Araştırmacı çalışmalarını destekleyen bir burs için Umberto Veronesi Vakfı'na teşekkürler.

1. Temel 3D rekonstrükte edilmiş bağırsak mukoza modelinin hazırlanması
NOT: Tüm prosedür steril bir laminer akış başlığında gerçekleştirilmelidir. Hücre inkübatörünün kullanımını içeren prosedürdeki tüm adımlar, kültürlerin %5CO2 içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de inkübe edildiğini gösterir (protokolde aksi belirtilmedikçe).
<ol><li>Bağırsak model sisteminde kullanılan hücre hatlarının önceden hazırlanması<ol><li>L929 fare fibroblast hücrelerini, 2 mM L-glutamin,% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ve% 1 Penisilin-Streptomisin (Pen-Strep) içeren Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamının (DMEM) 5 mL'sinde 5 x 105 konsantrasyonunda tohumlayın ve bir F25 şişesinde ve bağırsak modellerinin yapımından 4 gün önce bir inkübatörde kültürleyin. 48 saat sonra, bir pipet kullanarak ortamı çıkarın. Daha sonra taze ortam (5 mL) ekleyin ve hücreleri 48 saat daha inkübe edin. NOT: Hücreler kullanılmadan önce %80 birleşik olmalıdır.</li>
		<li>Bir F75 hücre şişesinde 10 mL DMEM ortamında (% 10 FBS ve% 1 Pen-Strep ile) Caco-2 hücrelerini (konsantrasyon 2 x 106) tohumlayın ve bağırsak mukoza modelinin yapımından 4 gün önce bir inkübatörde kültürleyin. 48 saat sonra, ortamı adım 1.1.1'de açıklandığı gibi değiştirin ve 48 saat boyunca% 80'lik bir birleşmeye kadar inkübe edin. NOT: Hücreler aktif bir proliferatif fazda olmalıdır: ne çok seyrek ne de çok birleşik. % 50-60 izdiham önerilir. Hücreler, modeli yapmadan bir gün önce ekilmemelidir, çünkü bu, hücrelerin çoğalma kapasitesini yavaşlatabilir ve bu da yeniden yapılandırılmış 3D modelde mükemmel bir şekilde kök salmayacaktır.</li>
		<li>Model kurulumundan 2 gün önce bir F75 hücre şişesinde süspansiyon halinde (1 x 106 konsantrasyon) 10 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ortamına (2 mM L-glutamin,% 1 sodyum piruvat,% 10 FBS ve% 1 Pen-Strep içeren) süspansiyon (1 x 10 6 konsantrasyonu) içinde büyüyen U937 hücrelerini ekleyin ve 48 saat boyunca bir inkübatöre koyun.</li>
	</ol></li>
	<li>Transwell ko-kültür plakası eklerinin hazırlanması<ol><li>0,4 μm filtreli kesici uçlar içeren 24 oyuklu bir plaka seçin. NOT: 0,4 μm filtre, ilaç taşıma çalışmalarında standart bir seçimdir. 3 μm ve 8 μm filtre boyutları, kollajen gömülü hücrelerin olası kayıplarını önlemek için önerilmez.</li>
		<li>Bir pipet kullanarak, Transwell filtrelerini (bundan böyle membran ekleri olarak anılacaktır) filtre ekinin altında ve üstünde 500 μL Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile nemlendirin.</li>
		<li>Çok kuyulu plakayı kapatın ve en az 2 saat boyunca bir inkübatöre yerleştirin. NOT: Membran ekleri HBSS'de 24 saate kadar kalabilir. Bu işlem, modeli oluşturmadan bir gün önce gerçekleştirilebilir. Membran eklerinin tamamen hidratlanması ve filtrenin kurumaması önemlidir, çünkü bu, numunenin düzgün bir şekilde yapışmasını zorlaştırabilir.</li>
		<li>Plakaları 2 saat (veya 24 saat) sonra inkübatörden çıkarın. HBSS'yi bir pipet kullanarak membran eklerinin üstünden ve altından dikkatlice aspire edin ve 10 dakika kurumaya bırakın.</li>
	</ol></li>
	<li>Temel 3D bağırsak model sisteminin hücresiz kollajen lamina propria'sının hazırlanması (GÜN 1)<ol><li>DMEM'de aşağıdaki bileşenleri içeren buz üzerinde 50 mL'lik steril bir tüpte hücresiz bir kollajen solüsyonu hazırlayın:% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS), 200 mM L-glutamin,% 1 sodyum bikarbonat ve 1.35 mg / mL Tip 1 sıçan kuyruğu kollajeni. NOT: Tüm bu bileşenler buz üzerinde tutulmalı ve soğutulmuş pipet uçlarıyla DMEM'e eklenmelidir. Tip 1 sıçan kuyruğu kolajeni, artan sıcaklık ve pH ile polimerize olduğu için en son eklenmelidir. Hazırlanan hücresiz kollajen çözeltisinin miktarı, gerekli bağırsak eşdeğerlerinin sayısına bağlı olacaktır.</li>
		<li>Seçilen bağırsak eşdeğeri sayısı için her bir plaka ekine (membran filtrenin üstüne) 250 μL çözelti ekleyin ve kapağı çok kuyulu plakanın üzerine yerleştirin. Kollajen çözeltisinin laminer akış başlığı altında oda sıcaklığında (RT) polimerize olmasına izin verin. NOT: Daha katı bir faza geçişin yanı sıra, polimerizasyon, rengin sarıdan pembeye değişmesinden de belirgindir. Polimerizasyon genellikle 10-15 dakika içinde tamamlanır.</li>
	</ol></li>
	<li>Fibroblast (L929) ve monosit (U937) hücrelerinin hazırlanması, hücre sayımı ve model sisteme eklenmesi (1. GÜN)<ol><li>L929 hücre kültürünü (adım 1.1.1) inkübatörden çıkarın. Bir vakum pompası kullanarak, ortamı aspire edin, 5 mL steril fosfat tampon salin (PBS; Ca ve Mg olmadan) ile değiştirin ve hücreleri durulayın.</li>
		<li>PBS'yi bir vakum pompası kullanarak aspire edin. 2 mL önceden hazırlanmış bir tripsin-EDTA çözeltisi (PBS'de% 0.05 tripsin ve% 0.02 EDTA) ekleyin ve 3-5 dakika boyunca bir inkübatöre koyun.</li>
		<li>Hücrelerin yapışma yüzeyinden ayrılıp ayrılmadığını belirlemek için ters çevrilmiş bir mikroskop (örneğin, bir Eclipse Ts2, Nikon) kullanın. Bu meydana gelirse, tripsin reaksiyonunu bloke etmek ve hücreleri durulamak için hemen 2 mL DMEM (% 10 FBS içerir) ekleyin.</li>
		<li>Hücre çözeltisini steril 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 645 x g'da santrifüjleyin. Bir vakum pompası kullanarak süpernatanı aspire edin. NOT: Peletin bozulmamasına özen gösterilmelidir. DMEM'in etkisi L929 ve U937 hücreleri üzerinde test edildi ve büyüme üzerinde olumsuz etkileri olduğu gösterilmedi.</li>
		<li>Peletlere 1 mL DMEM ekleyin ve hücreleri askıya alın. NOT: Hücreler çözelti içinde homojen bir şekilde süspanse edilmelidir.</li>
		<li>DMEM'deki hücrelerin 20 μL'sini çıkarın ve 20 μL Tripan mavisi çözeltisi ekleyin. Karışımın 20 μL'sini çıkarın ve bir hücre sayma odası kullanarak hücre yoğunluğunu mikroskobik olarak değerlendirin.</li>
		<li>U937 hücre kültürünü (adım 1.1.3) inkübatörden çıkarın. Hücre çözeltisini 645 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Bir vakum pompası kullanarak, peleti rahatsız etmemek için süpernatanı aspire edin.</li>
		<li>Hücreleri 1 mL RPM'de askıya alın. L929 hücrelerinde olduğu gibi, hücrelerin çözelti içinde homojen bir şekilde süspanse edildiğinden emin olun.</li>
		<li>Benzer şekilde, adım 1.4.6'da bildirildiği gibi hücre yoğunluğunu belirleyin.</li>
		<li>Adım 1.3.1'de açıklandığı gibi bir kolajen çözeltisi hazırlayın. NOT: Yapılacak çözelti miktarı, her bir kesici uç (veya model) için 450 μL dikkate alınmalıdır.</li>
		<li>Oluşturulacak her bağırsak eşdeğer modeli için 50 μL'lik bir hacimde sırasıyla 50.000 L929 hücresi ve 15.000 U937 hücresi içerecek şekilde bir DMEM çözeltisi hazırlayın. NOT: Hücre sayısı kritik bir faktördür. Her iki hücre tipinin de çok fazla olması, yeterince organize edilemeyen hücrelerle aşırı dolu bir lamina propria ile sonuçlanacaktır. Düşük sayıda fibroblast (kollajen üreten) daha az kompakt bir lamina propria ile sonuçlanırken, çok az monosit uyaranlara karşı bağışıklık tepkisini engelleyecektir. Her 50 μL'lik alikot içinde doğru hücre sayısının bulunması koşuluyla - her 24 kuyucuklu plakada bulunan 12 filtre eki için toplam 600 μL'lik bir hacim hazırlanabilir.</li>
		<li>Hücreleri içeren her 50 μL'lik alikotu adım 1.4.10'da 450 μL kollajen çözeltisine ekleyin. İyice karıştırın.</li>
		<li>Her model için önceden kaplanmış hücresiz kollajen lamina propria'yı 500 μL kollajen içeren hücre çözeltisi ile kaplayın. NOT: Hacimleri her bir eke hızlı bir şekilde eklemek önemlidir ve bu nedenle, yeniden yapılandırılmış bağırsak mukozası modellerinin sayısını bir seferde 12 veya daha az ile sınırlamanız önerilir.</li>
		<li>Plakayı kapatın ve çözeltinin sertleşmesini sağlamak için 2 saat boyunca bir inkübatöre koyun.</li>
	</ol></li>
	<li>Hazırlanması, hücre sayımı ve epitelyal Caco-2 hücrelerinin bağırsak modeline eklenmesi (GÜN 1)<ol><li>Caco-2 hücre kültürünü (adım 1.1.2) inkübatörden çıkarın. Ön durulama için 10 mL PBS kullanarak adım 1.4.1'deki prosedürleri tekrarlayın. Daha sonra 5 mL önceden hazırlanmış bir tripsin-EDTA çözeltisi (Ca ve Mg içermeyen PBS'de% 0.05 tripsin ve% 0.02 EDTA) ekleyin ve 5-8 dakika boyunca bir inkübatöre koyun.</li>
		<li>Hücre sayma odasını kullanarak hücreleri saymak için 1.4.3 adımlarını (ancak tripsin reaksiyonunu bloke etmek için 5 mL DMEM kullanarak) 1.4.6'ya kadar tekrarlayın.</li>
		<li>50 μL'de 150.000 Caco-2 hücresi içeren bir DMEM çözeltisi hazırlayın. NOT: Kullanılan hücre sayısı kritik bir noktadır. 150.000 hücreyi aşmak, kompakt bir düzensiz epitel tabakasına neden olabilirken, çok az (100.000'den az) ile hücreler büyümek için mücadele eder ve süreksiz bir bağırsak epitel tabakası oluşturan bazal zarı yeterince örtmez. Hücrelerin etkili bir şekilde askıya alındığından emin olun. Homojen dağılımı sağlamak için 200 μL'lik bir pipetin ucu kullanılabilir. Herhangi bir zamanda 12 modelin yapılabileceği göz önüne alındığında, 600 μL'lik bir hücre çözeltisi hazırlanabilir.</li>
		<li>Adım 1.4.14'te gereken 2 saatten sonra, her bir bazal membranın ortasına DMEM'de süspanse edilmiş 50 μL Caco-2 hücresi ekleyin. Çok kuyulu plakanın kapağını kapatın.</li>
		<li>Steril laminer akış başlığının altında 10 dakika inkübe edin. Ardından 30 dakika boyunca inkübatöre aktarın.</li>
		<li>%10 FBS ve %1 Pen/Strep içeren bir DMEM solüsyonu hazırlayın. NOT: Model başına 1 mL hacim kullanmak için yeterli bir çözelti hazırlayın.</li>
		<li>Yeniden yapılandırılmış modelin üzerine 500 μL ortam ve filtrenin altına 500 μL ekleyin. NOT: Hücrelerin ayrılmasını veya gerilmesini önlemek için ortamı filtrenin üzerine eklerken dikkatli olunmalıdır.</li>
		<li>Çok kuyulu plaka sistemini kapatın ve inkübatöre yerleştirin.</li>
	</ol></li>
	<li>Model hazırlama/oluşturma ve kullanımı (2. GÜN - 6. GÜN)<ol><li>2. GÜN: Çözeltiyi bir pipet kullanarak hem yeniden yapılandırılmış modelin üstünden hem de filtrenin altından dikkatlice çıkarın. Filtrenin üstünde ve altında sırasıyla taze 500 μL taze DMEM (%10 FBS ve %1 Pen/Strep) ile değiştirin.</li>
		<li>3. GÜN: Adım 1.6.1'de yukarıdaki gibi tekrarlayın.</li>
		<li>4. GÜN: Adım 1.6.1'de yukarıdaki gibi tekrarlayın. NOT: Bu bağırsak modeli statik bir hücresel modeldir; Bu nedenle, moleküllerin salınmasını ve hücrelerin büyümesini ve uyarılmasını desteklemek için, ortamın her gün değiştirilmesi çok önemlidir.</li>
		<li>5. GÜN: Bu noktada, model tamamen oluşturulur/geliştirilir. Daha ileri çalışmalar için bu modelleri kullanın. NOT: Modeli kullanmak için en uygun zaman 5 gündür. Hücreler bir inkübatörde daha uzun süre tutulabilse de, ne kadar çok zaman geçerse, epitel hücrelerinin kontrolsüz bir şekilde büyüme olasılığı o kadar artar ve bu da kullanımı zor, düzensiz ve kompakt bir tabaka ile sonuçlanır.</li>
		<li>5 günde, modelleri toksik (glüten veya lipopolisakkarit [LPS]) veya ilgilenilen faydalı bileşenlerle (polifenoller) inkübe edin. Bunları, DMEM ortamında asılı duran yeniden yapılandırılmış modelin üst kısmına ekleyin. NOT: İlgilenilen her bir bileşenin uygun konsantrasyonu hesaplanmalı ve bir DMEM ortamında askıya alınmalıdır. Deneysel modellerle karşılaştırmak için sadece DMEM ortamı içeren işlenmemiş kontroller ayarlanmalıdır.</li>
		<li>Kontrol ve deneysel modelleri bir inkübatörde 24 saat inkübe edin.</li>
		<li>6. GÜN: Filtrenin üstündeki ve altındaki ortamı bir pipetle çıkarın. NOT: Ortam, inflamatuar sitokinlerin salınımını ölçmek için müteakip enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) tipi testler için saklanabilir. Bu amaçla, ortam steril şişelere eklenmeli ve daha fazla analiz için -20 ° C'de saklanmalıdır.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Yeniden yapılandırılmış bağırsak mukozası modellerinin parafin gömülmesi
NOT: Tüm prosedür kimyasal çeker ocak altında gerçekleştirilmelidir. Her adıma ve ilgili zaman tahsisine kesinlikle uyulmalıdır. Bu nedenle, tüm reaktiflerin önceden hazırlanması önemlidir.
<ol><li>Parafin makinesini kullanıma hazır hale getirmek için 58 °C'ye ayarlayın.</li>
	<li>Membran eklerini steril 24 oyuklu bir plakada pense kullanarak kuyucukları temizlemek için aktarın.</li>
	<li>Filtrenin üzerine PBS'ye 500 μL %37 tamponlu formalin ve filtrenin altına 1 mL ekleyin. Kapağı kapatın ve RT'de 2 saat kimyasal çeker ocak altında bırakın. NOT: Alternatif olarak, RT'de 1 saat boyunca% 4 tamponlu formalin kullanılabilir.</li>
	<li>Formalini çıkarın ve filtrenin hem üstüne hem de altına HBSS solüsyonu ekleyin. Ardından HBSS'yi çıkarın.</li>
	<li>Lamina propria'yı membran ekinden ayırın. NOT: Bağırsak mukozasının hücreleri, ikincisine bağlı olmadıkları için genellikle zar ekinden çok kolay ayrılır. Ek olarak, iki numune bölmesi (apikal ve bazal) 3D yapıyı koruyarak bağlı kalır. Herhangi bir nedenle kolayca ayrılmazlarsa, bağırsak mukozasını zar ekinden çıkarmak için steril tek kullanımlık bir neşter bıçağı kullanmak önemli olacaktır. Membran eki kesilebilir, böylece plastikten ayrılabilir. Numuneye asla neşterle dokunmamaya dikkat edin. Membran ekinin kollajen gömülü hücrelerden çıkarılmasının nedeni, bu filtrenin sonraki fiksasyon veya parafin gömme aşamalarında ayrılabilmesi ve bağırsak mukoza modelleri arasındaki karşılaştırmaları orantısız hale getirebilmesidir. Ayrıca, gömülü bölüm içindeki membran ekleri, kesit almaya müdahale edebilecek farklı bir kıvama sahiptir.</li>
	<li>100 mL'lik beherleri, her biri incelenmekte olan yeniden yapılandırılmış bir bağırsak mukozası model sistemini içerecek şekilde doğru şekilde etiketlenmiş kimyasal çeker ocakların altına yerleştirin. Her behere 25 mL% 35 ETOH ekleyin ve ardından yeniden yapılandırılmış bağırsak mukozasını ekleyin. 10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>%35 etanolü 25 mL %50 etanol ile değiştirin ve 10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>%50 etanolü 25 mL %70 etanol ile değiştirin ve 10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>%70 etanolü 25 mL %80 etanol ile değiştirin ve 10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>%80 etanolü 25 mL %95 etanol ile değiştirin ve 10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>%95 etanolü 25 mL %100 etanol ile değiştirin ve 10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>%100 etanolü 25 mL'lik başka bir %100 etanol değişimiyle değiştirin ve 10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Çeker ocakların altına, her biri incelenmekte olan bir modeli içerecek şekilde doğru şekilde etiketlenmiş 100 mL'lik beherler yerleştirin. 10-20 dakika boyunca 50 mL ksilen veya histolojik bir temizleme maddesi ekleyin. NOT: Ajan asidofilik lekelerin berraklığını ve canlılığını arttırdığı için Histo-Clear (histolojik temizleme ajanı) önerilir. Temizleme süresi, yeniden yapılandırılmış bir bağırsak mukozası örneğinden diğerine değişebilir ve her 2-3 dakikada bir görünümde şeffaflık açısından kontrol edilmelidir.</li>
	<li>Numuneler şeffaf olur olmaz, bunları metal bir doku kaset tutucusuna yerleştirin ve daha sonra ısıtılmış makinenin içinde 45 dakika boyunca sıvı parafine daldırın.</li>
	<li>Parafini değiştirin ve numuneleri ısıtılmış makinenin içinde 45 dakika daha bırakın.</li>
	<li>Kağıt mendil kaset tutucusunu çıkarın ve soğuması için buzun üzerine koyun. Soğutulmuş numune blokları metal tutucudan ayrıldığında, bunlar oda sıcaklığında daha fazla soğutulabilir.</li>
	<li>Blokları RT'de saklayın. NOT: Amaç bölümleri hemen hazırlamaksa, bloklar 4 ° C'ye yerleştirilebilir, böylece kullanıldıklarında iyi soğutulurlar.</li>
	<li>Bir mikrotom kullanarak 4 μm'lik kesitler kesin.</li>
	<li>Kesilen bölümleri slaytlara yerleştirin ve 24 saat boyunca 37 ° C'de bir fırında kurutun.</li>
	<li>Slaytlar kullanıma hazırdır. H & E histolojik boyama veya immün-histokimyasal reaksiyon boyama (antijen-antikor tipi) gerçekleştirene kadar bunları RT'de saklayın.<ol><li>İmmün-histokimyasal boyama için, ilgilenilen antikorları seçin (oklüdin gibi TJ proteinlerinin incelenmesi veya monosit aktivasyonu, göçü ve farklılaşması için) ve ticari kitleri kullanarak ekspresyonu (boyama yoluyla) tespit edin.</li>
		<li>Benzer şekilde, Alcian mavisi ve periyodik asit-Schiff (PAS) boyama kitini kullanarak mukusu ölçün.</li>
		<li>Mikroskoptan alınan mikrograflardaki pozitif piksellerin yüzdesini hesaplayarak okkludin gibi ilgilenilen boyanmış TJ proteinlerini ölçün.</li>
		<li>Görüntü analiz yazılımı (örneğin, ImageJ2 yazılımı [Wayne Rasband, sürüm 2.9.0/1.53t]) kullanarak hücrelerin resimlerini analiz edin.<ol><li>Piksellerin analizini gerçekleştirmek için dijital görüntüleri 300 piksel/inç olarak işleyin ve 8 bite dönüştürün. Ardından, ilgilenilen proteinin boyanmasını, bu durumda oklüdinin kalıcı kırmızı boyamasını analiz etmek için ikili görüntüleri Color Deconvolution eklentisi ile işleyin.</li>
			<li>Seçilen resmi tiff olarak kaydedin ve bir grafik düzenleyiciyle (örneğin, Adobe PhotoshopCC [sürüm 20.0.4]) yapaylıkları ortadan kaldırmak için bir "temizleme" prosedürüne tabi tutun.</li>
			<li>Daha sonra, ImageJ2'nin Parçacığını Analiz Et uygulaması ile tüm ilgi alanlarını ölçün ve verileri piksel sayısı olarak raporlayın. NOT: Her deneme, her çoğaltma için analiz edilen üç dahili çoğaltma alanıyla üç kopya halinde gerçekleştirilmelidir. Mukusun miktarını belirlemek için, pikselleri ölçmenin aynı prensibi, sırasıyla mor-macenta lekeli nötr müsinler ve parlak mavi lekeli asidik mukusun alınan görüntülerine uygulanabilir.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

Parafin Gömülü 3 Boyutlu Bağırsak Mukoza Modelinin Yapımı

<ol>
	<li>Chelakkot, C., Ghim, J., Ryu, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+regulating+intestinal+barrier+integrity+and+its+pathological+implications.">Mechanisms regulating intestinal barrier integrity and its pathological implications.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).</li><li>Schoultz, I., Keita, &. #. 1. 9. 7. ;. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+barrier+and+current+techniques+for+the+assessment+of+gut+permeability.">The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability.</a> Cells. 9 (8), 1909 (1909).</li><li>Bednarek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+methods+for+measuring+the+permeability+of+cell+monolayers.">In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers.</a> Methods and Protocols. 5 (1), 17 (2022).</li><li>Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+intestinal+barrier+by+nutrients:+The+role+of+tight+junctions.">Regulation of the intestinal barrier by nutrients: The role of tight junctions.</a> Animal Science Journal. 91 (1), e13357 (2020).</li><li>Guibourdenche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food+contaminants+effects+on+an+in+vitro+model+of+human+intestinal+epithelium.">Food contaminants effects on an in vitro model of human intestinal epithelium.</a> Toxics. 9 (6), 135 (2021).</li><li>Panwar, S., Sharma, S., Tripathi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+barrier+integrity+and+dysfunctions+in+maintaining+the+healthy+gut+and+their+health+outcomes.">Role of barrier integrity and dysfunctions in maintaining the healthy gut and their health outcomes.</a> Frontiers in Physiology. 12, 715611 (2021).</li><li>Truzzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-inflammatory+effect+of+gliadins+and+glutenins+extracted+from+different+wheat+cultivars+on+an+in+vitro+3D+intestinal+epithelium+model.">Pro-inflammatory effect of gliadins and glutenins extracted from different wheat cultivars on an in vitro 3D intestinal epithelium model.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 172 (2020).</li><li>Fedi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+replicating+the+human+intestinal+epithelium+for+absorption+and+metabolism+studies:+A+systematic+review.">In vitro models replicating the human intestinal epithelium for absorption and metabolism studies: A systematic review.</a> Journal of Controlled Release. 335, 247-268 (2021).</li><li>De Fazio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necrotizing+enterocolitis:+Overview+on+in+vitro+models.">Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).</li><li>Jubelin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+culture+models+in+oncology+research.">Three-dimensional in vitro culture models in oncology research.</a> Cell &amp; Bioscience. 12 (1), 155 (2022).</li><li>Russell, W., Burch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+principles+of+humane+experimental+technique.">The principles of humane experimental technique.</a> Available online. , (2023).</li><li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+time+for+reviewer+3+to+request+human+organ+chip+experiments+instead+of+animal+validation+studies.">Is it time for reviewer 3 to request human organ chip experiments instead of animal validation studies.</a> Advanced Science. 7 (22), 2002030 (2020).</li><li>Jung, S. M., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+the+small+intestine+for+studying+intestinal+diseases.">In vitro models of the small intestine for studying intestinal diseases.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 767038 (2022).</li><li>Nitsche, K. S., M&#252;ller, I., Malcomber, S., Carmichael, P. L., Bouwmeester, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementing+organ-on-chip+in+a+next-generation+risk+assessment+of+chemicals:+a+review.">Implementing organ-on-chip in a next-generation risk assessment of chemicals: a review.</a> Archives of Toxicology. 96 (3), 711-741 (2022).</li><li>Kekilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midkine+level+may+be+used+as+a+noninvasive+biomarker+in+Crohn's+disease.">Midkine level may be used as a noninvasive biomarker in Crohn's disease.</a> Turkish Journal of Medical Sciences. 50, 324-329 (2020).</li><li>Truzzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermidine-eugenol+supplement+preserved+inflammation-challenged+intestinal+cells+by+stimulating+autophagy.">Spermidine-eugenol supplement preserved inflammation-challenged intestinal cells by stimulating autophagy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 24 (4), 4131 (2023).</li><li>Truzzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+supplements+safe?+Effects+of+gallic+and+ferulic+acids+on+in+vitro+cell+models.">Are supplements safe? Effects of gallic and ferulic acids on in vitro cell models.</a> Nutrients. 12 (6), 1591 (2020).</li><li>Buckley, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualisation+of+multiple+tight+junctional+complexes+in+human+airway+epithelial+cells.">Visualisation of multiple tight junctional complexes in human airway epithelial cells.</a> Biological Procedures. Online. 20, 3 (2018).</li><li>Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+necessity+of+and+strategies+for+improving+confidence+in+the+accuracy+of+western+blots.">The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots.</a> Expert Review of Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

Burada sunulan temel yeniden yapılandırılmış bağırsak mukozası model sistemi (Şekil 6), fizyolojik karmaşıklığı (fibroblastlar ve monositler içeren ECM açısından zengin lamina propria desteğine sahip bir Caco-2 tek tabakası içeren fizyolojik olarak daha ilgili 3D hücre kültürleri) deneysel basitlikle (standartlaştırılmış ve kolayca tekrarlanabilir sistem üretmek için ticari insan hücre hatlarını kullanarak) birleştirir13. Bu nedenle,...

Farklı tipte epitel hücreleri içeren tek hücre kalınlığında bir iç astar olan bağırsak epitel bariyeri, vücudun dış ve iç ortamı arasındaki ilk fiziksel savunma bariyerini veya arayüzünü oluşturur 1,2. Kolumnar tip enterositler, epitel hücrelerinin en bol bulunan tipini oluşturur. Bunlar, bariyer sıkılaştırmada önemli bir rol oynayan sıkı bağlantılar (TJ'ler) dahil olmak üzere çeşitli bariyer bileşenleri arasındaki etkileşimler yoluyla epitelyal bariyer bütünlüğünün korunmasından sorumludur 1,3. TJ yapısı, komşu hücreleri sıkıca birbirine bağlayan fermuar benzeri bir yapı oluşturan oklüdinler, kladinler ve eklemsel adezyon molekülleri (JAM'ler) dahil olmak üzere transmembran proteinlerle işbirliği yapan zonula okludens (ZO) ve singulin gibi hücre içi plak proteinlerinden oluşur 3,4. Transmembran proteinler, küçük bileşiklerin pasif paraselüler difüzyonunu düzenler ve toksik büyük molekülleri dışlar.
Potansiyel olarak toksik gıda bileşikleri ve gıda kontaminantları, epitel geçirgenliğini bozan, bağışıklık hücrelerini aktive eden ve kronik bağırsak dokusu iltihabına neden olan inflamatuar sitokin üretimini uyarır 5,6,7. Buna karşılık, çeşitli antioksidan ve antienflamatuar fitokimyasalların, inflamatuar sitokin ekspresyonunu azalttığı ve TJ protein ekspresyonunun ve montajınınrestorasyonu yoluyla bağırsak TJ bariyer bütünlüğünü arttırdığı bildirilmiştir 4,6,8. Bu nedenle, hem yararlı hem de zararlı bileşikler tarafından epitelyal bariyer bütünlüğünün düzenlenmesi, farmasötik tarama ve toksisite çalışmaları için bağırsak bariyerini taklit etmeyi amaçlayan hem in vivo hem de in vitro modellerin kullanımında bir artış görmüştür. Bu, deneysel modellerde simüle edilebilen bağırsak bağırsak hastalıkları (IBD), nekrotizan enterokolit ve kanserin patofizyolojisini anlamaya yönelik artan ilgi göz önüne alındığında özellikle önemlidir 8,9,10.
Hayvan testlerinde "3R" hedefine ulaşmak için hücre bazlı in vitro modellerin geliştirilmesine yönelik bir talep olmuştur. Bunlar, hayvanların kullanımına alternatif alternatifler, kullanılan hayvan sayısının azaltılması ve sıkıntıyı hafifleten yöntemlerin benimsenmesinde iyileştirmeyi içerir 11,12,13. Ayrıca, insan ve fare modelleri (kemirgenler en yaygın kullanılan türlerdir) arasındaki altta yatan moleküler, hücresel ve fizyolojik mekanizmalar ayırt edicidir ve fare modellerinin insan tepkilerinde öngörücü olarak etkinliği konusunda tartışmalara yol açar12,13. İn vitro insan hücre hattı modellerinin sayısız avantajı arasında hedef kısıtlamalı deney, doğrudan gözlem ve sürekli analizyer alır 13.
İki boyutlu (2D) kültürlerdeki tek hücre tipi tek katmanlar güçlü modeller olarak hizmet etmiştir. Bununla birlikte, bunlar insan dokularının fizyolojik karmaşıklığını tam olarak yeniden üretemez 8,13,14. Sonuç olarak, yeni nesil risk değerlendirme araç kutuları olarak hem sağlıklı hem de hastalıklı bağırsak dokularının fizyolojik karmaşıklığını özetlemek için sürekli artan iyileştirmelerle 3D kültür sistemleri geliştirilmektedir13,14. Bu modeller, hem hücre hatlarını hem de organoidleri (hem sağlıklı hem de hastalıklı dokulardan elde edilen) kullanan çeşitli hücre hatları, organoid kültürleri ve mikroakışkan cihazlara (çip üzerinde bağırsak) sahip 3D Transwell iskelelerini içerir8,13,14.
Bu çalışmada sunulan 3 boyutlu "sağlıklı doku" bağırsak eşdeğeri protokolü, fizyolojik karmaşıklık ve deneysel basitlik arasında bir denge kurmaya dayanmaktadır13. Model, üç hücre hattından (destekleyici bir bağışıklık bileşeni [U937 monositleri ve L929 fibroblastları] ile enterositler [altın standart kolon adenokarsinomu Caco-2 hattı]) oluşan bir 3D Transwell iskelesini temsil eder, standartlaştırılmış ve kolayca tekrarlanabilir bir sistem oluşturur. Protokol, sabit bağırsak eşdeğerleri kullanılarak epitelyal bariyer bütünlüğünün hafif mikroskobik değerlendirmesi için parafin yerleştirmeyi içerir. Mevcut yaklaşımın avantajı, gömülü dokuların çok sayıda bölümünün tek bir deneyden birden fazla parametre için boyanabilmesidir.

basic three-dimensional (3d) intestinal model system with an immune component

İnflamatuar bağırsak hastalıklarının patofizyolojisini incelemek, potansiyel olarak yararlı maddelerin farmakolojik taraması ve potansiyel olarak zararlı gıda bileşenleri üzerinde toksisite çalışmaları yapmak için in vivo ve in vitro bağırsak modellerinin kullanımında bir artış olmuştur. Konuyla ilgili olarak, hayvan modellerinin yerini almak için hücre bazlı in vitro modellerin geliştirilmesine yönelik mevcut bir talep vardır. Burada, hücre hatlarını kullanan temel, "sağlıklı doku" üç boyutlu (3D) bağırsak eşdeğeri modeli için bir protokol, hem deneysel basitlik (standartlaştırılmış ve kolayca tekrarlanabilir sistem) hem de fizyolojik karmaşıklık (U937 monositleri ve L929 fibroblastlarının destekleyici bir bağışıklık bileşenine sahip Caco-2 enterositleri) sağlamanın ikili yararı ile sunulmaktadır. Protokol ayrıca, sabit bağırsak eşdeğerlerinin ışık mikroskobik değerlendirmesi için parafin yerleştirmeyi de içerir, böylece tek bir deneyden birden fazla görsel parametreyi analiz etme avantajı sağlar. Hematoksilen ve eozin (H&E) ile boyanmış kesitler, Caco-2 kolumnar hücrelerinin kontrol tedavilerinde sıkı ve düzenli bir tek tabaka oluşturduğunu gösteren deneysel bir sistem olarak modelin etkinliğini doğrulamak için kullanılmıştır. Glüteni pro-inflamatuar bir gıda bileşeni olarak kullanarak, bölümlerden analiz edilen parametreler arasında azaltılmış tek tabaka kalınlığının yanı sıra altta yatan matristen (H & E) bozulma ve ayrılma, oklüdin boyamadan (istatistiksel olarak ölçülebilir) gösterildiği gibi sıkı bağlantı protein ekspresyonunun azalması ve farklılaşma 14 (CD14) boyama kümesinden ve CD11b ile ilişkili makrofajlara farklılaşmadan kanıtlandığı gibi göç eden U937 hücrelerinin bağışıklık aktivasyonu. Bağırsak iltihabını simüle etmek için lipopolisakkarit kullanılarak gösterildiği gibi, ölçülebilen ek parametreler, fiksasyondan önce ortamdan ekstrakte edilebilen artmış mukus boyaması ve sitokin ekspresyonudur (midkin gibi). Temel üç boyutlu (3D) bağırsak mukoza modeli ve sabit kesitler, birden fazla görsel ölçülebilir parametreyi analiz etme imkanı ile inflamatuar durum ve bariyer bütünlüğü çalışmaları için önerilebilir.

The intestinal epithelial barrier, a one-cell-thick internal lining containing different types of epithelial cells, constitutes the first physical defensive barrier or interface between the outside and the internal milieu of the body1,2. Columnar-type enterocytes constitute the most abundant type of epithelial cells. These are&#160;responsible for maintaining epithelial barrier integrity through interactions between several barrier components, including tight junctions (TJs), playing a significant role in barrier tightening1,3. The TJ structure consists of intracellular plaque proteins, such as zonula occludens (ZO) and cingulin, cooperating with transmembrane proteins, including occludins, claudins, and junctional adhesion molecules (JAMs) that form zipper-like structure tightly linking the neighboring cells3,4. The transmembrane proteins regulate the passive paracellular diffusion of small compounds and exclude toxic large molecules.
Potentially toxic food compounds and food contaminants stimulate inflammatory cytokine production that disrupts the epithelial permeability, activating immune cells and causing chronic intestinal tissue inflammation5,6,7. In contrast, various anti-oxidant and anti-inflammatory phytochemicals have been reported to reduce inflammatory cytokine expression and enhance intestinal TJ barrier integrity through the restoration of TJ protein expression and assembly4,6,8. Hence, the regulation of epithelial barrier integrity by both beneficial and harmful compounds has seen an increase in the use of both in vivo and in vitro models aimed at mimicking the intestinal barrier for pharmaceutical screening and toxicity studies. This is particularly relevant given the increasing interest in understanding the pathophysiology of intestinal bowel diseases (IBD), necrotizing enterocolitis, and cancer, which can be simulated in experimental models8,9,10.
There has been a demand for the development of cell-based in vitro models in order to achieve the objective of the &#8220;3Rs&#8221; in animal testing. These include replacement alternatives to the use of animals, reduction in the number of animals used, and refinement in adopting methods that alleviate distress11,12,13. Moreover, the underlying molecular, cellular, and physiological mechanisms between human and murine models (rodents being the most widely used species) are distinctive, leading to controversy regarding the efficacy of the murine models as predictors in human responses12,13. Numerous advantages of in vitro human cell-line models include target-restricted experimentation, direct observation, and continuous analysis13.
Single-cell-type monolayers in two-dimensional (2D) cultures have served as powerful models. However, these cannot precisely reproduce the physiological complexity of human tissues8,13,14. As a result, 3D&#160;culture systems are being developed with ever-increasing improvements to recapitulate the physiological complexity of both healthy and diseased intestinal tissues as next-generation risk assessment toolboxes13,14. These models include 3D Transwell scaffolds with diverse cell lines, organoid cultures, and microfluidic devices (intestine-on-chip) using both cell lines and organoids (derived from both healthy and diseased tissues)8,13,14.&#160;
The 3D &#8220;healthy tissue&#8221; intestinal equivalent protocol presented in the present study was based on striking a balance between physiological complexity and experimental simplicity13. The model is representative of a 3D Transwell scaffold, comprised of three cell lines (enterocytes [the gold-standard colon adenocarcinoma Caco-2 line] with a supporting immune component [U937 monocytes and L929 fibroblasts]), constituting a standardized and easily repeatable system applicable for the preliminary screening of dietary molecules of interest on intestinal epithelial barrier integrity and immune response. The protocol includes paraffin embedding for light microscopic evaluation of epithelial barrier integrity using fixed intestinal equivalents. The advantage of the present approach is that numerous sections of the embedded tissues can be made to stain for multiple parameters from a single experiment.

Yazar Spotlight: 3D İnsan Hücre Hattı Modellerini Kullanarak Bileşiklerin Bağırsak Dokusu Üzerindeki Etkilerinin Araştırılması 

Bağışıklık Bileşenli Temel Üç Boyutlu (3D) Bağırsak Model Sistemi

The scope of the work is to use these in vitro three-dimensional human cell line models to investigate the fact of beneficial as well as helpful compounds on intestinal tissue. The models can be used to further research understanding and also as a basic drug model. Using the plant-derived compounds, spermidine and eugenol, both separately and together in supplement form, we measure beneficial increases in autophagy and decreases in inflammation using these models.Then we will also able to show the potentially harmful effect of gluten extracted from certain wheat varieties on intestinal tissues. We are currently using economically priced, standardized, and easily repeatable in vitro system that better reflect the physiology of the human intestine as an alternative to animal models. Since we also use commercial human cell line rather than plant-derived cells, the responses from the study are more applicable to the general population.The protocol is based entirely on the use of different lines. These renders the model most standardized and reproducible. Furthermore, the simultaneous cultivation of different cell lines, enterocytes, fibroblasts, and immune system cells, allows for cellular responses that are closer to what happens in the patient.

İlk önemli husus, temel 3D bağırsak eşdeğer mukozasının deneysel amaçlar için kabul edilebilirliğini belirlemektir. Bu, histoloji ve histopatoloji laboratuvarlarında en yaygın kullanılan boya olan hematoksilen (nükleer materyali koyu mavi-mor renkte boyar) ve eozin (sitoplazmik materyali pembenin değişen tonlarında boyar) ile gerçekleştirilir. H&E boyaması ilk olarak, deneysel tedavilerle aynı koşullar ve zaman dilimi altında kültürlenen, işlenmemiş bir kontrol üzerinde gerçekleştirilir. H?...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Effects of Compounds on Intestinal Tissue Using 3D Human Cell Line Models at JoVE.com

Burada, sabit bağırsak eşdeğerlerinin ışık mikroskobik değerlendirmesi için temel bir üç boyutlu (3D) bağırsak hücre hattı model sistemi ve bir parafin gömme protokolü oluşturmayı açıklıyoruz. Seçilen proteinlerin boyanması, klinik öncesi ilaç tarama çalışmalarında potansiyel kullanım için tek bir deneyden birden fazla görsel parametrenin analizine izin verir.

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the ...

Çalışmanın kapsamı, bağırsak dokusu üzerinde faydalı ve yararlı bileşiklerin gerçeğini araştırmak için bu in vitro üç boyutlu insan hücre hattı modellerini kullanmaktır. Modeller, daha fazla araştırma anlayışı için ve ayrıca temel bir ilaç modeli olarak kullanılabilir. Bitki kaynaklı bileşikleri, spermidin ve öjenol'ü hem ayrı ayrı hem de birlikte ek formda kullanarak, bu modelleri kullanarak otofajideki faydalı artışları ve inflamasyondaki azalmaları ölçüyoruz.Daha sonra bazı buğday çeşitlerinden elde edilen glütenin bağırsak dokuları üzerindeki potansiyel olarak zararlı etkisini de gösterebileceğiz. Şu anda hayvan modellerine alternatif olarak insan bağırsağının fizyolojisini daha iyi yansıtan, ekonomik fiyatlı, standardize edilmiş ve kolay tekrarlanabilir in vitro sistem kullanıyoruz. Bitki kaynaklı hücrelerden ziyade ticari insan hücre hattını da kullandığımızdan, çalışmadan elde edilen yanıtlar genel popülasyon için daha geçerlidir.Protokol tamamen farklı hatların kullanımına dayanmaktadır. Bunlar, modeli en standart ve tekrarlanabilir hale getirir. Ayrıca, farklı hücre hatlarının, enterositlerin, fibroblastların ve bağışıklık sistemi hücrelerinin aynı anda yetiştirilmesi, hastada olanlara daha yakın hücresel tepkilere izin verir.

basic-three-dimensional-3d-intestinal-model-system-with-an-immune

Research

JoVE Journal

Biology

Basic Three-Dimensional (3D) Intestinal Model System with an Immune Component

718 Görüntüleme.  Alma Mater Studiorum-University of Bologna. Çalışmanın kapsamı, bağırsak dokusu üzerinde faydalı ve yararlı bileşiklerin gerçeğini araştırmak için bu in vitro üç boyutlu insan hücre hattı modellerini kullanmaktır. Modeller, daha fazla araştırma anlayışı için ve ayrıca temel bir ilaç modeli olarak kullanılabilir. Bitki kaynaklı bileşikleri, spermidin ve öjenol'ü hem ayrı ayrı hem de birlikte ek formda kullanarak, bu modelleri kullanarak otofajideki faydalı artışları ve inflamasyondaki azalmaları ...

Video: Yazar Spotlight: 3D İnsan Hücre Hattı Modellerini Kullanarak Bileşiklerin Bağırsak Dokusu Üzerindeki Etkilerinin Araştırılması 

There has been an increase in the use of in vivo and in vitro intestinal models to study the pathophysiology of inflammatory intestinal diseases, for the pharmacological screening of potentially beneficial substances, and for toxicity studies on potentially harmful food components. Of relevance, there is a current demand for the development of cell-based in vitro models to substitute animal models. Here, a protocol for a basic, &#8220;healthy tissue&#8221; three-dimensional (3D) intestinal equivalent model using cell lines is presented with the dual benefit of providing both experimental simplicity (standardized and easily repeatable system) and physiological complexity (Caco-2 enterocytes with a supporting immune component of U937 monocytes and L929 fibroblasts). The protocol also includes paraffin embedding for light microscopic evaluation of fixed intestinal equivalents, thereby providing the advantage of analyzing multiple visual parameters from a single experiment. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) stained sections showing the Caco-2 columnar cells forming a tight and regular monolayer in control treatments are used to verify the efficacy of the model as an experimental system. Using gluten as a pro-inflammatory food component, parameters analyzed from sections include reduced monolayer thickness, as well as disruption and detachment from the underlying matrix (H&#38;E), decreased tight junction protein expression as shown from occludin staining (quantifiable statistically), and immune-activation of migrating U937 cells as evidenced from the cluster of differentiation 14 (CD14) staining and CD11b-related differentiation into macrophages. As shown by using lipopolysaccharide to simulate intestinal inflammation, additional parameters that can be measured are increased mucus staining and cytokine expression (such as midkine) that can be extracted from the medium prior to fixation. The basic three-dimensional (3D) intestinal mucosa model and fixed sections can be recommended for inflammatory status and barrier integrity studies with the possibility of analyzing multiple visual quantifiable parameters.

Here we describe constructing a basic three-dimensional (3D) intestinal cell line model system and a paraffin embedding protocol for light microscopic evaluation of fixed intestinal equivalents. Staining of selected proteins permits the analysis of multiple visual parameters from a single experiment for potential use in preclinical drug screening studies.

Biyoloji

Preparation of a Basic 3D Reconstructed Intestinal Mucosa Model for Microscopic Evaluation of Fixed Intestinal Equivalents

To begin, select a 24-well plate containing inserts with 0.4 micron filters. Using a pipette, add 500 microliters of HBSS below and above the filter inserts. Then close the multi-well plate and place it in an incubator for two hours.After incubation, carefully aspirate the HBSS from the plate. Prepare a cell-free collagen solution in a sterile 50 milliliter tube in DMEM on ice. Add 250 microliters of collagen above the membrane filter and place the lid on the plate.Allow the solution to polymerize at room temperature. Next, remove the L-929 fibroblast cell culture from the incubator. Add two milliliters of a pre-warmed trypsin EDTA solution to the flask and place it in an incubator for three to five minutes.Transfer the cell suspension to a sterile 15 milliliter tube and centrifuge at 645 G for five minutes. Using a vacuum pump, aspirate the supernatant and resuspend the pellet in one milliliter of DMEM. Add 20 microliters of cell suspension into a tube containing 20 microliters of Trypan Blue solution.And use a cell counting chamber to evaluate the cell density. Next, remove the U-937 monocyte cell culture from the incubator. Centrifuge the cell suspension and resuspend the pellet in one milliliter of RPMI.After ensuring cells are homogeneously suspended, count them using a cell counting chamber. Next, prepare cell suspensions containing 50, 000 L-929 and 15, 000 U-937 cells respectively in 50 microliters of DMEM. Add each 50 microliter cell suspension to 450 microliters of collagen and mix thoroughly.Overlay the pre-coded cell-free lamina propria with 500 microliters of the collagen cell solution. Close the plate and place it in an incubator for two hours to allow the solution to set. Next, remove the Caco-2 cell culture from the incubator.Using a vacuum pump, aspirate the medium and rinse the cells with 10 milliliters of PBS. Add five milliliters of PBS trypsin EDTA solution and place it in an incubator for five to eight minutes. Then centrifuge the cell suspension and resuspend the pellet in one milliliter of DMEM.After counting, prepare a cell suspension containing 150, 000 Caco-2 cells in 50 microliters of DMEM. Place the plate in a laminar flow hood for 10 minutes before transferring it to the incubator. After 30 minutes, add 500 microliters of the DMEM above the reconstructed model and 500 microliters below the filter and return the plate to the incubator.The next day, carefully replace the medium with 500 microliters of fresh DMEM above and below the filter respectively.

Sabit İntestinal Eşdeğerlerin Mikroskobik Değerlendirilmesi için Temel 3D Rekonstrükte İntestinal Mukoza Modelinin Hazırlanması

Paraffin Embedding of a Basic 3D Reconstructed Intestinal Mucosa Model for Immune-Histochemical Staining

For paraffin embedding of cells, set the paraffin machine to 58 degrees Celsius. Using pliers, transfer the membrane inserts to clean wells of a sterile 24-well plate. Add 500 microliters of 37%buffered formalin and PBS above the filter, and one milliliter below the filter.Close the lid and leave the plate in a fume hood for two hours. Once the lamina propria is detached from the membrane insert, transfer the intestinal mucosa into a beaker containing 25 milliliters of 35%ethanol, and incubate for 10 minutes. After dehydration in increasing ethanol concentrations, place the samples in 50 milliliters of xylene or a histological clearing agent for 10 to 20 minutes.Once the samples are transparent, place them in a metal tissue cassette holder and submerge them in liquid paraffin inside a heated machine. After 45 minutes, use a microtome to cut four micron sections. Place the cut section on the slides and dry them in an oven at 37 degrees Celsius for 24 hours.An acceptable 3-D intestinal equivalent mucosa model consists of Caco-2 cells formed in a tight and regular monolayer above the extracellular-matrix-rich lamina propria. Unacceptable models include those showing excessive growth, disorganized epithelial layers, malformation or lack of epithelial layer formation. The proinflammatory effect of wheat protein with a high gluten content disrupted the cellular monolayer and reduced the thickness of the epithelial layer compared to the control group.The occludin protein content was significantly higher in the control group than in the group exposed to gluten protein. CD14 and CD11b staining of U937 monocytes showed that wheat protein with a high gluten content activated the monocytes, and induced their migration and differentiation into macrophages. Under the lipopolysaccharide challenge, Caco-2 cells increased mucus production and the release of the inflammatory marker midkine.