Başlamak için, 16S rNA geninin V4 hiperdeğişken bölgesini amplifiye etmek için spesifik primerler 515f ve 806r kullanın. Verilen koşulları kullanarak PCR gerçekleştirin. Daha sonra, tüpe 3.5 mikrolitre dizileme tamponu ve 1.5 mikrolitre enzim karışımı ekleyin.
Numuneyi karıştırdıktan ve döndürdükten sonra, bir termosikler reaksiyonu ayarlayın. Şimdi, adaptör ligasyon karışımını tüpe ekleyin ve bir termocycler'da 20 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Ligasyon karışımına 1.5 mikrolitre urasil spesifik uzatma reaktif enzimi ekleyin ve 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.
Şimdi, adaptör ligasyon DNA'sına 43.5 mikrolitre manyetik boncuk ekleyin ve 20 kez karıştırın. Beş dakika sonra, boncuk ayırma için tüpü beş ila 10 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatanı atın. Peleti 100 mikrolitre% 80 etanol ile yıkayın ve boncukları 30 saniye kurutun.
Boncukları pelet halinde elüte etmek için, tüpe 8.5 mikrolitre 10 milimolar Tris HCl ekleyin ve iki dakika inkübe edin. Tüpü manyetik bir rafa yerleştirin ve 7.5 mikrolitre çıkarılmış DNA'yı süpernatan olarak yeni bir tüpe çıkarın. 25 mikrolitrelik bir reaksiyon oluşturmak için adaptörle bağlanmış DNA içeren tüpe PCR reaktifleri ekleyin.
Amplifiye edilmiş DNA'yı temizlemek için, tüpe 22,5 mikrolitre manyetik boncuk ekleyin ve 20 kez karıştırın. Beş dakika sonra, 50 mikrolitre süpernatanı çıkarın ve boncukları 100 mikrolitre% 80 etanol ile yıkayın. Koyu kahverengi boncukları 16 mikrolitre suda tekrar süspanse edin ve 20 kez karıştırın.
Tüpü 30 ila 60 saniye boyunca manyetik rafa yerleştirin ve 15 mikrolitreyi yeni bir tüpe aktarın. 90 mikrolitre tampon, bir mikrolitre boya ve iki mikrolitre DNA kütüphanesi örneğini karıştırın ve bir florimetredeki DNA konsantrasyonunu okuyun. DNA'yı iki nanomolar ile seyrelttikten sonra, 27 ila 30 mikrolitre akış hücresi yükleyin ve sıralayıcıya yerleştirin.
Sıralayıcıdan alınan FASTQ dosyalarını kaydedin. Bir e-tablo dosyasını açmak ve eşleme veya meta veri dosyası oluşturmak için tıklayın. Nephele web sitesini açın, FASTQ dosyalarını yükleyin ve QC End QIIME2, Filtreleme ve Kırpma Gerçekleştir'i okuyun.
Ardından, DADA2'yi kullanarak, çoğullamadan arındırılmış eşleştirilmiş uç okumaları, filtre değiştirme, kimera hataları ve birleştirme işlemlerini yürütün. %97 benzerlikte bakteri taksonomik ataması gerçekleştirmek için Silva sürüm 132 %99 operasyonel taksonomik birim veya OTU veritabanı üzerinde eğitilmiş Naive Bayes sınıflandırıcısını kullanın. MicrobiomeDB web sitesini açın.
Dosyaları yüklemek ve OTU alfa çeşitliliği, beta çeşitliliği, göreceli bolluk ve seyreklik eğrileri oluşturmak için tıklayın. Son olarak, bir elektronik tablo açın ve ısı haritaları, Venn diyagramları ve doğrusal diskriminant analizi efekt boyutu yapmak için verileri aktarın. Şarap yapımının farklı aşamalarında bakterilerin nispi bolluğuna dayanan bir ısı haritası, Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota ve Fusobacteriota gibi filumların baskınlığını gösterdi.
Cins düzeyinde, Enterobacteriaceae ve Lactobacillaceae gibi önemli cinsler tanımlanmıştır. Bir Venn şeması analizi, üzüm şırasından son şaraba kadar 15 paylaşılan benzersiz OTU'yu ortaya çıkardı. V4 değişken bölgesine dayanan amplikon diziliminin sonuçları, iki traminette R ve L.Beta çeşitlilik analizindeki alfa çeşitliliğinin fermantasyon sırasında bakterilerde bir kayma gösterdiğini, ancak nihai şaraptaki bakteri bileşiminin, şıra ve maya eklenen aşamalardakine benzer olduğunu gösterdi.
