#34; thick cast black acrylic)</td>
			<td>Custom part / Piedmont Plastics</td>
			<td>Side_bracket</td>
			<td>1.4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Bracket (1/4&#34; thick cast black acrylic)</td>
			<td>Custom part / Piedmont Plastics</td>
			<td>Vertical_bracket</td>
			<td>1.4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weather stripping: Light duty EPDM foam, 1/2&#34; wd 1/4&#34; tk</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8694K12</td>
			<td>1.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generating mRNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZNA MicroElute Cycle Pure Kit</td>
			<td>Omega</td>
			<td>D6293-02</td>
			<td>2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJET Miniprep Kit (250 rxns)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td>2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsample incubator (Hybex)</td>
			<td>SciGene</td>
			<td>1057-30-0</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsample incubator 1.5 ml tube block (Hybex)</td>
			<td>SciGene</td>
			<td>1057-34-0</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI-HF restriction enzyme</td>
			<td>New England Biolabs (NEB)</td>
			<td>R3189L</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2-Opto-Alk3</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>207614</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2-Opto-Alk8</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>207615</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCS2-Opto-BMPR2a</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>207616</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit (250 rxns)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74106</td>
			<td>2.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injecting mRNA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose (UltraPure)</td>
			<td>Invitrogen / Thermo Fisher</td>
			<td>16500500</td>
			<td>3.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ml glass beakers</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB100250</td>
			<td>3.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well dishes (case of 50)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08 772 1B</td>
			<td>3.1.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-8A ball joint</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>B-8A</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Back pressure unit (microinjection rig component)</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation (ASI)</td>
			<td>BPU</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foot switch (microinjection rig component)</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation (ASI)</td>
			<td>FWS</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GJ-1 magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries (4 in, OD 1 mm, filament)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>3.1.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish bottoms (for dechorionating)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>08-748A</td>
			<td>3.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipettes (5 3/4&#34; with wide tip)</td>
			<td>Kimble-Chase</td>
			<td>63A53WT</td>
			<td>3.1.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection dish molds</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>tu1</td>
			<td>3.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP iron plate</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>IP</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-152 micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pipette holder kit (microinjection rig component)</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation (ASI)</td>
			<td>MIMPH-MPIP-Kit</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrometers</td>
			<td>Meiji Techno America</td>
			<td>MA285</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPPI-2 pressure injector (microinjection rig component)</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation (ASI)</td>
			<td>MPPI-3</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PUL-1000</td>
			<td>3.1.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100 mm x 15 mm, case of 500)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-757-100D</td>
			<td>3.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor (10 ml, green)</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F37898-0000</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11459643001</td>
			<td>3.3.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Squeeze bottles (500 ml)</td>
			<td>Nalgene / Thermo Scientific</td>
			<td>2402-0500</td>
			<td>3.3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic signaling activation in zebrafish embryos

Sinyal yolları, gelişim, rejenerasyon, homeostaz ve hastalık dahil olmak üzere temel biyolojik süreçleri düzenler. Sinyalleşmenin bu geniş kapsamlı bağlamlarda nasıl yorumlandığını anlamak için sinyallemeyi deneysel olarak manipüle etme yöntemleri gereklidir. Moleküler optogenetik araçlar, yüksek derecede uzay-zamansal kontrol ile sinyal yolu aktivitesinin tersine çevrilebilir, ayarlanabilir manipülasyonlarını sağlayabilir ve in vitro, ex vivo ve in vivo olarak uygulanmıştır. Bu araçlar, mavi ışık homojenleştirici ışık-oksijen-voltaj algılama (LOV) alanı gibi ışığa duyarlı protein alanlarını, sinyalleme üzerinde ışığa bağlı deneysel kontrol sağlamak için sinyal efektörleri ile birleştirir. Bu protokol, optik olarak erişilebilir erken zebra balığı embriyosunda LOV tabanlı kemik morfogenetik proteini (BMP) ve Nodal sinyal aktivatörleri bOpto-BMP ve bOpto-Nodal'ın kullanımı için pratik kılavuzlar sağlar. İki kontrol deneyini açıklar: Uygun deney koşullarını belirlemek için hızlı bir fenotip testi ve sinyallemeyi doğrudan değerlendirmek için bir immünofloresan testi. Birlikte, bu kontrol deneyleri, erken zebra balığı embriyolarında optogenetik araçları kullanmak için bir boru hattı oluşturmaya yardımcı olabilir. Bu stratejiler, sinyalleşmenin gelişim, sağlık ve fizyolojideki rollerini araştırmak için güçlü bir platform sağlar.

Signaling pathways allow cells to respond to their environment and coordinate activities at tissue- and organism-wide scales. Signals crucial for embryonic development include the TGF-beta superfamily members&#160;bone morphogenetic protein (BMP)&#160;and Nodal1,2,3. During embryogenesis, the pathways regulated by these signals and others pattern the body plan by controlling gene expression and additional processes to ensure that diverse tissues and organs develop and interface properly. Pathologies, including birth defects and cancer, can occur when signaling or responses to signaling are perturbed4,5,6,7. Despite&#160;rigorous investigation into signaling, much more remains to be discovered about how levels and dynamics are decoded in a variety of contexts8,9,10,11, especially during development12,13,14,15,16,17,18,19.
To understand how signaling is decoded, an ideal experiment would be to manipulate signaling levels, timing, and/or dynamics-with a high degree of spatial and temporal control-and assess outcomes. For example, precise spatial signaling gradients are proposed to pattern developing tissues20,21. Altering signaling gradient spatial distributions would help test this hypothesis22. Additionally, the importance of signaling dynamics in generating diverse cellular responses is becoming clearer: The same signaling pathway can instruct cells to differentiate or proliferate depending on signaling frequency, for example9,23. Experimental paradigms in which signaling dynamics can be easily manipulated will be valuable to explore the relationship between dynamics and cell fate decisions8,12,13,14,15.
Historically, multiple methods have been used to manipulate signaling in developmental contexts, leading to fundamental discoveries1,2,3. Signaling can be blocked using pathway loss-of-function mutants, ectopic inhibitor expression, or antagonist drugs. Methods to activate signaling include agonist drugs, recombinant ligands, ectopic expression of ligands or constitutively active receptors, and pathway inhibitor loss-of-function mutants. These methods range along a continuum of experimental control. For example, mutants and ectopic expression may fall on the sledgehammer side of the continuum: With these approaches, dramatic, systemic changes in pathway activity may cause early death and preclude investigations at later stages, or over time may result in pleiotropic effects that are difficult to disentangle. Additionally, it is often challenging to independently manipulate one signaling feature at a time, such as level or duration. Toward the other end of the continuum, some methods offer more precise experimental control, such as microfluidic devices that expose samples to drugs or recombinant proteins with temporal and sometimes spatial control18,24,25, or genetic methods, including heat shock-inducible and tissue-specific promoters that can offer similar benefits16,26,27. However, these methods can be difficult to execute, may not be reversible, may have relatively slow kinetics or poor resolution, and may be unavailable in some model systems.
Molecular optogenetic approaches are a powerful addition to this toolkit. These approaches use proteins that respond to different light wavelengths to manipulate biological processes, including signaling8,12,13,14,15, and have been developed over decades for use in a variety of systems from cell culture to whole animals12,13,28. Compared to historical approaches, molecular optogenetics can often offer a higher degree of spatiotemporal control over biological processes: The controller in optogenetic systems is light, and control of light wavelength, intensity, duration, and exposure frequency is relatively straightforward. With sophisticated systems such as confocal and two-photon microscopes, spatial control in the subcellular range is possible29,30,31. Tools to optogenetically manipulate signaling have been developed and applied in several systems, including those described in Johnson et al.22, &#268;apek et al.32, Krishnamurthy et al.33, and Huang et al.34. For example, exploiting the spatial control afforded by optogenetics, this strategy was recently used to modify a signaling gradient in Drosophila embryos, demonstrating that fly embryogenesis is surprisingly robust to changes in this gradient22. The reversibility and fast on/off kinetics of optogenetic signaling activators have also made them attractive tools for investigating the decoding of signaling dynamics8,12,13,14,15,34,35,36.
The early zebrafish embryo is an in vivo system well-suited for optogenetic studies because it is externally fertilized, transparent, microscopy-friendly, and genetically tractable. Light exposure is easier to deliver to embryos that develop outside of the mother, light can penetrate and access their non-opaque tissues, live zebrafish embryos tolerate imaging well (in addition to being transparent), and existing genetic methods provide straightforward opportunities for knockdown and overexpression experiments, in addition to the development of useful transgenics37.
Recently, optogenetic tools were developed to activate BMP38 and Nodal39 signaling in zebrafish embryos with blue light exposure (Figure 1). We refer to these tools as bOpto-BMP and bOpto-Nodal (b for blue light-activated and Opto for optogenetic). bOpto-BMP/Nodal are based on similar pathway activation mechanisms. The binding of BMP or Nodal ligands to their respective receptor serine-threonine kinases drives receptor kinase domain interactions that lead to the phosphorylation of signaling effectors (Smad1/5/9 for BMP and Smad2/3 for Nodal). Phosphorylated signaling effectors then translocate to the nucleus and regulate target gene expression3 (Figure 1A,D). These receptor kinase interactions can be made light-responsive by coupling receptor kinases to light-responsive dimerizing proteins: With light exposure, these chimeric proteins should dimerize, causing the receptor kinase domains to interact and activate signaling (Figure 1B,C,E,F). Importantly, in contrast to endogenous receptors, bOpto-BMP/Nodal do not contain extracellular ligand-binding domains, ensuring ligand-independent activity (Figure 1C,F). This optogenetic activation strategy was first achieved with receptor tyrosine kinases40,41,42 and then applied to receptor serine-threonine kinases.
bOpto-BMP/Nodal use the blue light-responsive (~450 nm) homodimerizing light-oxygen-voltage sensing (LOV) domain from the algae Vaucheria fridiga AUREO1 protein (VfLOV)43,44. These constructs consist of a membrane-targeting myristoylation motif followed by either BMP or Nodal receptor kinase domains, fused to a LOV domain (Figure 1B,E). Blue light exposure should cause LOV homodimerization, resulting in receptor kinase domain interactions that lead to respective Smad phosphorylation and pathway activation (Figure 1C,F). For bOpto-BMP, a combination of constructs with the type I receptor kinase domains from Acvr1l (also known as Alk8) and BMPR1aa (also known as Alk3) and the type II receptor kinase domain from BMPR2a was found to optimally activate signaling38 (Addgene #207614, #207615, and #207616). For bOpto-Nodal, a combination of constructs with the type I receptor kinase domain from Acvr1ba and the type II receptor kinase domain from Acvr2ba is used39.
bOpto-BMP/Nodal have been introduced into early zebrafish embryos by injecting mRNA at the one-cell stage, and used to investigate the role of signaling duration in Nodal interpretation39, to determine why zebrafish lose the ability to respond to Nodal45, and to examine how BMP target genes respond to different BMP signaling levels38. It is likely that these tools will continue to be useful in a diverse range of future investigations. However, the strength of optogenetic signaling activators is also their weakness: light-sensitive samples must be treated with care to avoid inadvertent ectopic signaling activity. Exposure to room light or sunlight can activate bOpto-BMP/Nodal.
This protocol provides practical suggestions for using mRNA-encoded LOV-based BMP and Nodal activators in early zebrafish embryos. It begins by detailing one strategy to build a light box to control uniform light exposure and temperature (Figure 2, Supplementary File 1, Supplementary File 2, Supplementary File 3, Supplementary File 4, Supplementary File 5, Supplementary File 6, Supplementary File 7, Supplementary File 8). It then describes two key control experiments that determine whether an optogenetic signaling activator is behaving as expected-i.e., activating pathway activity only when exposed to light (Figure 3). The first control assay involves examining phenotypes at one day post-fertilization in light-exposed and unexposed embryos (Figure 3A). mRNA-injected light-exposed embryos, but not unexposed embryos, should phenocopy BMP or Nodal overexpression (Figure 4A,B; BMP phenotypes in particular are clearly distinguishable at this time point46). This assay provides a fast activity readout. In the second control assay, to determine whether phenotypes are caused specifically by excess BMP or Nodal signaling and to directly observe the change in signaling levels, immunofluorescence staining is used to detect phosphorylated signaling effectors (pSmad1/5/9 or pSmad2/3, respectively) after a 20 min light exposure around late blastula / early gastrulation stage, when signaling activity has been well described12,16,17,47,48,49,50 (Figure 3B and Figure 4C). (Note that, although spatially localized activation has been demonstrated for both bOpto-BMP38 and bOpto-Nodal39, this protocol only describes uniform light exposure and signaling activation strategies.) It is advisable to execute these control experiments prior to applying bOpto-BMP/Nodal to specific research questions in order to determine ideal local experimental conditions.

Yazar Spotlight: Hücre Kaderi Kararlarını Çözmek için Zebra Balığı Embriyolarında Sinyalizasyonu Manipüle Etmek 

Zebra Balığı Embriyolarında Optogenetik Sinyal Aktivasyonu

To establish the embryo's body plan during development cells are thought to decode signaling intensities dynamics and combinations. We are using optogenetics to manipulate these signaling features in zebrafish embryos. This approach will help us understand how embryonic cells decode signaling to make some of the earliest sulfate decisions The optogenetic approaches discussed here use light as a remote control to activate BMP or nodal signaling rapidly and reversibly.Because light exposure is easy to direct, these approaches can offer improved experimental control over signaling. Our protocol introduces using these light sensitive tools in zebrafish embryos. With this improved temporal and spatial control, it should now be possible to perform precise signaling modifications during zebrafish developments.We expect this to deepen our understanding of how cells decode signaling to make faint decisions, which will help reveal how the embryonic body plan develops.

Burada açıklanan iki kontrol deneyinin amacı, bOpto-BMP/Nodal'ın, beklendiği gibi, ışık yokluğunda sinyalleşmeyi etkilemeden mavi ışığa maruz kalmaya yanıt olarak ilgili yollarını aktive edip etmediğini belirlemektir. İlgilendiğiniz araştırma sorularına bOpto-BMP/Nodal uygulamadan önce laboratuvarınızda uygun deneysel iş akışını oluşturmak için bu denetimleri kullanın.
Fenotipleme testi sadece 2 gün içinde tamamlanabilir ve sinyal aktivitesi ve fototoksisite için yararlı bir gösterge sağlar (Şekil 3A). Enjekte edilen, mavi ışığa maruz kalan embriyolar, aşırı BMP sinyalini fenoskopi ile fleoskopi yapmalıdır (ventralizasyon46; Şekil 4A, sol panel) veya Nodal sinyalleme (ekstra mezendoderm 1,3,47,57,58,59,60 ile ilgili gelişimsel kusurlar (Şekil 4A, sağ panel)). Enjekte edilirse, ışığa maruz kalan embriyolar afenotiktir, mRNA'nın kalitesini test edin ve daha fazla enjekte etmeyi düşünün ve parlak ışığa sürekli maruz kalmayı sağlamak için ışığa maruz kalma stratejisini iki kez kontrol edin (45 W /m2 ışınımlı ~ 450 nm ışık, sinyali güçlü bir şekilde etkinleştirmelidir). Buna karşılık, enjekte edilmiş, maruz kalmamış embriyolar, enjekte edilmemiş kardeşlerle aynı görünmelidir. Enjekte edilirse, maruz kalmayan embriyolar fenotipler sergiler, enjekte edilen mRNA miktarını azaltır ve maruz kalmayan embriyoların ışığa maruz kalmaktan korunmasını sağlamak için deney kurulumunu yeniden değerlendirir. Şekil 4B'de gösterilen veriler, uygun mRNA miktarları ve maruz kalma koşulları ile tipik fenotipleme deneylerinden elde edilen sonuçları göstermektedir: enjekte edilen, ışığa maruz kalan embriyolarda güçlü sinyal aktivitesi belirgindir ve enjekte edilmiş, maruz kalmamış embriyoların sadece küçük bir kısmı fenotipler sergiler.
Fenotipleme testi ayrıca fototoksisiteyi değerlendirmek için bir fırsat sağlar. Fototoksisite ihmal edilebilir düzeydeyse, enjekte edilmemiş, ışığa maruz kalan embriyolar, enjekte edilmemiş, maruz kalmamış embriyolara benzer şekilde vahşi tip görünmelidir. Enjekte edilmemiş, ışığa maruz kalan embriyolarda kusurlar varsa, ancak enjekte edilmemiş, maruz kalmamış embriyolarda yoksa, ışık ışınımını azaltmayı düşünün. 45 W/m2'lik bir ışınım, belirgin fototoksisite olmadan sinyalleşmeyi sağlam bir şekilde etkinleştirir. Şekil 4B'de gösterilen veriler, enjekte edilmemiş, ışığa maruz kalmış ve enjekte edilmemiş, maruz kalmamış embriyolar arasında ihmal edilebilir fototoksisiteyi gösteren hiçbir fark göstermemektedir.
İmmünofloresan deneyleri, fenotipleme testine (2 gün) kıyasla daha fazla zaman ve çaba (~ 1 hafta) gerektirse de, immünofloresan boyama, sinyal yolu aktivitesinin doğrudan okunmasını sağlar ve brüt morfoloji tarafından yansıtılmayabilecek ince sinyal değişikliklerini ortaya çıkarabilir. İmmünofloresan, bOpto-Nodal'a verilen yanıtları değerlendirmek için özellikle önemlidir, çünkü aşırı Nodal sinyali, aşırı BMP sinyalininkarakteristik özelliği olan spesifik ventralizasyon fenotiplerinin aksine, genellikle embriyoların 1 dpf tarafından parçalanmasına neden olur - ki bu birçok nedene sahip olabilir 46 (Şekil 4A). Enjekte edilen, mavi ışığa maruz kalan embriyolar, enjekte edilmemiş, ışığa maruz kalan embriyolara kıyasla Smad1/5/9 veya Smad2/3 fosforilasyonunda homojen bir artış göstermelidir. Seviyeler artırılmazsa veya yalnızca zayıf bir şekilde artarsa, mRNA'nın kalitesini test edin ve daha fazla enjekte etmeyi düşünün ve ışığa maruz kalma stratejisini iki kez kontrol edin. 45 W/m2 yaklaşık %40 epiboli ışınımına sahip mavi ışığa 20 dakikalık bir maruz kalma, sinyalleşmeyi güçlü bir şekilde etkinleştirmelidir. pSmad boyaması homojen değilse, mRNA'yı hücrenin merkezine (yumurta sarısı yerine) enjekte etmeyi deneyin, bu da daha düzgün mRNA dağılımına neden olabilir.
Enjekte edilmiş, maruz kalmamış embriyolar, enjekte edilmemiş embriyolarla karşılaştırılabilir pSmad seviyelerine sahip olmalıdır. Anekdot olarak, bOpto-Nodal ile bOpto-BMP'den daha sızdıran Smad fosforilasyonu gözlemledik. Enjekte edilen, maruz kalmayan embriyolarda pSmad seviyeleri artarsa, enjekte edilen mRNA miktarını azaltın. Ek olarak, 1) maruz kalmamış embriyoların yanlışlıkla ışığa maruz kalmadığından ve 2) fiksasyon sırasında ışığa maruz kalmanın minimum düzeyde olduğundan emin olmak için deney kurulumunu yeniden değerlendirin. Sabitleme adımı sırasında, ışık kutusundan çıkarılması ile formaldehite daldırma arasında 45 saniyeden fazla geçmemesine izin vermek çok önemlidir. Ek olarak, bu adım sırasında panjurları kapatarak, beyaz ışık kaynaklarını kapatarak, kırmızı ışıklar kullanarak veya beyaz ışık kaynaklarını mavi ışığı engelleyen jel filtre kağıdı ile kaplayarak oda ışığına ve güneş ışığına maruz kalmayı en aza indirin (Malzeme Tablosu).
Şekil 4C'deki veriler, uygun mRNA miktarları ve ışığa maruz kalma koşulları ile tipik immünofloresan boyama deneylerinden elde edilen sonuçları göstermektedir: pSmad seviyeleri, enjekte edilmemiş ve maruz kalmamış embriyolarda benzerken, enjekte edilmiş, ışığa maruz kalan embriyolar daha yüksek seviyelerde Smad fosforilasyonu sergiler.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65733/65733fig01.jpg"> Şekil 1: bOpto-BMP ve -Nodal sinyal aktivasyon stratejisi . (A) Endojen BMP sinyal yolu, BMP ligand bağlanması ile aktive edilir, bu da bir tip I / II reseptör kompleksinin oluşumuna, Smad1 / 5/9'un fosforilasyonuna ve BMP hedef genlerinin ekspresyonuna yol açar. Tip I reseptörleri BMPR1aa ve Acvr1l, sırasıyla Alk3 ve Alk8 olarak da bilinir. BMPR2a, tip II bir reseptördür. (B) bOpto-BMP yapıları38. BMPR1aa ve Acvr1l'den varsayılan kinaz alanları LOV ile kaynaştırılır; BMPR2a-LOV füzyonu, varsayılan kinaz alanını ve reseptör C-terminal alanını (CTD) içerir. Tüm füzyonlar, bir miristoilasyon motifi (Myr) ile membran hedeflidir. Etki alanları, glisin-serin (GS) bağlayıcıları ile ayrılır. Yapılar CTD'de bir HA epitop etiketi ile etiketlenir. Üç yapının bu kombinasyonunun BMP sinyalini en iyi şekilde aktive ettiği bulundu. (C) bOpto-BMP aracılı BMP sinyal aktivasyonu. Mavi ışığa maruz kaldığında, karmaşık oluşumu ve sinyal aktivasyonunu tetiklediği düşünülen LOV alanları dimerize olur. (D) Endojen Nodal sinyal yolu, Nodal ligand bağlanması ile aktive edilir, bu da bir tip I / II reseptör kompleksinin oluşumuna, Smad2 / 3'ün fosforilasyonuna ve Nodal hedef genlerin ekspresyonuna yol açar. Tip I reseptörü Acvr1ba ve tip II reseptörü Acvr2ba, sırasıyla Acvr1b ve Acvr2b olarak da bilinir. (E) bOpto-Nodal yapıları39. Acvr1ba ve Acvr2ba'dan varsayılan kinaz alanları LOV ile kaynaştırılır. Tüm füzyonlar, bir miristoilasyon motifi (Myr) ile membran hedeflidir. Etki alanları GS bağlayıcıları ile ayrılır. Yapılar CTD'de bir HA epitop etiketi ile etiketlenir. (F) bOpto-Nodal aracılı Nodal sinyal aktivasyonu. Mavi ışığa maruz kaldığında, karmaşık oluşumu ve sinyal aktivasyonunu tetiklediği düşünülen LOV alanları dimerize olur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/65733fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65733/65733fig02.jpg"> Şekil 2: Optogenetik deneyler için sıcaklık kontrollü ışık kutusu . (A) Bir LED mikro plaka aydınlatıcı, özel yapım bir LED tutucu kullanılarak bir inkübatörün üstüne monte edilir. İlk raftaki 6 oyuklu bir plakadaki zebra balığı embriyoları, inkübatörün tepesine açılan bir delikten ışığa maruz bırakılır. Alt raf, alüminyum folyo ile sarılmış 6 oyuklu bir plakada ikinci bir maruz kalmamış kontrol embriyosu seti tutar. İnkübatör kapısı, oda ışığına veya güneş ışığına yanlışlıkla maruz kalmayı önlemek için hava sıyırma ile kaplanmıştır. (B) Bir kademeli matkap kullanarak inkübatörde bir delik oluşturma prosedürünün detayı. Burada kullanılan inkübatör modeli, ikinci, daha büyük bir delik açılmasını gerektiren bir iç panele sahiptir (Malzeme Tablosu). (C) Üç dalga boylu bir aydınlatma sistemi için tasarlanmış özel LED tutucunun detayı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/65733fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65733/65733fig03.jpg"> Şekil 3: bOpto-BMP/Nodal deney iş akışı. BOpto-BMP / Nodal aktivitesini test etmek için fenotip testi ve pSmad immünofloresan boyama. Embriyolara tek hücreli aşamada mRNA enjekte edilir ve döllenmeden en geç 1,5 saat sonra (hpf) bir ışık kutusuna aktarılır. (A) Fenotip tahlili. Enjekte edilen embriyolar ve enjekte edilmeyen kardeşler karanlıkta yetiştirilir veya 1.5 hpf'den başlayarak döllenmeden 1 gün sonrasına (dpf) kadar tek tip mavi ışığa maruz bırakılır. Optogenetik sinyal aktivitesi, aşırı yol aktivitesi ile tutarlı fenotipler için embriyoların puanlanmasıyla değerlendirilebilir. (B) pSmad immünofloresan boyama. Enjekte edilen embriyolar ve enjekte edilmeyen kardeşler karanlıkta% 40 epiboliye (~ 6 hpf) kadar yetiştirilir. Enjekte edilen embriyoların yarısı ve enjekte edilmeyen embriyoların yarısı daha sonra 20 dakika boyunca tek tip mavi ışığa maruz bırakılır. Maruz kaldıktan sonra, tüm embriyolar sabitlenir ve pSmad için immünofloresan boyamaya tabi tutulur. Yüksek pSmad1/5/9 veya pSmad2/3 seviyeleri, sırasıyla BMP veya Nodal sinyalizasyonunun optogenetik aktivasyonunu yansıtır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/65733fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65733/65733fig04.jpg"> Şekil 4: Zebra balığı embriyolarında ışıkla aktive olan sinyal tepkilerinin değerlendirilmesi. Zebra balığı embriyoları, bOpto-BMP/Nodal kodlayan mRNA ile tek hücre aşamasında enjekte edildi. (A) Embriyolar ya karanlıkta yetiştirildi ya da döllenmeden 1.5 saat sonra (hpf) başlayarak tek tip mavi ışığa maruz bırakıldı. Fenotipler döllenmeden 1 gün sonra (dpf) skorlandı. Temsili fenotipler gösterilmiştir. Aşırı BMP sinyali ventralizasyona (sol panel) yol açarken, aşırı Nodal sinyal ekstra mezendoderm (sağ panel) ile ilişkili gelişimsel kusurlara neden olur. Ölçek çubuğu = 500 μm. (B) Fenotip ölçümü. Enjekte edilen embriyolar ve enjekte edilmeyen kardeşler, 1.5 hpf'den (siyah ampul) başlayarak karanlıkta yetiştirildi. Enjekte edilen embriyoların yarısı ve enjekte edilmeyen embriyoların yarısı tek tip mavi ışığa (mavi ampul) maruz bırakıldı. (C) Enjekte edilen embriyolar ve enjekte edilmeyen kardeşler, 1.5 hpf'den (siyah ampul) başlayarak karanlıkta yetiştirildi. % 40 epibolide (~ 6 hpf), enjekte edilen embriyoların yarısı ve enjekte edilmeyen embriyoların yarısı tek tip mavi ışığa (mavi ampul) maruz bırakıldı. 20 dakika sonra, tüm embriyolar sabitlendi ve fosforile Smad1/5/9 veya Smad2/3 için immünofloresan boyamaya tabi tutuldu. Daha yüksek pSmad yoğunlukları, sırasıyla artmış BMP / Nodal sinyalini gösterir. Ölçek çubuğu = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/65733fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 1: Işık kutusu tam montajı. Tam ışık kutusu düzeneğinin 3D görünümünü gösteren 3D PDF dosyası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_1_Light_box_full_assembly_2023-08-15.PDF" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 2: Işık kutusu patladı görünümü. Patlatılmış ışık kutusu düzeneğinin 3D görünümünü gösteren 3D PDF dosyası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_2_Light_box_exploded_view_2023-08-15.PDF" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 3: Büyük ışık contası. CAD çizim dosyası (. DWG formatı) bir lazer kesici kullanarak LED tutucu için büyük ışık contasını imal etmek için. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_3_Large_light_gasket_2023-08-15.DWG" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 4: Küçük ışık contası. CAD çizim dosyası (. DWG formatı) bir lazer kesici kullanarak LED tutucu için küçük ışık contasını imal etmek için. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_4_Small_light_gasket_2023-08-15.DWG" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 5: Akrilik platform tabanı. CAD çizim dosyası (. DWG formatı) bir lazer kesici kullanarak LED tutucu akrilik platform tabanını imal etmek için. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_5_Acrylic_platform_base_2023-08-15.DWG" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 6: Akrilik platform dikey. CAD çizim dosyası (. DWG formatı) bir lazer kesici kullanarak LED tutucu akrilik platformu dikey olarak imal etmek için. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_6_Acrylic_platform_vertical_2023-08-15.DWG" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 7: Akrilik destek solda. CAD çizim dosyası (. DWG formatı) bir lazer kesici kullanarak LED tutucu akrilik sol desteğini imal etmek için. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_7_Acrylic_support_left_2023-08-15.DWG" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 8: Akrilik destek hakkı. CAD çizim dosyası (. DWG formatı) bir lazer kesici kullanarak LED tutucu akrilik sağ desteğini imal etmek için. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65733/Supp_File_8_Acrylic_support_right_2023-08-15.DWG" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Manipulating Signaling in Zebrafish Embryos to Decode Cell Fate Decisions at JoVE.com

Sinyal yollarının optogenetik manipülasyonu, gelişim, rejenerasyon, homeostaz ve hastalıkta sinyalleşmenin nasıl çözüldüğünü araştırmak için güçlü bir strateji olabilir. Bu protokol, erken zebra balığı embriyosunda ışık-oksijen-voltaj algılama alanı tabanlı Nodal ve kemik morfojenik protein (BMP) sinyal aktivatörlerinin kullanılması için pratik yönergeler sağlar.

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally ...

Embriyonun vücut planını oluşturmak için, gelişim sırasında, hücrelerin sinyal yoğunluklarını, dinamiklerini ve kombinasyonlarını çözdüğü düşünülmektedir. Zebra balığı embriyolarında bu sinyal özelliklerini manipüle etmek için optogenetik kullanıyoruz. Bu yaklaşım, embriyonik hücrelerin en erken sülfat kararlarından bazılarını vermek için sinyalleri nasıl çözdüğünü anlamamıza yardımcı olacaktır Burada tartışılan optogenetik yaklaşımlar, BMP'yi veya düğüm sinyalini hızlı ve geri dönüşümlü olarak etkinleştirmek için ışığı uzaktan kumanda olarak kullanır.Işığa maruz kalmanın yönlendirilmesi kolay olduğundan, bu yaklaşımlar sinyalizasyon üzerinde gelişmiş deneysel kontrol sunabilir. Protokolümüz, zebra balığı embriyolarında bu ışığa duyarlı araçların kullanılmasını tanıtmaktadır. Bu geliştirilmiş zamansal ve mekansal kontrol ile, zebra balığı gelişmeleri sırasında hassas sinyal modifikasyonları yapmak artık mümkün olmalıdır.Bunun, embriyonik vücut planının nasıl geliştiğini ortaya çıkarmaya yardımcı olacak zayıf kararlar vermek için hücrelerin sinyallerini nasıl çözdüğüne dair anlayışımızı derinleştirmesini bekliyoruz.

optogenetic-signaling-activation-in-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos

1.5K Görüntüleme.  NIH. Embriyonun vücut planını oluşturmak için, gelişim sırasında, hücrelerin sinyal yoğunluklarını, dinamiklerini ve kombinasyonlarını çözdüğü düşünülmektedir. Zebra balığı embriyolarında bu sinyal özelliklerini manipüle etmek için optogenetik kullanıyoruz. Bu yaklaşım, embriyonik hücrelerin en erken sülfat kararlarından bazılarını vermek için sinyalleri nasıl çözdüğünü anlamamıza yardımcı olacaktır Burada tartışılan optogenetik yaklaşımlar, ...

Video: Yazar Spotlight: Hücre Kaderi Kararlarını Çözmek için Zebra Balığı Embriyolarında Sinyalizasyonu Manipüle Etmek 

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally manipulate signaling are required to understand how signaling is interpreted in these wide-ranging contexts. Molecular optogenetic&#160;tools can provide reversible, tunable manipulations of signaling pathway activity with a high degree of spatiotemporal control and have been applied in vitro, ex vivo, and in vivo. These tools couple light-responsive protein domains, such as the blue light homodimerizing light-oxygen-voltage sensing (LOV) domain, with signaling effectors to confer light-dependent experimental control over signaling. This protocol provides practical guidelines for using the LOV-based bone morphogenetic protein (BMP) and Nodal signaling activators bOpto-BMP and bOpto-Nodal in the optically accessible early zebrafish embryo. It describes two control experiments: A quick phenotype assay to determine appropriate experimental conditions, and an immunofluorescence assay to directly assess signaling. Together, these control experiments can help establish a pipeline for using optogenetic tools in early zebrafish embryos. These strategies provide a powerful platform to investigate the roles of signaling in development, health, and physiology.

Optogenetic manipulation of signaling pathways can be a powerful strategy to investigate how signaling is decoded in development, regeneration, homeostasis, and disease. This protocol provides practical guidelines for using light-oxygen-voltage sensing domain-based Nodal and bone morphogenic protein (BMP) signaling activators in the early zebrafish embryo.

Gelişim Biyolojisi

Injecting bOpto-BMP&#47;Nodal Constructs into Zebrafish Embryos 

Injecting bOpto-BMP/Nodal Constructs into Zebrafish Embryos   

To begin, use an incubator and an LED Microplate Illuminator to create a light box for controlling light exposure and temperature. Then, position a six well plate on the upper shelf of the incubator, and check whether the light beam evenly encompasses it. Use a sheet of paper to visualize the distribution of light coverage.Use a light meter to measure irradiance and spatial uniformity. At least one day before injections, make injection dishes and agarose-coated six well plates. Rinse an injection dish mold with embryo medium, and place gently onto molt and agarose.Once the agarose has solidified, delicately use the tab to remove the mold. Next, prepare flamed glass pipettes for immunofluorescence experiments on dechlorinated embryos. Place the end of a glass pipette into a bun and burner flame, and rotate continuously until the edges become smooth.Prepare an injection mix using the mRNAs shown here. For the phenotyping assay, introduce the needle through the corion directly into the center of the cell at the one cell stage, and inject one nanoliter of the injection mix. If conducting an immunofluorescence assay, target the center of the cell of coated embryos at the one cell stage.For both assays, prepare enough embryos for the unexposed non-injected, unexposed injected, exposed non-injected, and exposed injected embryos. Select at least 30 embryos per condition. For the immunofluorescence assay, prepare an additional dish containing non-injected embryos as a proxy to assess the progression of developmental stages.After injection, incubate the embryos in Petri dishes at 28 degrees Celsius.

Zebra Balığı Embriyolarına bOpto-BMP/Nodal Yapıların Enjekte Edilmesi 

Light Exposure Experiment to Activate BMP or Nodal Signaling in Zebrafish

To begin, incubate the injected zebrafish embryos at 28 degrees Celsius. Around 1.5 HPF at the four to 16 cell stage, remove unfertilized and unhealthy embryos. For the phenotyping assay, wrap the unexposed control plate with noninjected and injected embryos in aluminum foil.Position the foil covered plate on the lower shelf, and the exposed plate on the upper shelf of the 28 degrees Celsius light box. After confirming that the dish cover is in place, activate the blue light, and shut the light box door to prevent unintended room light exposure. For the immunofluorescence assay around 1.5 HPF, individually wrap the exposed and unexposed dishes in aluminum foil while keeping the proxy dish unwrapped.Put all the dishes in the 28 degrees Celsius light box without activating the LED. Close the light box door to prevent inadvertent exposure to room light. At approximately five HPF, use a dissecting scope to evaluate the developmental stage of the proxy embryos.Also remove the wrapped dishes to ensure uniform temperature exposure across all dishes. Once the proxy embryos reach 40%epiboly, uncover the exposed dish and place it on the upper shelf of the light box. Keep the unexposed dish covered on the lower shelf.Immediately activate the blue light, close the door, and set a timer for 20 minutes. To prepare for fixation, eliminate as much room light as possible. Just before fixation, take tubes containing 4%formaldehyde from four degrees Celsius and position them beside the light box.After 20 minutes, open the door of the light box and remove the dish that wasn't exposed to light. Use a flamed glass pipette tip to remove the light sensitive embryos from the dish. Then to immerse the embryos in 4%formaldehyde, submerge the flamed glass pipette tip in the formaldehyde, and allow the embryos to sink into the liquid.Store fixed embryos at four degrees Celsius overnight.

Zebra Balıklarında BMP veya Düğüm Sinyalini Etkinleştirmek için Işığa Maruz Kalma Deneyi

Evaluation of bOpto-BMP&#47;Nodal Expressing Embryos After the Light Exposure Experiment

Evaluation of bOpto-BMP/Nodal Expressing Embryos After the Light Exposure Experiment  

For the phenotyping assay, perform the light exposure experiment on bOpto-BMP bOpto-Nodal expressing zebrafish embryos, and remove them from the light box at one day post-fertilization between 24 to 32 HPF. Using a dissecting scope, evaluate phenotypes and establish a scoring rubric. Assess embryos while they remain within the chorion for convenience.Utilize a pipette to probe to reposition embryos for viewing from different angles. For the immunofluorescence assay, after incubating embryos in 4%formaldehyde at four degrees Celsius overnight, remove the formaldehyde and rinse them three to five times with PBST. Discard the PBST and add 100%methanol.Seal the tubes and gently invert them to mix residual PBST and methanol. After washing the embryos two more times with methanol, store them at minus 20 degrees Celsius for at least two hours up to several years. Using a microscope equipped for optical sectioning, capture images of immunostained embryos.Immunofluorescent staining experiments with appropriate mRNA amounts and light exposure conditions showed that the pSmad levels were similar and non-injected in unexposed embryos, whereas injected light exposed embryos exhibited higher levels of Smad phosphorylation.