Başlamak için, 24 saat boyunca yetiştirilen Pseudomonas aeruginosa kültürlerini alın. Daha sonra optik yoğunluğunu 600 nanometrede 0.2'ye ayarlayın ve% 0.8 salin kullanarak uygun seyreltmeler yapın. Steril bir tel halka ile bakteri kültürünü CAS agar plakasına çizin.
CAS agar plakasını 24 saat boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Kültürü 96 oyuklu bir mikrotitre plakasına aktarın ve optik yoğunluğu 600 nanometrede ölçün. Daha sonra kültürleri santrifüj tüplerine aktarın.
Bakteri kültürünü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 4650 g'da santrifüjleyin. 100 mikrolitre hücresiz süpernatanı pipetleyin ve 96 oyuklu bir plakanın kuyusuna ekleyin. Daha sonra kuyuya 100 mikrolitre CAS boyası ekleyin.
İnkübasyondan önce plakayı alüminyum folyo ile örtün. İnkübasyondan sonra, 630 nanometrede spektrofotometrik okumalar yapın ve toplam siderofor miktarını yüzde siderofor birimi olarak hesaplayın. 100 mikrolitre hücresiz süpernatanı 96 oyuklu bir mikrotitre plakasına pipetleyin.
Sonra 100 mikrolitre tris-hidroklorik asit ekleyin. Çözeltinin spektrofotometrik okumasını 405 nanometrede ölçün. Pyochelin ekstraksiyonu için, önce 100 mililitre 48 saatlik yetiştirilmiş Pseudomonas aeruginosa kültürlerini santrifüj tüplerine pipetleyin.
Kültürleri 4650 g'da oda sıcaklığında 10 dakika santrifüjleyin. Daha sonra, süpernayana beş mililitre bir molar sitrik asit ekleyin. Pyochelin'i çıkarmak için çözeltiye 50 mililitre etil asetat ekleyin.
Organik fazı bir şırınga filtresinden magnezyum sülfat ile süzün. Ardından organik fazı eksi 20 santigrat derecede saklayın. Son olarak, 320 nanometrede spektrofotometrik okumalar yapın.
Üç klinik izolat ve referans suşu olan PAO1, CAS agar üzerinde yetiştirildiğinde siderofor üretiminin göstergesi olan berrak turuncu bir hale geliştirdi. J3 izolatının toplam siderofor üretimi ile PAO1 arasında önemli farklılıklar gözlendi. Pioverdin ekstraktının spektrofotometrik analizleri, 380 nanometrede doğrulayıcı bir tepe noktası sundu.
Tüm izolatlar pyoverdin üretimi için pozitifken, MR1 ve J3 referans suşa göre daha düşük üretim gösterdi. Pyochelin'in varlığı 320 nanometrede bir zirve ile doğrulandı. Her üç klinik izolat da PAO1'e kıyasla önemli ölçüde daha yüksek hacimler üretti.
