İnsan Embriyonik Kök Hücre Kaynaklı Retina Pigment Epitel Hücre Dissosiyasyonu ve Optimal Kriyoprezervasyon Aşaması Tayini

Lütfen tüm çevirilerin yapay zeka tarafından oluşturulduğunu unutmayın. İngilizce sürüm için buraya tıklayın.

56 Views

•

03:06 min

•

November 3rd, 2023

DOI :

10.3791/200823-v

November 3rd, 2023

•

Xinyue Bai*¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Ting Zhang*¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xinyue Zhu¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xianyu Huang¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Haiyun Liu¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xiaoyan Ding⁸, Mei Jiang¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xiaodong Sun¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷

¹Department of Ophthalmology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, ²National Clinical Research Center for Eye Diseases, ³Shanghai Clinical Research Center for Eye Diseases, ⁴Shanghai Key Clinical Specialty, ⁵Shanghai Key Laboratory of Ocular Fundus Diseases, ⁶Shanghai Engineering Center for Visual Science and Photomedicine, ⁷Shanghai Engineering Center for Precise Diagnosis and Treatment of Eye Diseases, ⁸Stem Cell Core Facility, CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Chinese Academy of Sciences

* Bu yazarlar eşit katkıda bulunmuştur

Transkript

Başlamak için, çözülmüş soğuk bazal membran matrisinin bir şişesini 12 mililitre DM EM F12 ile seyreltin. Süspansiyonu iyice karıştırın. 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna bir kapak fişi ekleyin.

Ardından, her bir kuyucuğa 250 mikrolitre seyreltik matris çözeltisi pipetleyin. Kültürlenmiş hESC'den türetilmiş retina pigmenti epitel hücre plakalarının kültür ortamını atın. Plakaları kuyucuk başına bir mililitre önceden ısıtılmış PBS ile iki kez yıkayın.

Daha sonra, kültür plakalarının kuyucuklarına 0.5 mililitre hücre ayrışma reaktifi ekleyin ve sindirimi başlatmak için 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçka işleminden sonra, sindirimin sona erdiğini doğrulamak için hücreleri mikroskop altında gözlemleyin. Şimdi bir mililitrelik bir pipetle, hücre süspansiyonunu 10 kez yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin.

Süspansiyonu seyreltmek için önceden ısıtılmış kültür ortamı ekleyin. Ardından, oda sıcaklığında üç dakika boyunca 250 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı santrifüj tüpünden boşaltın.

Ardından, hücre peletini iki mililitre kültür ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri 10 ila 15 kez karıştırmak için bir pipet kullanın. Hücre süspansiyonunu 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden süzün.

Ardından, retina pigment epitel hücrelerini sayın. Kaplamadan önce kaplama solüsyonunu aspire edin. Daha sonra, her bir oyuğa bir mililitre kültür ortamı ekleyin ve hücreleri örtü fişleri üzerine tohumlayın.

EDU birleştirme ve boyamadan sonra, bir floresan mikroskobu ile beş rastgele alanın görüntülerini yakalayın. EDU pozitif hücrelerin yüzdesini hesaplayın. Ardından, bir büyüme eğrisi oluşturmak için karşılık gelen oran zaman eğrilerini çizin.

Son olarak, her hücre hattı için üstel fazdan donma penceresini belirleyin. Retina pigment epitel hücreleri başlangıçta karakteristik altıgen morfolojilerini kaybetti, ancak daha sonra büyümenin üstel fazında yeniden kazandı. Hücreler bir hafta daha kültürlendiğinde, hücre çoğalması azaldı.

EDU proliferasyon testi, P2 gün beş hücrelerinin daha yüksek bir proliferasyon oranı sergilediğini, P2 gün 11 hücrelerinin ise yavaşlama fazına girdiğini doğruladı.

Daha Fazla Video Keşfet

Human Embryonic Stem Cells

Retinal Pigment Epithelial Cells

Microscopy Observation

Cell Suspension

Centrifugation

Cell Counting