Murine Bone Marrow Staining for the Characterization of Myeloid Leukemia Microenvironment

Başlamak için, izole edilmiş murin kemik iliği süspansiyonunu kemik spikülü süspansiyonu ile karıştırın. Saymak için 10 mikrolitre hücre süspansiyonunu bir hemositometreye pipetleyin. Hücre süspansiyonunu 300 G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin.

Ardından peleti 100 mikrolitre FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Hücreleri manyetik tükenme için antikorlarla boyamak için FC bloğu, CD45 APC ve TER-119 APC ekleyin. Ardından hücre süspansiyonunu FACS tamponu ile yıkayın.

Kalan karışımı santrifüjledikten sonra, peleti 100 mikrolitre FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Manyetik tükenme için hücre süspansiyonunu mikro boncuklarla boyamak için fare IgG ve anti-APC mikro boncukları ekleyin. Karışımı buz üzerinde 20 dakika inkübe edin.

LD sütununu iki mililitre MACS tamponu ile yıkayın. Tampondaki hücreleri yeniden süspanse edin, ardından 35 mikrometre hücre süzgeci kapağına sahip beş mililitrelik bir test tüpünden süzün. Ardından, LD sütununu manyetik ayırıcı standına yerleştirin ve ayrıştırılan malzemeyi toplamak için sütunun altına beş mililitrelik bir test tüpü yerleştirin.

Hücre süspansiyonunu LD kolonuna pipetleyin ve negatif fraksiyon akışını test tüpünde toplayın. Kolonu bir mililitre MACS tamponu ile iki kez yıkayın ve eluent malzemeyi aynı tüpte toplayın. LD sütununu beş mililitrelik yeni bir test tüpünün üzerine yerleştirin.

Bir pipetle, kolona üç mililitre tampon dağıtın, ardından pozitif etiketli hücreleri beş mililitrelik bir test tüpüne boşaltın. Hem pozitif hem de negatif fraksiyonları santrifüjleyin, ardından peleti 100 mikrolitre FACS tamponunda yeniden süspanse edin. CD45 TER-119 negatif fraksiyonunu boyamak için, altıncı hücrelere her 10 için her antikorun bir mikrolitresini ekleyin.

Süspansiyonu 20 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Ardından santrifüjlemeden önce süspansiyonu iki mililitre FACS tamponu ile yıkayın. Pelete bir mililitre tampon ekleyin ve canlı hücre boyama için propidyum iyodür pipetleyin.

Son olarak, hücreleri çok renkli bir akış sitometresinde analiz etmeden önce numuneyi 35 mikrometrelik bir hücre süzgecinden beş mililitrelik bir test tüpüne süzün. Arteriolar endotel hücreleri, akut miyeloid lösemi mikroçevresinde önemli ölçüde genişledi ve sinüzoidal endotel popülasyonlarında eşlik eden bir kayıp oldu. Sekiz haftalıkken mezenkimal stromal hücrelerde küçük bir genişleme görüldü.