Hepatocellular Carcinoma Tissue Dissociation for Organoid Culture

Doku ayrışmasına başlamak için, tedavi edilmeyen hastalardan bir ila iki santimetreküp hepatoselüler karsinom veya HTC dokusu toplayın. Daha sonra dokuyu doku koruma solüsyonuna yerleştirin ve işlenene kadar dört santigrat derecede tutun. Şimdi, ultra düşük ataşman yüzeyli hücre kültürü plakalarını 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir inkübatörde bir saat önceden ısıtın.

Bazal membran ekstraktını gece boyunca dört santigrat derecede çözdürün. Cerrahi makas kullanarak, tümör dokusunu laminer akış başlığı içindeki bir Petri kabı üzerinde küçük parçalara ayırın. Bu parçaları 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve beş ila 10 mililitre bazal ortam ekleyin.

Barotropik bir pipetle mümkün olduğunca fazla kanı yıkayın. Herhangi bir kan hücresi ve yüzen yağ pıhtıları da dahil olmak üzere süpernatantın bir kısmını çıkarmadan önce karışımın bir ila iki dakika çökmesine izin verin. Daha sonra, karışımı oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin.

Daha sonra süpernatanı dikkatlice çıkarın ve kesilmiş dokuya beş mililitre önceden ısıtılmış sindirim çözeltisi ekleyin. Optimum sindirim için tüpü 37 santigrat derecede bir rotora yerleştirin. 30 dakikalık ilk sindirimden sonra, küçük hücre kümelerini aramak için bir mikroskop kullanın.

Sindirimi durdurmak için, tüpe beş mililitre soğuk bazal ortam ekleyin. Ardından, 50 mililitrelik yeni bir tüpe elemek için 100 mikrometrelik bir hücre filtresi kullanın. Toplam 50 mililitre hacme ulaşmak için tüpü soğuk bazal ortamla doldurun.

Daha sonra, hücreleri sekiz santigrat derecede 10 dakika boyunca iki G'de santrifüjleyin. Tamamlandığında, süpernatan sıvıyı dikkatlice çıkarın. Organoid kaplama için hücre peletini elde etmek için peleti 50 mililitre soğuk bazal ortamda yeniden süspanse edin.