URMC Flow Sitometri Çekirdeğine teşekkür ederiz. Bu çalışma, Amerikan Hematoloji Derneği Akademik Ödülü, Lösemi Araştırma Vakfı ödülü ve NIH hibeleri R01DK133131 ve JB'ye verilen R01CA266617 tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan deneyleri, Rochester Üniversitesi Hayvan Kaynakları Komitesi tarafından onaylanan protokollere uygun olarak gerçekleştirildi. Fareler, Rochester Üniversitesi'ndeki hayvan bakım tesislerinde yetiştirildi ve bakımı yapıldı. Yüksek riskli MDS'yi modellemek için, ticari olarak temin edilebilen NHD13 fare modeli19 kullanılır. Bu modelde, kemik iliği stromal hücreleri, hastalık başlamadan önce 8 haftalıkken dişi NHD13 farelerinde analiz edilir. De novo AML, daha önce açıklandığı gibiüretilir 6,11,20. MLL-AF9 ve NRas gibi AML'yi indüklemek için kullanılan onkogenler, akış sitometrisi kullanılarak lösemik olmayan GFP-kemik iliği popülasyonlarının analizine izin veren GFP veya YFP ile etiketlenir. Kısaca, 10 haftalık dişi C57BL / 6J farelere murin GFP / YFP + AML hücreleri nakledilir ve kemik iliği nakilden 2 hafta sonra toplanır. Bu çalışmada dişi fareler gösteri amaçlı kullanılırken, bu protokol hem erkek hem de dişi farelerle gerçekleştirilebilir. Ayrıca bir femur veya tüm uzun kemikler kullanılarak da gerçekleştirilebilir.
1. Kemik iliği hasadı
NOT: Hayvan diseksiyon protokolü ile ilgili ayrıntılar için lütfen Amend et al.26'ya bakın.
<ol><li>Harcı ve tokmağı %70 etanol ile temizleyin, soğutulmuş FACS tamponu ile durulayın (Tablo 1) ve hasada başlamadan önce soğuması için buzun üzerine koyun. Ayrıca, oda sıcaklığına ulaşmasını sağlamak için MAC tamponunu (Tablo 1) tezgahın üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Kurumsal hayvan bakımını takip ederek hayvana ötenazi yapın ve kılavuz ve protokolleri kullanın.</li>
	<li>Tezgahta, kürkü ıslanana kadar fareye iyice %70 etanol püskürtün. Forseps ve kavisli makas kullanarak, karın üzerindeki cildi kaldırın ve farenin her iki tarafında, karından yanal olarak yaklaşık 0,5 mm uzunluğunda iki kesi yapın. Ardından, karından distalde 0,5 mm'lik bir kesi yapın. Farenin bacaklarındaki deriyi ve kürkü çıkarmak için aşağı çekin.</li>
	<li>Makası pelvise dik olarak yerleştirin, forseps ile femuru yukarı çekerken aşağı doğru bastırın. Femur başı pelvisten ayrılmalıdır. Patellofemoral eklemde femur ve tibiayı ayırın. Kemikleri buz üzerinde 6 oyuklu bir plakada FACS tamponuna yerleştirin.</li>
	<li>Laboratuvar sınıfı doku kullanarak kemiklerden doku çıkarın ve temizlenmiş kemikleri buz üzerinde taze FACS tamponu ile 6 oyuklu yeni bir plakaya yerleştirin.</li>
	<li>Tüm kemikleri 2-5 mL FACS tamponu ile harca yerleştirin, böylece tüm kemikler tampona daldırılır (tampon hacmini kaç kemik işlediğinize göre ayarlayın). Kemik iliği dokusu serbest kalana kadar havaneli kullanarak kemikleri dairesel hareketlerle ezin ve öğütün.</li>
	<li>3 mL'lik bir şırınga kullanarak, sıvıyı harçtan yukarı çekip aşağı akıtarak kemik iliğini homojenize edin.</li>
	<li>3 mL'lik bir şırınga kullanarak, sıvıyı harçtan yukarı çekin ve 70 μm'lik bir hücre süzgecinden buz üzerinde 50 mL'lik bir tüpe süzün. Filtredeki kemik/doku parçalarını FACS tamponu ile tekrar harca durulayın ve ikinci kez homojenize etmek ve süzmek için adım 1.7'ye dönün. Bu kemik iliği fraksiyonunu oluşturur.</li>
	<li>Kalan kemik parçalarını (spikülleri) FACS tamponu ile harcın içine geri durulayın ve maksimum hücre verimini sağlamak için FACS tamponu kullanarak 15 mL'lik bir tüpe yıkayın. Bu kemik spikülleri fraksiyonudur.</li>
</ol>2. Kemik iliğinin sindirimi
<ol><li>Kemik iliğini 300 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın ve atın.</li>
	<li>Kemik iliğini 2 mL kemik iliği sindirim karışımında (Tablo 1) tekrar süspanse edin ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Bir döndürücü üzerinde 37 °C'de 45 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Enzimatik sindirimi durdurmak için 10 mL FACS tamponu ekleyin. Karışımı 70 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik yeni bir tüpe süzün.</li>
	<li>Karışımı 400 x g'da 4 °C'de 7 dakika boyunca peletleyin.</li>
	<li>Kemik iliği peletini 1 mL RBC lizis tamponunda yeniden süspanse edin (bkz. Buz üzerinde 4 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Lizizi durdurmak için 10 mL FACS tamponu ekleyin. Karışımı 70 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik yeni bir tüpe süzün.</li>
	<li>Karışımı 300 x g'da 4 °C'de 5 dakika boyunca peletleyin. Süpernatanı çıkarın ve peleti 100 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin.</li>
</ol>3. Kemik spiküllerinin sindirimi
<ol><li>Kemik spiküllerini adım 1.9'dan itibaren girdap haline getirin ve yerleşmelerine izin verin. Süpernatanı boşaltın ve kemiği altta tutun.</li>
	<li>Kemik spiküllerini 1 mL kemik spikülü sindirim karışımında tekrar süspanse edin (Tablo 1).</li>
	<li>Tüpleri 37 °C'de 60 dakika boyunca bir tüp döndürücüye yerleştirin.</li>
	<li>Enzimatik sindirimi durdurmak için 10 mL FACS tamponu ekleyin. Karışımı 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirerek RBC ile parçalanmış ve sindirilmiş kemik iliği içeren 50 mL'lik tüpe süzün.</li>
</ol>4. Boyama
<ol><li>Kemik spiküllerini ve kemik iliği hücresi süspansiyonunu nazikçe karıştırın.</li>
	<li>Yayınlanmış protokoller27'de açıklandığı gibi,% 0.4 Tripan mavisi bazlı boyama kullanarak bir hemositometredeki canlı hücre sayısını saymak için 10 μL hücre süspansiyonu kullanın. Hücre süspansiyonundan lekesiz bir kontrol için 50.000 hücre toplayın.</li>
	<li>Kalan hücreleri 300 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve 100 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin. NOT: İdeal seyreltmeyi belirlemek için antikorlar titre edilebilir. Antikor seçimi (epitoplar ve florokromlar) özelleştirilebilir.</li>
	<li>Manyetik tükenme için antikorlarla boyama için, FC Blok (25 x 106 hücre başına 1 μL), CD45-APC (25 x 106 hücre başına 10 μL) ve Ter119-APC (25 x 106 hücre başına 4 μL) ekleyin (bkz.</li>
	<li>20 dakika buz üzerinde inkübe edin. FACS tamponu ile yıkayın, APC lekeli kontrol için 50.000 hücreyi (~ 50 μL) çıkarın, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin ve 100 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Manyetik tükenme için hücre süspansiyonunun mikro boncuklarla boyanması için, mIgG (25 x 106 hücre başına 8 μL) ve Anti-APC mikro boncuklar (25 x 106 hücre başına 20 μL) ekleyin (bkz.</li>
	<li>20 dakika buz üzerinde inkübe edin. 10 mL FACS tamponu ile yıkayın, 300 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.</li>
</ol>5. Manyetik ayırma ile numunenin tükenmesi
NOT: Bu adım, üreticinin talimatlarına göre piyasada bulunan bir manuel manyetik ayırıcı kullanılarak gerçekleştirilir. Bu adım, otomatik bir ayırıcı ile de gerçekleştirilebilir (bkz.
<ol><li>LD kolonunu 2 mL MAC tamponu ile yıkayarak hazırlayın (Tablo 1). Atık suyu atın ve toplama tüpünü değiştirin.</li>
	<li>MAC tamponunda 1 x 108 hücreye kadar yeniden süspanse edin ve bunları 35 μm hücre süzgeci kapağına sahip 5 mL'lik bir test tüpünden süzün.</li>
	<li>LD sütununu manyetik ayırıcı standına yerleştirin. Elüatı toplamak için kolonun altına 5 mL'lik bir test tüpü yerleştirin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu hazırlanan LD sütununa ekleyin. Negatif fraksiyonun toplama tüpüne akmasına izin verin. Kolonu 1 mL MAC tamponu ile iki kez yıkayın ve elüatı aynı tüpte toplayın. Bu, aşağıdaki adım 5.6'da kullanılan negatif kesirdir.</li>
	<li>LD kolonunu manyetik ayırıcı standından çıkarın ve yeni bir 5 mL test tüpüne yerleştirin. Kolon pistonunu kullanarak pozitif olarak etiketlenmiş hücreleri temizlemek için kolona 3 mL tampon dağıtmak için bir pipet kullanın.</li>
	<li>Negatif ve pozitif fraksiyonları 300 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Bunları 100 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin.</li>
	<li>% 0.4 Tripan mavisi ile negatif ve pozitif fraksiyonların 10 μL'sini sayın. Aşağıdaki osteo-analiz/endotel paneli boyama hacimleri bu hücre sayısına dayanacaktır.</li>
	<li>Akış sitometrisi geçit kontrolleri için pozitif fraksiyondan 50.000 canlı hücre kullanın.</li>
</ol>6. Osteo-analiz / endotelyal panel boyası
NOT: Kompanzasyon, tüm uygun boyama ve geçit kontrolleri dahil olmak üzere standart akış sitometri protokolleri izlenerek yapılmalıdır.
<ol><li>CD45 / Ter119 negatif fraksiyonunun boyanması için (1 x 106 hücre başına her antikorun 1 μL'si), CD31-PE-Cy7, Sca-1-BV421, CD51-PE ve CD140a-PE-Cy5 ekleyin (bkz.</li>
	<li>20 dakika buz üzerinde inkübe edin. 2 mL FACS tamponu ile yıkayın, ardından 300 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Canlı/ölü boyama için 1 mL FACS tamponu ve 1:1000 PI seyreltmesi ekleyin, ardından numuneyi 35 μm hücre süzgeci kapağına sahip 5 mL'lik bir test tüpünden süzün.</li>
	<li>Hücreleri çok renkli bir akış sitometresinde analiz edin.</li>
</ol>

Miyeloid Neoplazmlarda Kemik İliği Mikroçevresinin İzolasyonu ve Karakterizasyonu

<ol>
	<li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells.">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li><li>Boulais, P. E., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+sense+of+hematopoietic+stem+cell+niches.">Making sense of hematopoietic stem cell niches.</a> Blood. 125 (17), 2621-2629 (2015).</li><li>Pinho, S., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+cell+activity+and+interactions+with+the+niche.">Haematopoietic stem cell activity and interactions with the niche.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (5), 303-320 (2019).</li><li>Kfoury, Y., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cell+contributions+to+the+stem+cell+niche.">Mesenchymal cell contributions to the stem cell niche.</a> Cell Stem Cell. 16 (3), 239-253 (2015).</li><li>Itkin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+bone+marrow+blood+vessels+differentially+regulate+haematopoiesis.">Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis.</a> Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).</li><li>Bajaj, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cd98-mediated+adhesive+signaling+enables+the+establishment+and+propagation+of+acute+myelogenous+leukemia.">Cd98-mediated adhesive signaling enables the establishment and propagation of acute myelogenous leukemia.</a> Cancer Cell. 30 (5), 792-805 (2016).</li><li>Konopleva, M. Y., Jordan, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukemia+stem+cells+and+microenvironment:+Biology+and+therapeutic+targeting.">Leukemia stem cells and microenvironment: Biology and therapeutic targeting.</a> J Clin Oncol. 29 (5), 591-599 (2011).</li><li>Kim, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+notch+activation+in+microenvironment+leads+to+myeloproliferative+disease.">Defective notch activation in microenvironment leads to myeloproliferative disease.</a> Blood. 112 (12), 4628-4638 (2008).</li><li>Walkley, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microenvironment-induced+myeloproliferative+syndrome+caused+by+retinoic+acid+receptor+gamma+deficiency.">A microenvironment-induced myeloproliferative syndrome caused by retinoic acid receptor gamma deficiency.</a> Cell. 129 (6), 1097-1110 (2007).</li><li>Kode, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukaemogenesis+induced+by+an+activating+&#946;-catenin+mutation+in+osteoblasts.">Leukaemogenesis induced by an activating &#946;-catenin mutation in osteoblasts.</a> Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).</li><li>Hanoun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myelogenous+leukemia-induced+sympathetic+neuropathy+promotes+malignancy+in+an+altered+hematopoietic+stem+cell+niche.">Acute myelogenous leukemia-induced sympathetic neuropathy promotes malignancy in an altered hematopoietic stem cell niche.</a> Cell Stem Cell. 15 (3), 365-375 (2014).</li><li>Raaijmakers, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+progenitor+dysfunction+induces+myelodysplasia+and+secondary+leukaemia.">Bone progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia.</a> Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).</li><li>Frisch, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+inhibition+of+osteoblastic+cells+in+an+in+vivo+mouse+model+of+myeloid+leukemia.">Functional inhibition of osteoblastic cells in an in vivo mouse model of myeloid leukemia.</a> Blood. 119 (2), 540-550 (2012).</li><li>Bajaj, J., Diaz, E., Reya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+cancer+initiation+and+progression.">Stem cells in cancer initiation and progression.</a> J Cell Biol. 219 (1), e201911053 (2020).</li><li>Sekeres, M. A., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+treatment+of+myelodysplastic+syndromes:+A+review.">Diagnosis and treatment of myelodysplastic syndromes: A review.</a> Jama. 328 (9), 872-880 (2022).</li><li>Zeisig, B. B., Kulasekararaj, A. G., Mufti, G. J., So, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snapshot:+Acute+myeloid+leukemia.">Snapshot: Acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 22 (5), 698-698.e1 (2012).</li><li>Krivtsov, A. V., Armstrong, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mll+translocations,+histone+modifications+and+leukaemia+stem-cell+development.">Mll translocations, histone modifications and leukaemia stem-cell development.</a> Nat Rev Cancer. 7 (11), 823-833 (2007).</li><li>Yoshimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+alterations+in+rna+splicing+and+epigenetic+regulation+drive+leukaemogenesis.">Coordinated alterations in rna splicing and epigenetic regulation drive leukaemogenesis.</a> Nature. 574 (7777), 273-277 (2019).</li><li>Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nup98-hoxd13+transgenic+mice+develop+a+highly+penetrant,+severe+myelodysplastic+syndrome+that+progresses+to+acute+leukemia.">Nup98-hoxd13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia.</a> Blood. 106 (1), 287-295 (2005).</li><li>Kwon, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetraspanin+3+is+required+for+the+development+and+propagation+of+acute+myelogenous+leukemia.">Tetraspanin 3 is required for the development and propagation of acute myelogenous leukemia.</a> Cell Stem Cell. 17 (2), 152-164 (2015).</li><li>Bajaj, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+genome-wide+crispr+screen+identifies+the+rna-binding+protein+staufen2+as+a+key+regulator+of+myeloid+leukemia.">An in vivo genome-wide crispr screen identifies the rna-binding protein staufen2 as a key regulator of myeloid leukemia.</a> Nat Cancer. 1 (4), 410-422 (2020).</li><li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+mll-af9.">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by mll-af9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li><li>Baryawno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+taxonomy+of+the+bone+marrow+stroma+in+homeostasis+and+leukemia.">A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia.</a> Cell. 177 (7), 1915-1932.e16 (2019).</li><li>Tikhonova, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+microenvironment+at+single-cell+resolution.">The bone marrow microenvironment at single-cell resolution.</a> Nature. 569 (7755), 222-228 (2019).</li><li>Balderman, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+the+bone+marrow+microenvironment+improves+outcome+in+a+murine+model+of+myelodysplastic+syndrome.">Targeting of the bone marrow microenvironment improves outcome in a murine model of myelodysplastic syndrome.</a> Blood. 127 (5), 616-625 (2016).</li><li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation.">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> JoVE. 110, e53936 (2016).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Using+a+Hemacytometer+to+Count+Cells.">Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells.</a> , (2023).</li><li>Passaro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+vascular+permeability+in+the+bone+marrow+microenvironment+contributes+to+acute+myeloid+leukemia+progression+and+drug+response.">Increased vascular permeability in the bone marrow microenvironment contributes to acute myeloid leukemia progression and drug response.</a> Blood. 128 (22), 2662 (2016).</li><li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+factor+is+selectively+secreted+by+arterial+endothelial+cells+in+bone+marrow.">Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow.</a> Nat Commun. 9 (1), 2449 (2018).</li><li>Baccin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+single-cell+and+spatial+transcriptomics+reveal+the+molecular,+cellular+and+spatial+bone+marrow+niche+organization.">Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization.</a> Nat Cell Biol. 22 (1), 38-48 (2020).</li><li>Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+digestion+strategies+on+characteristics+and+differentiation+potential+of+human+dental+pulp+stem+cells.">Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells.</a> Arch Oral Biol. 93, 74-79 (2018).</li><li>Abreu-Velez, A. M., Howard, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+IV+in+normal+skin+and+in+pathological+processes.">Collagen IV in normal skin and in pathological processes.</a> N Am J Med Sci. 4 (1), 1-8 (2012).</li></ol>

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmedi.

Murin lösemi modelleri, agresif miyeloid lösemi ilerlemesini destekleyen hücre içsel ve niş odaklı sinyalleri tanımlamak için yaygın olarak kullanılmıştır 6,19,21. Burada, MDS ve AML'nin murin modellerinde kemik iliği mikroçevresinin hücresel bileşimini tanımlamak için kapsamlı bir akış sitometrisi tabanlı protokol sunulmaktadır.
Deneysel numunelerden akış sitometrik verileri...

Kemik iliği mikroçevresi hematopoietik hücrelerden, hematopoietik olmayan stromal hücrelerden ve hücre dışı matriks 1,2'den oluşur. Bu mikro çevre, hematopoietik kök hücrenin kendi kendini yenilemesini teşvik edebilir, soy farklılaşmasını düzenleyebilir ve kemik dokusuna yapısal ve mekanik desteksağlayabilir 1,2,3,4,5. Stromal niş, osteosoy hücrelerini, fibroblastları, sinir hücrelerini ve endotel hücrelerini6 içerirken, hematopoietik niş, lenfoid ve miyeloid popülasyonlardanoluşur 1,2,3. Normal HSC'leri desteklemenin yanı sıra, kemik iliği mikroçevresi de MDS ve AML 7,8,9,10,11 gibi hematopoietik kök hücre bozukluklarının gelişiminde rol oynayabilir. Osteolineage hücrelerindeki mutasyonların MDS, AML ve diğer miyeloproliferatif neoplazmların gelişimini desteklediği gösterilmiştir 10,12,13,14.
Miyelodisplastik sendromlar, hematopoetik kök hücrelerdeki mutasyonlardan kaynaklanan bir grup pre-lösemik bozukluktur. MDS sıklıkla HSC farklılaşmasında bir blok ve sıklıkla kemik iliği yetmezliğine yol açabilen displastik hücrelerin üretimi ile ilişkilidir. MDS, Amerika Birleşik Devletleri'nde en sık teşhis edilen miyeloid neoplazmdır ve 3 yıllık sağkalım oranı %35-45 arasındadır15. MDS genellikle akut miyeloid lösemiye dönüşüm riski ile ilişkilidir. MDS'den türetilen AML çoğu tedaviye dirençli olduğundan ve nüks etme olasılığı yüksek olduğundan, bu ölümcül bir komplikasyon olabilir. Hematopoietik kök ve progenitörlerdeki translokasyonlar veya mutasyonlar nedeniyle ortaya çıkan AML, genellikle standart kemoterapiye dirençlidir16,17. MDS ve AML esas olarak yaşlıların hastalıkları olduğundan, çoğunluğu 60 yaşın üzerinde teşhis edildiğinden, çoğu hasta küratif kemik iliği nakli için uygun değildir. Bu nedenle, hastalığın ilerlemesinin yeni düzenleyicilerini tanımlamak için önemli bir ihtiyaç vardır. Kemik iliği mikroçevresi malign hücreler için destek sağlayabildiğinden14, kemik iliği nişindeki değişikliklerin hastalık ilerlemesi ile tanımlanması, tümör nişinin yeniden şekillenmesini inhibe etmeyi amaçlayan yeni terapötiklerin tanımlanmasına yol açabilir. Bu nedenle, hastalığın ilerlemesinin yeni düzenleyicilerini tanımlamak için önemli bir ihtiyaç vardır. Bu amaçla, malign hücrelere destek sağlayabilecek kemik iliği stromal hücre popülasyonlarındaki değişiklikleri tanımlamak ve karakterize etmek çok önemlidir.
AML ve MDS'nin birkaç fare modeli oluşturulmuştur ve hastalığın başlaması ve ilerlemesi sırasında kemik iliği mikro ortamındaki değişiklikleri incelemek için kullanılabilir 6,1,19,20,21,22. Burada, retroviral olarak indüklenen AML 6,20'nin murin modellerini ve ayrıca ticari olarak temin edilebilen Nup98-HoxD13 (NHD13) yüksek riskli MDS'den AML'ye dönüşüm19 modelini kullanarak kemik iliği stromal hücre popülasyonlarındaki değişiklikleri tanımlamak için protokoller açıklanmaktadır. De novo AML hücreleri ile nakledilen fareler 20-30 gün içinde hastalığa yenik düşer6. NHD13 fareleri, 15-20 hafta civarında sitopeni ve kemik iliği displazisi geliştirir, bu da sonunda AML'ye dönüşür ve farelerin yaklaşık% 75'i 32 hafta civarında hastalığa yenik düşer. Fare modeli kemik iliği mikroçevre popülasyonlarını analiz etmek için kemikler hasat edilir, kemik iliği ve kemik spikülleri enzimatik sindirim kullanılarak sindirilir ve hücreler daha sonra manyetik sıralama ile CD45-/Ter119-hematopoietik olmayan popülasyonlar için zenginleştirilir. Benzer analizler daha önce 11,13,22,23,24,25 olarak tanımlanmış olsa da, genellikle kemik iliğine veya kemiğe odaklanırlar ve analizlerinde her iki kaynaktan gelen hücreleri içermezler. Bu popülasyonların birleşik karakterizasyonu, gen ekspresyon analizleri ile birlikte, hücresel hematopoietik mikroçevrenin hastalığın başlaması ve ilerlemesi için nasıl destek sağladığının kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını sağlayabilir (Şekil 1). Aşağıda açıklanan protokol retroviral olarak indüklenen AML modeline ve genetik bir MDS modeline odaklanırken, bu stratejiler ilgilenilen herhangi bir murin modelinin kemik iliği nişindeki değişiklikleri incelemek için kolayca uyarlanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL pipette Tips&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>24-165RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>AVANT</td>
			<td>L211511-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L pipette Tips</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>24-140RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes</td>
			<td>Globe scientific</td>
			<td>1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Vacuum Filtration Flask</td>
			<td>NEST</td>
			<td>344021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10026-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Aspirating Pipette</td>
			<td>NEST</td>
			<td>325011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette Tips</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>24-150-RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes</td>
			<td>Globe scientific</td>
			<td>1780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes</td>
			<td>Globe scientific</td>
			<td>1740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube&#160; 12 x 75 mm style</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>NEST</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56616-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi&#160;</td>
			<td>130-090-855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmBH</td>
			<td>4425745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td>0.5 mg/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>66.000 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>404-5981</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J Mice</td>
			<td>Jackson Laboratory&#160;</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Dioxide Gas Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25-0311-82</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17-0451-82</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 70 &#181;m Nylon&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-63100-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>7415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Mini Centrifuge</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>6770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Stripettor Ultra Pipet Controller</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>117105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 10x</td>
			<td>gibco</td>
			<td>14200-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience 1x RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors - sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foundation B Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GeminiBio</td>
			<td>900-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson&#160;PIPETMAN L Pipette Starter Kits</td>
			<td>FisherScientific&#160;</td>
			<td>F167370G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) 10x</td>
			<td>gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-671-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>BINDER</td>
			<td>C150-UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>KIMTECH</td>
			<td>K222101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-425-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmBH</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSE Vortex Mixer</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>6775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRII/Fortessa/Symphony A1</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>647800L6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MULTI STAND&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmBH</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACsmix Tube Rotator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmBH</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mIgG</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>18765-10mg</td>
			<td>2 mg/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice</td>
			<td>Jackson Laboratory&#160;</td>
			<td>010505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>104106</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135920</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastipak 3 mL Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS&#160; Separator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmBH</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>75009521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17-5921-82</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying bone marrow microenvironmental populations in myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia

Kemik iliği mikroçevresi, hematopoietik kök hücreler (HSC'ler) için destek sağlayan mezenkimal stromal hücreler, endotel hücreleri, osteolineage hücreleri ve fibroblastlar gibi farklı hücre popülasyonlarından oluşur. Normal HSC'leri desteklemenin yanı sıra, kemik iliği mikroçevresi, miyelodisplastik sendromlar (MDS) ve akut miyeloid lösemi (AML) gibi hematopoietik kök hücre bozukluklarının gelişiminde de rol oynar. HSC'lerde MDS ile ilişkili mutasyonlar, özellikle yaşlılarda farklılaşmada bir bloğa ve ilerleyici kemik iliği yetmezliğine yol açar. MDS sıklıkla tedaviye dirençli AML'ye ilerleyebilir, bu hastalık hızlı bir şekilde olgunlaşmamış miyeloid patlamaların birikmesi ile karakterize bir hastalıktır. Bu miyeloid neoplazmları olan hastalarda kemik iliği mikroçevresinin değiştiği bilinmektedir. Burada, miyelodisplastik sendrom ve akut miyeloid löseminin murin modellerinden kemik iliği mikroçevresel hücrelerini izole etmek ve fenotipik olarak karakterize etmek için kapsamlı bir protokol açıklanmaktadır. Kemik iliği niş popülasyonlarındaki değişikliklerin izole edilmesi ve karakterize edilmesi, hastalığın başlaması ve ilerlemesindeki rollerinin belirlenmesine yardımcı olabilir ve kemik iliği stromal popülasyonlarında kanseri teşvik eden değişiklikleri hedefleyen yeni terapötiklerin geliştirilmesine yol açabilir.

The bone marrow microenvironment consists of hematopoietic cells, non-hematopoietic stromal cells, and the extracellular matrix1,2. This microenvironment can promote hematopoietic stem cell self-renewal, regulate lineage differentiation, and provide structural and mechanical support to the bone tissue1,2,3,4,5. The stromal niche includes osteolineage cells, fibroblasts, nerve cells, and endothelial cells6, while the hematopoietic niche consists of the lymphoid and myeloid populations1,2,3. In addition to supporting normal HSCs, the bone marrow microenvironment can also play a role in the development of hematopoietic stem cell disorders such as MDS and AML7,8,9,10,11. Mutations in osteolineage cells have been shown to promote the development of MDS, AML, and other myeloproliferative neoplasms10,12,13,14.
Myelodysplastic syndromes are a group of pre-leukemic disorders that arise from mutations in hematopoietic stem cells. MDS is frequently associated with a block in HSC differentiation and the production of dysplastic cells, which can often lead to bone marrow failure. MDS is the most commonly diagnosed myeloid neoplasm in the United States and is associated with a 3-year survival rate of 35%-45%15. MDS is often associated with a high risk of transformation to acute myeloid leukemia. This can be a fatal complication, as MDS-derived AML is resistant to most therapies and likely to relapse. AML that arises de novo due to translocations or mutations in hematopoietic stem and progenitors is also often resistant to standard chemotherapy16,17. Since MDS and AML are primarily diseases of the elderly, with the majority diagnosed over the age of 60 years, most patients are ineligible for curative bone marrow transplants. There is, thus, a significant need to identify novel regulators of disease progression. Since the bone marrow microenvironment can provide support for malignant cells14, defining changes in the bone marrow niche with disease progression may lead to the identification of novel therapeutics aimed at inhibiting tumor niche remodeling. There is, therefore, a significant need to identify novel regulators of disease progression. To this end, it is critical to identify and characterize changes in the bone marrow stromal cell populations that may provide support for the malignant cells.
Several murine models of AML and MDS have been generated and can be used to study changes in the bone marrow microenvironment during disease initiation and progression6,1,19,20,21,22. Here, protocols to identify changes in the bone marrow stromal cell populations using murine models of retrovirally induced AML6,20, as well as the commercially available Nup98-HoxD13 (NHD13) model of high-risk MDS to AML transformation19, are described. Mice transplanted with de novo AML cells succumb to the disease in 20-30 days6. The NHD13 mice develop cytopenias and bone marrow dysplasia around 15-20 weeks, which eventually transforms into AML, and nearly 75% of the mice succumb to the disease around 32 weeks. To analyze the murine model bone marrow microenvironment populations, bones are harvested, bone marrow and bone spicules are digested using enzymatic digestion, and the cells are then enriched for CD45-/Ter119- non-hematopoietic populations by magnetic sorting. While similar analyses have been previously described11,13,22,23,24,25, they often focus on either the bone marrow or the bone and do not incorporate cells from both sources in their analyses. The combined characterization of these populations, in conjunction with gene expression analyses, can provide a comprehensive understanding of how the cellular hematopoietic microenvironment provides support for disease initiation and progression (Figure 1). While the protocol described below focuses on retrovirally induced AML model and a genetic MDS model, these strategies can be easily adapted to study changes in the bone marrow niche of any murine model of interest.

Yazar Spotlight: Murin Hematolojik Malignitelerinde Kemik İliği Mikroçevresinin Analizi 

Miyelodisplastik Sendrom ve Akut Miyeloid Lösemide Kemik İliği Mikroçevresel Popülasyonlarının Belirlenmesi

Our research aims to explore how the bone marrow's changing environment influences tumor growth. We developed a flow cytometry protocol to analyze the non-immune cells in bone marrow and bone tissues, focusing on murine hematological malignancies. This method is adaptable for studying bone marrow in various murine models.Our study focuses on isolating and identifying alterations in bone marrow stromal populations during cancer progression. Understanding their impact on disease onset and advancement could pave the way for new treatments that target these cancer-facilitating changes in the bone marrow stromal cells. Our protocol uniquely combines mechanical and enzymatic digestions, magnetic depletions, and flow cytometry to delineate the bone marrow microenvironment cellular makeup.It stands out by employing magnetic separation and incorporating cells from both bone and marrow, offering a more comprehensive representation of this microenvironment.

Bu makale, MDS ve lösemi murin modellerinden endotelyal ve mezenkimal stromal hücreler gibi kemik iliği mikroçevre popülasyonlarını analiz etmek için akış sitometrisine dayalı bir yöntemi açıklamaktadır (Şekil 1). Şekil 2 , sindirilmiş ve CD45/Ter119 tükenmiş fraksiyondaki hücrelerin (P1) seçiminden başlayarak, ileri ve yan saçılma profili boyunca ilgilenilen popülasyonların tespiti için geçit stratejisini göstermektedir. Bir lösem...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Bone Marrow Microenvironment in Murine Hematological Malignancies at JoVE.com

Burada, miyelodisplastik sendromlar ve akut miyeloid löseminin murin modellerinden kemik iliği mikroçevre popülasyonlarını izole etmek ve karakterize etmek için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Bu teknik, endotelyal ve mezenkimal stromal hücreler dahil olmak üzere hematopoietik olmayan kemik iliği nişindeki değişiklikleri hastalık ilerlemesi ile tanımlar.

The bone marrow microenvironment consists of distinct cell populations, such as mesenchymal stromal cells, endothelial cells, osteolineage cells, and ...

Araştırmamız, kemik iliğinin değişen ortamının tümör büyümesini nasıl etkilediğini keşfetmeyi amaçlamaktadır. Kemik iliği ve kemik dokularındaki non-immün hücreleri analiz etmek için murin hematolojik malignitelerine odaklanan bir akım sitometri protokolü geliştirdik. Bu yöntem, çeşitli murin modellerinde kemik iliğini incelemek için uyarlanabilir.Çalışmamız, kanser progresyonu sırasında kemik iliği stromal popülasyonlarındaki değişiklikleri izole etmeye ve tanımlamaya odaklanmaktadır. Hastalığın başlangıcı ve ilerlemesi üzerindeki etkilerini anlamak, kemik iliği stromal hücrelerinde bu kanseri kolaylaştıran değişiklikleri hedefleyen yeni tedavilerin önünü açabilir. Protokolümüz, kemik iliği mikroçevre hücresel yapısını tanımlamak için mekanik ve enzimatik çürümeleri, manyetik tükenmeleri ve akış sitometrisini benzersiz bir şekilde birleştirir.Manyetik ayırma kullanarak ve hem kemik hem de ilikten hücreleri birleştirerek bu mikro ortamın daha kapsamlı bir temsilini sunarak öne çıkıyor.

identifying-bone-marrow-microenvironmental-populations

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Identifying Bone Marrow Microenvironmental Populations in Myelodysplastic Syndrome and Acute Myeloid Leukemia

798 Görüntüleme.  University of Rochester Medical Center. Araştırmamız, kemik iliğinin değişen ortamının tümör büyümesini nasıl etkilediğini keşfetmeyi amaçlamaktadır. Kemik iliği ve kemik dokularındaki non-immün hücreleri analiz etmek için murin hematolojik malignitelerine odaklanan bir akım sitometri protokolü geliştirdik. Bu yöntem, çeşitli murin modellerinde kemik iliğini incelemek için uyarlanabilir.Çalışmamız, kanser progresyonu sırasında kemik iliği stromal popülasyonlarındaki değişiklikleri izo...

Video: Yazar Spotlight: Murin Hematolojik Malignitelerinde Kemik İliği Mikroçevresinin Analizi 

The bone marrow microenvironment consists of distinct cell populations, such as mesenchymal stromal cells, endothelial cells, osteolineage cells, and fibroblasts, which provide support for hematopoietic stem cells (HSCs). In addition to supporting normal HSCs, the bone marrow microenvironment also plays a role in the development of hematopoietic stem cell disorders, such as myelodysplastic syndromes (MDS) and acute myeloid leukemia (AML). MDS-associated mutations in HSCs lead to a block in differentiation and progressive bone marrow failure, especially in the elderly. MDS can often progress to therapy-resistant AML, a disease characterized by a rapid accumulation of immature myeloid blasts. The bone marrow microenvironment is known to be altered in patients with these myeloid neoplasms. Here, a comprehensive protocol to isolate and phenotypically characterize bone marrow microenvironmental cells from murine models of myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia is described. Isolating and characterizing changes in the bone marrow niche populations can help determine their role in disease initiation and progression and may lead to the development of novel therapeutics targeting cancer-promoting alterations in the bone marrow stromal populations.

Here a detailed protocol to isolate and characterize bone marrow microenvironmental populations from murine models of myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia is presented. This technique identifies changes in the non-hematopoietic bone marrow niche, including the endothelial and mesenchymal stromal cells, with disease progression.

Kanser Araştırmaları

Murine Bone Marrow Harvest and Isolation for the Characterization of Myeloid Leukemia Microenvironment 

To begin, remove the tissue from the bones of the euthanized dissected mouse. Place the cleaned bones into a new six-well plate containing FACS buffer placed on ice. Transfer the bones into a mortar with two to five milliliters of FACS buffer.Grind the bones in a circular motion until the bone marrow is released. With a three milliliter syringe, pull up and flush down the bone marrow to homogenize it. Pull the homogenate into another syringe, then filter it through a 70 micrometer cell strainer into a 50 milliliter tube.Rinse the tissue chunks from their filter back into the mortar with FACS buffer before homogenizing a second time. Filter the rinsed tissue as before. Next, rinse the remaining bone spicules back into the mortar with FACS buffer.Then flush the pieces into a 15 milliliter tube to ensure maximum yield. To digest the bone marrow, first centrifuge it at 300 G for five minutes at four degrees Celsius. Resuspend the bone marrow pellet in two milliliters of digestion mixture.Transfer the mixture to a 15 milliliter tube. Then incubate it at 37 degrees Celsius for 45 minutes on a rotator. Now, add 10 milliliters of FACS buffer to stop the enzymatic digestion.Filter the mixture through a 70 micrometer cell strainer into a 50 milliliter tube. Centrifuge the suspension at 400 G for seven minutes at four degrees Celsius. Resuspend the pellet in one milliliter of RBC lysis buffer.Next, add 10 milliliters of FACS buffer to halt the lysis. Then filter the mixture as before into a 50 milliliter tube. Lastly, centrifuge the mixture at 300 G for five minutes at four degrees celsius.After discarding the supernatant, resuspend the pellet in 100 microliters of FACS buffer. For the digestion of bone spicules, first, vortex the bone spicules. Decant the supernatant and retain the bones at the bottom.Next, resuspend the spicules in one milliliter of the bone spicule digestion mixture. Incubate the tube on a rotator for 60 minutes at 37 degrees Celsius. Finally, stop the digestion with 10 milliliters of FACS buffer.Filter the mixture into the 50 milliliter tube containing RBC lysed and digested bone marrow.

Miyeloid Lösemi Mikroçevresinin Karakterizasyonu için Murin Kemik İliği Hasadı ve İzolasyonu 

Murine Bone Marrow Staining for the Characterization of Myeloid Leukemia Microenvironment

To begin, mix the isolated murine bone marrow suspension with the bone spicule suspension. Pipette 10 microliters of the cell suspension onto a hemocytometer for counting. Centrifuge the cell suspension at 300 G for five minutes at four degrees Celsius.Then resuspend the pellet in 100 microliters of FACS buffer. To stain the cells with antibodies for magnetic depletion, add FC block, CD45 APC, and TER-119 APC. Then wash the cell suspension with FACS buffer.After centrifuging the remaining mixture, resuspend the pellet in 100 microliters of FACS buffer. To stain the cell suspension with microbeads for magnetic depletion, add mouse IgG and anti-APC microbeads. Incubate the mixture on ice for 20 minutes.Wash the LD column with two milliliters of MACS buffer. Resuspend the cells in the buffer, then filter it through a five milliliter test tube with a 35 micrometer cell strainer cap. Next, set the LD column on the magnetic separator stand and place a five milliliter test tube under the column to collect the eluted material.Pipette the cell suspension into the LD column and collect the negative fraction flow through in the test tube. Wash the column two times with one milliliter of MACS buffer and collect the eluent material in the same tube. Place the LD column over a new five milliliter test tube.With a pipette, dispense three milliliters of buffer into the column, then flush out the positively labeled cells into a five milliliter test tube. Centrifuge both the positive and negative fractions, then resuspend the pellet in 100 microliters of FACS buffer. To stain the CD45 TER-119 negative fraction add one microliter of each antibody for every 10 to the sixth cells.Place the suspension on ice for 20 minutes. Then wash the suspension with two milliliters of FACS buffer before centrifuging. Add one milliliter of the buffer to the pellet and pipette propidium iodide for live cell staining.Finally, filter the sample through a 35 micrometer cell strainer into a five milliliter test tube before analyzing the cells on a multicolor flow cytometer. Arteriolar endothelial cells significantly expanded in the acute myeloid leukemia microenvironment with a concomitant loss in the sinusoidal endothelial populations. A small expansion in the mesenchymal stromal cells were seen at eight weeks of age.