A.S ve J.K, Cancer Research UK ve OHSU'ya finansman için teşekkür eder (CRUK-OHSU Proje Ödülü C65925/A26986). ve Tic. A.Ş., MRC kariyer geliştirme ödülü (MR/N024028/1) ile desteklenmektedir. A.A. Kral Abdülaziz Bilim ve Teknoloji Şehri'nden doktora bursu (Burs ref. 1078107040) ile finanse edilmektedir. J.K, MRF Yeni Araştırmacı Hibesi (GCNCR1042A) ve Knight CEDAR hibesi (68182-933-000, 68182-939-000) tarafından finanse edilmektedir. pSIN4-EF1a-O2S ve pSIN4-CMV-K2M yeniden programlama vektörünü sağladığı için Prof Keisuke Kaji'ye teşekkür ederiz. Açık erişim amacıyla, yazar, bu gönderimden kaynaklanan herhangi bir Yazar Kabul Edilen Makale sürümüne bir Creative Commons Atıf (CC BY) lisansı uygulamıştır.

PDAC ve Pankreas Hücrelerinin İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelere Yeniden Programlanması

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

Kanserin ilerlemesini incelemek için iPSC yeniden programlamasının kullanımını kolaylaştırmak için, pankreas kanseri hücrelerini yeniden programlamak için sağlam bir protokol oluşturulmuştur. Kanser hücrelerini pluripotentliğe yeniden programlamanın şimdiye kadar çok zor olduğu kanıtlanmıştır, çünkü sadece birkaç çalışma kanser hücrelerinden iPSC'leri başarıyla üretmiştir 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46 <sup clas...

Pankreatik duktal adenokarsinom (PDAK) en ölümcül malignitelerden biridir ve hastalığın asemptomatik olması nedeniyle erken tanı zor olmaya devam etmektedir. PDAC hastalarının çoğu, çok sınırlı tedavi seçeneklerinin mevcut olduğu ileri metastatik evrede teşhis edilir 1,2. Bunun başlıca nedeni, kan dolaşımına salınan proteinler olarak kolayca tespit edilebilenler gibi daha önceki aşamalar için güvenilir biyobelirteçlerin olmamasıdır.
PDAC, ilerlemesi sırasında çok erken yayılabilir ve PDAC pankreasta lokalize olduğunda erken kanser tespiti ile daha iyi bir prognoz ilişkilendirilmiştir3. Bununla birlikte, PDAC hastalarının onda birinden daha azına cerrahi rezeksiyona izin veren olumlu bir prognoz teşhisi konmaktadır. Bununla birlikte, rezektabl tümörleri olan birkaç kişi de 12 ay içinde tümör nüksüne eğilimlidir4.
Son elli yılda, cerrahi tekniklerde, hasta bakımında ve tedavi yöntemlerinde dikkate değer gelişmeler kaydedilmiştir 5,6. Bununla birlikte, cerrahi olarak rezeke edilen PDAC hastalarında 5 yıllık sağkalım oranı ancak %17'ye yükselmiştir. Bununla birlikte, bu, neredeyse hiç değişmeden kalan (%0,9) rezeke edilmemiş hastalardan daha iyidir4,7. Kemoterapi diğer tek alternatif PDAC tedavisidir. Yine de, PDAC hastalarının büyük çoğunluğu Gemsitabin 7,8 gibi kemoterapi ilaçlarına karşı güçlü direnç gösterdiğinden bu seçenek çok sınırlıdır. Erlotinib gibi diğer ilaçlar, çoğu Erlotinib direnci9 gösteren spesifik mutasyonlara sahip küçük bir grup PDAC hastası için mevcuttur. Çoğu PDAC hastasında kemoterapi ile ilişkili olumsuz yan etkiler, bu tedavinin bir başka dezavantajıdır10. Son zamanlarda, umut verici stratejiler, immün kontrol noktası inhibitörlerinin (ICI'ler) ve küçük moleküllü kinaz inhibitörlerinin (SMKI'ler) PDAC tedavisinde etkili olabileceğini göstermiştir, ancak bu hedefe yönelik tedavilere kalıcı yanıtlar hastaların azınlığı ile sınırlı kalmaktadır11,12. Genel olarak, PDAC'a özgü erken biyobelirteçlerin keşfi, erken tanı ve tedavi için yeni yollar açabilir.
PDAC, non-invaziv pankreas kanalı epitel proliferasyonlarından kaynaklanan pankreas intraepitelyal neoplazmlarından (PanIN) öncü lezyonlarındangelişir 13,14. PanIN oluşumu KRAS gibi onkogen mutasyonları ile başlatılırken, PDAC'a ilerleme için ek genetik ve epigenetik değişiklikler gereklidir. PanIN'in farklı aşamalardan invaziv PDAC'a ilerlemesinin yaklaşık 10 yıl sürdüğü öngörülmüştür 13,15,16,17. Bu zaman dilimi, erken PDAC tanısından yararlanmak için harika bir fırsat sağlar. Bu nedenle, PDAC ilerlemesini incelemek için tümör ksenogreft hayvan modelleri ve organoid kültürleri oluşturmak için kapsamlı araştırmalar yapılmıştır 18,19,20,21. Bu modeller, erken PanIN fazlarından geçiş olmasa da, PDAC'nin invaziv aşamalarını incelemek için çok yararlı olmuştur. Bu nedenle, erken tespit biyobelirteçlerinin keşfedilmesini sağlamak için PanIN aşamalarının erken ilerlemesini özetleyebilecek deneysel modeller geliştirmek önemlidir.
Dört transkripsiyon faktörü OCT4, SOX2, KLF4 ve c-MYC (OSKM) kullanılarak somatik hücrelerin indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC'ler) yeniden programlanması, hücresel plastisiteninkapsamını göstermiştir 22. Kanser hücresi plastisitesi iyi belgelenmiştir ve insan kanser hücrelerini iPSC'lere yeniden programlamak, hücreleri orijinal hücresel durumlarına sıfırlamak için başarıyla kullanılmış ve kanserin ilerlemesi sırasında biriken epigenetik hakaretlerin çoğunu ortadan kaldırmıştır 23,24,25,26,27,28,29. Bu nedenle, kanser hücresi kimliğini manipüle etmek için bu yeniden programlama stratejisini kullanma olasılığı, kanser tedavisinde büyük umut vaat etmiştir30,31. Aslında, PDAC'lerden türetilen iPSC'lerin farklılaşmasının, erken PanIN aşamaları32 boyunca PDAC ilerlemesini özetleyebileceğini daha önce göstermiştik. PDAC'ın erken-orta evrelerine özgü genleri ve yolakları tanımlayarak, erken PDAC tanısı için klinik olarak kullanılabilecek aday biyobelirteçler tanımlanmıştır32,33. Bununla birlikte, tek bir iPSC hattı kullanılarak keşfedilen biyobelirteçler, PDAC hastalarının çoğunda sınırlı kapsama alanı göstermiştir32. Diğer PDAC hastalarından iPSC hatları üretmenin zorlukları, daha güvenilir biyobelirteçler keşfetme yeteneğini durdurmuştur. Bu, OSKM iletiminin heterojenliği de dahil olmak üzere birçok teknik faktörden kaynaklanmaktadır, çünkü insan birincil PDAC hücrelerinin yalnızca küçük bir kısmı dört faktörün tümünü içeriyordu ve yeniden programlamaya başarılı bir şekilde yanıt verdi. Burada, OSKM'nin daha verimli ve tutarlı bir çift lentiviral iletimi kullanılarak birincil PDAC hücrelerinin yeniden programlanması için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (50 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31350010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>330613</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Pituitary Extract (BPE)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13028014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BxPc3</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1687</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin from Vibrio cholerae</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>C8052-1MG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen, Type I solution from rat tail</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>C3867</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Completed Defined K-SFM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>&#160;10744-019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>CLS3516</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning syringe filters</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>CLS431231</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>CLS430599</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day Impex&#160;Virkon Disinfectant Virucidal Tablets</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12328667</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>D8537</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10270-106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene HD Transfection Reagent&#160;</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>&#160;E2312</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin solution, Type B, 2% in H2O</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>G1393-100ML</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow Minimum Essential Media (GMEM)</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>G5154</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF Recombinant Protein</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHG0311</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>100-18B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7)</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECA001-FP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMEF feeder cells&#160;</td>
			<td>iXcells Biotechnologies</td>
			<td>10MU-001-1V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte Serum Free Media (KSFM)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17005-042</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10829018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut serum Replacement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10828028</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030-024</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HP 0.45 &#956;M syringe Filter Unit (Sterile)</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>SLHP033RS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDG&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>187440</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (Hexadimethrine bromide)&#160;</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>H9268-5G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-CMV-K2M&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>21164</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-EF2-O2S&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>21162</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>12260</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pWPT-GFP&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>12255</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium (ATCC modification)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1049101</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodym Pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11360-039</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Syringes for Single Use (60 mL)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15899152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15575020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (Dihydrochloride)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72304</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reprogramming pancreatic ductal adenocarcinoma to pluripotency

Transkripsiyon faktörleri kullanılarak indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) üretimi, hemen hemen tüm farklılaşmış hücre tiplerinden elde edilmiştir ve araştırma ve klinik uygulamalar için oldukça değerli olduğu kanıtlanmıştır. İlginç bir şekilde, pankreas duktal adenokarsinomu (PDAC) gibi kanser hücrelerinin iPSC yeniden programlanmasının invaziv PDAC fenotipini geri döndürdüğü ve kanser epigenomunu geçersiz kıldığı gösterilmiştir. PDAC kaynaklı iPSC'lerin farklılaşması, PDAC ilerlemesini erken pankreatik intraepitelyal neoplazi (PanIN) öncüsünden özetleyebilir ve PDAC ilerlemesi sırasında erken meydana gelen moleküler ve hücresel değişiklikleri ortaya çıkarabilir. Bu nedenle, PDAC'den türetilen iPSC'ler, erken tespit tanı belirteçlerinin keşfi için PDAC'nin en erken aşamalarını modellemek için kullanılabilir. Bu, daha erken PanIN evreleri için güvenilir biyobelirteçlerin bulunmaması nedeniyle tipik olarak geç metastatik evrelerde teşhis edilen PDAC hastaları için özellikle önemlidir. Bununla birlikte, PDAC da dahil olmak üzere kanser hücre hatlarının pluripotentliğe yeniden programlanması zorlu, emek yoğun ve farklı hatlar arasında oldukça değişken olmaya devam etmektedir. Burada, bisiztronik lentiviral vektörleri kullanarak çeşitli insan PDAC hücre hatlarından iPSC'ler üretmek için daha tutarlı bir protokol açıklıyoruz. Ortaya çıkan iPSC çizgileri stabildir ve yeniden programlama faktörlerinin veya indüklenebilir ilaçların eksojen ekspresyonuna bağımlılık göstermez. Genel olarak, bu protokol, daha spesifik ve PDAC vakalarını temsil eden erken biyobelirteçleri keşfetmek için gerekli olan çok çeşitli PDAC'den türetilmiş iPSC'lerin oluşturulmasını kolaylaştırır.

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the most fatal malignancies, and early diagnosis remains challenging due to the asymptomatic nature of the disease. The majority of PDAC patients are diagnosed at the advanced metastatic stage when very limited treatment options are available1,2. This is mainly due to the lack of reliable biomarkers for the earlier stages, such as those that could be conveniently detected as proteins released into the bloodstream.
PDAC can disseminate very early during its progression, and a better prognosis has been linked to early cancer detection when PDAC is localized in the pancreas3. However, less than a tenth of PDAC patients are diagnosed with a favorable prognosis, allowing for surgical resection. Nonetheless, those few with resectable tumors are also prone to tumor recurrence within 12 months4.
In the past five decades, remarkable improvements have been made in surgical techniques, patient care, and treatment modalities5,6. However, the 5-year survival rate in surgically resected PDAC patients has barely risen to 17%. Nonetheless, this is still better than that in non-resected patients, which has remained almost unchanged (0.9%)4,7. Chemotherapy is the only other alternative PDAC treatment. Yet, this option is very limited as the great majority of PDAC patients exhibit strong resistance to chemotherapy medications such as Gemcitabine7,8. Other drugs, such as Erlotinib, are only available to a small group of PDAC patients with specific mutations, most of whom show Erlotinib resistance9. The adverse side effects associated with chemotherapy in most PDAC patients are yet another disadvantage of this treatment10. Recently, promising strategies have shown that immune checkpoint inhibitors (ICIs) and small molecule kinase inhibitors (SMKIs) can be effective in treating PDAC, but durable responses to these targeted therapies remain limited to a minority of patients11,12. Overall, the discovery of PDAC-specific early biomarkers can pave new avenues for early diagnosis and treatment.
PDAC develops from pancreatic intraepithelial neoplasms (PanIN) precursor lesions that result from non-invasive pancreatic duct epithelial proliferations13,14. While the formation of PanIN is initiated by oncogene mutations such as KRAS, additional genetic and epigenetic alterations are required for the progression to PDAC. It has been projected that the progression of PanIN through the different stages into invasive PDAC takes about 10 years13,15,16,17. This timeframe provides a great opportunity to benefit from early PDAC diagnosis. Therefore, extensive research has been carried out to establish tumor xenograft animal models and organoid cultures to study PDAC progression18,19,20,21. These models have been very useful for studying the invasive stages of PDAC, although not the transition from the early PanIN phases. It is, therefore, important to develop experimental models that can recapitulate the early progression of PanIN stages to enable the discovery of early detection biomarkers.
Reprogramming somatic cells into induced pluripotent stem cells (iPSCs) using the four transcription factors OCT4, SOX2, KLF4, and c-MYC (OSKM) has illustrated the extent of cellular plasticity22. Cancer cell plasticity has been well-documented, and reprogramming human cancer cells into iPSCs has been successfully used to reset cells to their original cellular state, removing many of the epigenetic insults that have accumulated during cancer progression23,24,25,26,27,28,29. The possibility of using this reprogramming strategy to manipulate cancer cell identity has, therefore, presented great promise in treating cancer30,31. Indeed, we have previously shown that the differentiation of iPSCs derived from PDACs can recapitulate PDAC progression through the early PanIN stages32. By identifying genes and pathways specific to the early-to-intermediate stages of PDAC, candidate biomarkers were identified that can be clinically used for early PDAC diagnosis32,33. However, the biomarkers discovered using a single iPSC line showed limited coverage in the majority of PDAC patients32. The challenges of generating iPSC lines from other PDAC patients have halted the ability to discover more reliable biomarkers. This is due to many technical factors, including the heterogeneity of OSKM delivery, as only a small portion of human primary PDAC cells contained all four factors and responded successfully to reprogramming. Here, a detailed protocol is presented for reprogramming primary PDAC cells using a more efficient and consistent dual lentiviral delivery of OSKM.

Yazar Spotlight: Hastalığın İlerlemesini ve Tedavi Hedeflerini İncelemek için Kanser Hücrelerini iPSC'lere Yeniden Programlama

Pankreatik Duktal Adenokarsinomun Pluripotentliğe Yeniden Programlanması

1 One of the most challenging aspects of studying PDAC<v>2 or pancreatic cancer is the availability 3 of an experimental model 4 that can recapitulate the progression 5 of PDAC from the early proline stages 6 to the aggressive state. 7 The other challenge is to experimentally capture 8 the plasticity and heterogeneity of PDAC. 9 So using PDAC IPS cells will help us tackle 10 some of these challenges 11 and expand our experimental tools to study this disease.12 We have established a robust protocol 13 to reprogram PDACs to iPS cells. 14 By generating more iPS lines from many more PDAC patients, 15 we can study the transition of pancreatic cancer 16 from early to advanced stages and see the commonalities 17 and differences between these lines. 18 This will help us discover early diagnostic markers 19 that cover more patients, 20 and generate drugs that target 21 the different states of the disease.22 The interesting question that came out of reprogramming 23 PDAC to iPS cells is what makes this cancer 24 so resistant to sulfate conversion compared to normal cells? 25 Is this due to specific genes or genetic mutations 26 that tell us something about cancer cell identity?

PDAC, BXPc3, H6C7 ve hFib hücrelerinden türetilen iPSC kolonilerinin morfolojisini gösteren temsili görüntüler Şekil 1'de gösterilmektedir. PDAC-iPSC kolonileri, yeniden programlamanın 25. gününde oluşmaya başladı. Daha yerleşik bir ESC benzeri morfolojiye sahip sağlam iPSC kolonileri, yeniden programlamanın 40. gününde tanımlanmıştır (Şekil 1). Benzer şekilde, BxPc3-iPSC'lerin oluşumu 23. günde başlad...

Watch this Scientific Journal Video about Reprogramming Pancreatic Ductal Adenocarcinoma to Pluripotency at JoVE.com

Mevcut protokol, Pankreatik Duktal Adenokarsinom (PDAC) ve normal pankreatik duktal epitel hücrelerinin indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC'ler) yeniden programlanmasını açıklamaktadır. Lentivirüsün hazırlanmasından stabil iPSC hatlarının oluşturulmasına kadar optimize edilmiş ve ayrıntılı, adım adım bir prosedür sunuyoruz.

The generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) using transcription factors has been achieved from almost any differentiated cell type and has ...

reprogramming-pancreatic-ductal-adenocarcinoma-to-pluripotency

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Reprogramming Pancreatic Ductal Adenocarcinoma to Pluripotency

513 Görüntüleme.  The University of Edinburgh. 1 PDAC2 veya pankreas kanserini incelemenin en zorlu yönlerinden biri, PDAC'ın ilerlemesini 5 erken prolin evrelerinden agresif duruma 6 özetleyebilen deneysel bir modelin 3 mevcudiyetidir 3. 7 Diğer zorluk, PDAC'ın plastisitesini ve heterojenliğini deneysel olarak 8 yakalamaktır. 9 Dolayısıyla, PDAC IPS hücrelerini kullanmak, 10 bu zorluklardan bazılarının 11 üstesinden gelmemize ve Bu hastalığı incelemek için deneysel araçlar.

Video: Yazar Spotlight: Hastalığın İlerlemesini ve Tedavi Hedeflerini İncelemek için Kanser Hücrelerini iPSC'lere Yeniden Programlama

The generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) using transcription factors has been achieved from almost any differentiated cell type and has proved highly valuable for research and clinical applications. Interestingly, iPSC reprogramming of cancer cells, such as pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), has been shown to revert the invasive PDAC phenotype and override the cancer epigenome. The differentiation of PDAC-derived iPSCs can recapitulate PDAC progression from its early pancreatic intraepithelial neoplasia (PanIN) precursor, revealing the molecular and cellular changes that occur early during PDAC progression. Therefore, PDAC-derived iPSCs can be used to model the earliest stages of PDAC for the discovery of early-detection diagnostic markers. This is particularly important for PDAC patients, who are typically diagnosed at the late metastatic stages due to a lack of reliable biomarkers for the earlier PanIN stages. However, reprogramming cancer cell lines, including PDAC, into pluripotency remains challenging, labor-intensive, and highly variable between different lines. Here, we describe a more consistent protocol for generating iPSCs from various human PDAC cell lines using bicistronic lentiviral vectors. The resulting iPSC lines are stable, showing no dependence on the exogenous expression of reprogramming factors or inducible drugs. Overall, this protocol facilitates the generation of a wide range of PDAC-derived iPSCs, which is essential for discovering early biomarkers that are more specific and representative of PDAC cases.

The present protocol describes the reprogramming of Pancreatic Ductal Adenocarcinoma (PDAC) and normal pancreatic ductal epithelial cells into induced pluripotent stem cells (iPSCs). We provide an optimized and detailed, step-by-step procedure, from preparing lentivirus to establishing stable iPSC lines.

Kanser Araştırmaları

Lentivirus Preparation and Reprogramming Transduction for Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Cells

1 2 To begin, see the HEK 293T cells<v>3 24 hours before transfection 4 in a 15 centimeter dish containing GMEN. 5 Incubate the cells at 37 degrees Celsius 6 and 5%carbon dioxide 7 until they reach 40 to 50%confluency. 8 Label three 15 milliliter plastic tubes 9 with the appropriate lentivirus name.10 Add 1.710 milliliters of reduced serum medium 11 and 90 microliters of transfection reagent to each tube. 12 Mix the contents by vortexing 13 before incubating the tubes at room temperature. 14 After five minutes, add the packaging vector mixture 15 to the transfection medium and vortex.16 Then add 7.5 micrograms of reprogramming vector 17 and the pWPT-GFP control 18 to the respective transfection mixture. 19 Vortex the tubes for two seconds 20 before incubating for 15 minutes at room temperature. 21 To transfect the 293T cells with each lentivirus, 22 dropwise, add a transfection DNA mixture into the dish.23 Incubate the transfected cells at 37 degrees Celsius 24 and 5%carbon dioxide. 25 After 14 to 16 hours, 26 replace the medium with 30 milliliters 27 of fresh 293T medium 28 and continue incubation for 60 to 72 hours. 29 Observe the cells daily 30 and check transfection efficiency.31 Next, transfer the virus transfection culture 32 into 15 milliliter tubes 33 and spin down at 1, 932 G for 10 minutes 34 at four degrees Celsius. 35 Filter the lentiviral supernatant 36 using a 0.45 micron syringe filter 37 into a new 50 milliliter tube. 38 One day before lentivirus transduction, 39 prepare two wells of a 6-well plate 40 containing 100, 000 PDAC cells per well.41 Prepare two 15 milliliter tubes 42 with two milliliters of pre-warmed PDAC medium. 43 In the first tube, 44 add 12 milliliters of reprogramming lentivirus. 45 Then add 12 microliters of polybrene 46 and mix by pipetting.47 To the second tube, 48 add two microliters of polybrene. 49 Now carefully remove the medium from each well 50 of a 6-well plate 51 and wash once with PBS at room temperature. 52 Add the reprogramming infection medium 53 from tube one to the first well.54 Add the mixture from tube two to the second well. 55 Incubate the cells overnight at 37 degrees Celsius 56 with 5%carbon dioxide and 5%oxygen. 57 The next day, replace the medium 58 from both wells with fresh PDAC medium 59 and continue incubation 60 for up to 48 hours as demonstrated.

Pankreatik Duktal Adenokarsinom Hücreleri için Lentivirüs Hazırlığı ve Yeniden Programlama Transdüksiyonu

Preparation of iMEF Feeder Cells and Reprogramming Transduction for Induced Pluripotent Stem Cells

1 To begin, coat the 6-well plate<v>2 with two milliliters of 0.2%gelatin solution per well. 3 Incubate the plate at 37 degrees Celsius 4 and 5%carbon dioxide for 30 minutes. 5 Next, drop-wise add iMEFs into a 15 milliliter tube 6 containing 10 milliliters 7 of pre-warmed human fibroblast medium, 8 and mix by gently inverting the tube.9 Centrifuge the cell suspension at 309 G for three minutes. 10 And remove the supernatant before re-suspending the pellet 11 in 12 milliliters of human fibroblast medium. 12 Place two milliliters of the cell suspension 13 into each well of the gelatin-coated six well plate.14 And incubate overnight at 37 degrees Celsius 15 and 5%carbon dioxide. 16 Discard the medium from the lentivirus-infected 17 and non-infected PDAC, and wash the cells twice with PBS. 18 Then add 500 microliters of trypsin to dissociate the cells.19 And incubate at 37 degrees Celsius 20 with 5%carbon dioxide and 5%oxygen 21 for 15 minutes. 22 Centrifuge the cell suspension at 300 G for five minutes. 23 And re-suspend the pellet in one milliliter of PDAC medium.24 Wash the iMEF plate with PDAC medium. 25 Then add 50, 000 lentivirus-infected PDAC cells 26 per well in five wells of iMEF plate, and incubate overnight 27 as demonstrated previously. 28 After preparing the reprogramming medium, 29 add 100 microliters of basic fibroblasts growth factor 30 to 100 milliliters of reprogramming medium.31 The next day, wash the cells growing on iMEF feeders twice 32 with pre-warmed reprogramming media. 33 Then add two milliliters of media to each well, 34 and incubate overnight at 37 degrees Celsius 35 with 5%carbon dioxide and 3%oxygen. 36 After passing the IPSC pool five times, 37 observe the robust colonies 38 maintaining ESC-like morphology.39 The PDAC, BxPc3, 40 H6c7, and human fibroblast 41 showed different days of reprogramming 42 to form a mature ESC-like morphology. 43 Clonal IPSC lines were established 44 from each reprogramming of PDAC, 45 BxPc3, H6c7, 46 and human fibroblast cells. 47 All established IPSC lines stained positive 48 for TRA-160, confirming their reprogramming to pluripotency.