iMEF Besleyici Hücrelerin Hazırlanması ve İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücreler için Transdüksiyonun Yeniden Programlanması

1 Başlamak için, 6 oyuklu plakayı2 oyuk başına iki mililitre% 0.2 jelatin çözeltisi ile kaplayın. 3 Plakayı 37 santigrat derece 4 ve %5 karbondioksitte 30 dakika inkübe edin. 5 Daha sonra, iMEF'leri 10 mililitre 7 önceden ısıtılmış insan fibroblast ortamı, 8 içeren 15 mililitrelik bir tüpe 6 damla damla ekleyin ve tüpü hafifçe ters çevirerek karıştırın.

9 Hücre süspansiyonunu 309 G'de üç dakika santrifüjleyin. 10 Ve peleti 12 mililitre insan fibroblast ortamında 11 yeniden süspanse etmeden önce süpernatanı çıkarın. 12 Jelatin kaplı altı oyuklu plakanın her bir oyuğuna iki mililitre hücre süspansiyonu 13 yerleştirin.

14 Ve gece boyunca 37 santigrat derece 15 ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. 16 Ortamı lentivirüs ile enfekte olmuş 17 ve enfekte olmayan PDAC'den atın ve hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. 18 Daha sonra hücreleri ayırmak için 500 mikrolitre tripsin ekleyin.

19 Ve 37 santigrat derecede 20% 5 karbondioksit ve% 5 oksijen 21 ile 15 dakika inkübe edin. 22 Hücre süspansiyonunu 300 G'de beş dakika santrifüjleyin. 23 Ve peleti bir mililitre PDAC ortamında yeniden süspanse edin.

24 iMEF plakasını PDAC ortamıyla yıkayın. 25 Daha sonra, iMEF plakasının beş oyuğuna oyuk başına 50.000 lentivirüs ile enfekte PDAC hücresi 26 ekleyin ve daha önce gösterildiği gibi gece boyunca 27 inkübe edin. 28 Yeniden programlama ortamını hazırladıktan sonra, 29 100 mikrolitre temel fibroblast büyüme faktörü 30 ila 100 mililitre yeniden programlama ortamı ekleyin.

31 Ertesi gün, iMEF besleyicilerde büyüyen hücreleri önceden ısıtılmış yeniden programlama ortamı ile iki kez 32 yıkayın. 33 Daha sonra her kuyucuğa iki mililitre ortam ekleyin, 34 ve gece boyunca 37 santigrat derecede 35% 5 karbondioksit ve% 3 oksijen ile inkübe edin. 36 IPSC havuzunu beş kez geçtikten sonra, 37 ESC benzeri morfolojiyi koruyan sağlam kolonileri 38 gözlemleyin.

39 PDAC, BxPc3, 40 H6c7 ve insan fibroblastı 41, olgun bir ESC benzeri morfoloji oluşturmak için farklı yeniden programlama 42 günleri gösterdi. PDAC, 45 BxPc3, H6c7, 46 ve insan fibroblast hücrelerinin her birinden 44 adet klonal IPSC hattı kuruldu. 47 Kurulan tüm IPSC hatları, TRA-160 için pozitif 48 lekelendi ve pluripotentliğe yeniden programlandıklarını doğruladı.