Başlamak için, 0,4 mikron filtreli ekler içeren 24 oyuklu bir plaka seçin. Bir pipet kullanarak, filtre eklerinin altına ve üstüne 500 mikrolitre HBSS ekleyin. Ardından çok kuyulu plakayı kapatın ve iki saat boyunca bir inkübatöre yerleştirin.
İnkübasyondan sonra, HBSS'yi plakadan dikkatlice aspire edin. Buz üzerinde DMEM'de steril 50 mililitrelik bir tüpte hücresiz bir kollajen çözeltisi hazırlayın. Membran filtrenin üzerine 250 mikrolitre kolajen ekleyin ve kapağı plakaya yerleştirin.
Çözeltinin oda sıcaklığında polimerize olmasına izin verin. Daha sonra, L-929 fibroblast hücre kültürünü inkübatörden çıkarın. Şişeye iki mililitre önceden ısıtılmış tripsin EDTA çözeltisi ekleyin ve üç ila beş dakika boyunca bir inkübatöre koyun.
Hücre süspansiyonunu steril 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve beş dakika boyunca 645 G'de santrifüjleyin. Bir vakum pompası kullanarak, süpernatanı aspire edin ve peleti bir mililitre DMEM'de yeniden süspanse edin. 20 mikrolitre Tripan Blue çözeltisi içeren bir tüpe 20 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin.
Ve hücre yoğunluğunu değerlendirmek için bir hücre sayma odası kullanın. Ardından, U-937 monosit hücre kültürünü inkübatörden çıkarın. Hücre süspansiyonunu santrifüjleyin ve peleti bir mililitre RPMI'de yeniden süspanse edin.
Hücrelerin homojen bir şekilde süspanse edildiğinden emin olduktan sonra, bir hücre sayma odası kullanarak bunları sayın. Daha sonra, 50 mikrolitre DMEM'de sırasıyla 50.000 L-929 ve 15.000 U-937 hücresi içeren hücre süspansiyonları hazırlayın. Her 50 mikrolitrelik hücre süspansiyonunu 450 mikrolitre kolajene ekleyin ve iyice karıştırın.
Önceden kodlanmış hücresiz lamina propria'yı 500 mikrolitre kollajen hücre solüsyonu ile kaplayın. Plakayı kapatın ve çözeltinin sertleşmesini sağlamak için iki saat boyunca bir inkübatöre yerleştirin. Ardından, Caco-2 hücre kültürünü inkübatörden çıkarın.
Bir vakum pompası kullanarak, ortamı aspire edin ve hücreleri 10 mililitre PBS ile durulayın. Beş mililitre PBS tripsin EDTA çözeltisi ekleyin ve beş ila sekiz dakika boyunca bir inkübatöre yerleştirin. Daha sonra hücre süspansiyonunu santrifüjleyin ve peleti bir mililitre DMEM'de yeniden süspanse edin.
Saydıktan sonra, 50 mikrolitre DMEM'de 150.000 Caco-2 hücresi içeren bir hücre süspansiyonu hazırlayın. Plakayı inkübatöre aktarmadan önce 10 dakika boyunca laminer akış başlığına yerleştirin. 30 dakika sonra, yeniden yapılandırılmış modelin üzerine 500 mikrolitre DMEM ve filtrenin altına 500 mikrolitre ekleyin ve plakayı inkübatöre geri koyun.
Ertesi gün, ortamı sırasıyla filtrenin üstünde ve altında 500 mikrolitre taze DMEM ile dikkatlice değiştirin.
