Kardiyovasküler Çalışmalar için Murin Aort ve Mezenterik Arterlerden İzole Edilen Vasküler Duvarda Yerleşik CD34⁺ Kök Hücrelerin Manyetik Olarak Ayrılması

Başlamak için, aortun dış tabakasını ve anestezi uygulanmış fareden izole edilen mezenterik arterlerin ilk dalını izole edin ve kültürleyin. Hücreler% 80 birleştiğinde, ayrışmış hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300G'de santrifüjleyin, süpernatanı tamamen atın ve hücre peletini toplam 10 milyon hücre başına 98 mikrolitre ayırma tamponunda yeniden süspanse edin. CD34 antikorunun eklenmesinden sonra, hücreleri karanlıkta dört santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Hücreleri yıkamak için, hücrelere iki mililitre ayırma tamponu ekleyin ve 10 dakika boyunca 300G'de santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, hücreleri 80 mikrolitre ayırma tamponunda yeniden süspanse edin. Daha sonra hücre süspansiyonuna 20 mikrolitre Anti-FITC MicroBeads ekleyin.

Hücreleri daha önce gösterildiği gibi yıkadıktan ve santrifüjledikten sonra, hücreleri bir mililitre ayırma tamponunda yeniden süspanse edin. Ardından, bir ayırıcının manyetik alanı içine bir manyetik ayırma sütunu yerleştirin ve sütunun altına bir toplama tüpü yerleştirin. 500 mikrolitre tampon ile duruladıktan sonra, hücre süspansiyonunu kolona yükleyin ve toplama tüpünde etiketsiz hücreler içeren akışı toplayın.

Kolonu ayırıcıdan çıkarın ve 15 mililitrelik yeni bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Kolona 500 mikrolitre ayırma tamponu yerleştirin ve manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri temizlemek için pistonu kolona itin.