Başlamak için epifloresan mikroskobu kurun. Görüntülemeden önce, Stage Top inkübatörünü önceden 37 santigrat dereceye ısıtın ve haznede dakikada 0,02 litre nemlendirilmiş karbondioksit çalıştırın. Ardından, enfekte olmuş tek tabakalı slaydı inkübatör odasına yerleştirin ve kapağı kapatın.
Parlak alan aydınlatması altında 20X objektifi kullanarak, tek katman içindeki görüş alanlarının X ve Y koordinatlarını seçin. Görüntüleme parametrelerini optimize edin ve 488 nanometrelik bir uyarma dalga boyu kullanarak bir görüntü elde edin. Fototoksisiteyi en aza indirmek için, ışık kaynağını 50 milisaniye pozlama süresiyle %50 güce ayarlayın.
Hiçbir pikselin doygun olmadığından emin olun ve floresan kalsiyum sensörünün tüm dinamik aralığını algılayacak şekilde ayarlayın. Bir görüntüleme döngüsü kurun ve bir dakikalık bir döngüde seçilen her X ve Y koordinatında bir görüntü elde edin ve bu döngüde sürekli görüntü elde edin. Floresan etiketli virüsler için, her 10. döngüde bir uygun kanalda bir görüntü elde edin.
Floresan olmayan virüsler kullanıyorsanız, görüntülemeden sonra amino floresan boyama yapın. İlk olarak, tek katmanları 100 mikrolitre formaldehit ile sabitleyin. İnkübasyondan sonra, fiksatifi çıkarın ve 10 dakika boyunca 100 mikrolitre 50 milimolar amonyum klorür ile söndürün.
Amonyum klorürü çıkardıktan sonra, tek katmanları oda sıcaklığında bir saat boyunca 100 mikrolitre% 0.1 Triton X-100 ile geçirgenleştirin. Sonra çözeltiyi çıkarın, 100 mikrolitre engelleme çözeltisi ekleyin ve bir saat inkübe edin. Daha sonra bloke edici çözeltiyi çıkarın ve 1X PBS'de delüle edilen 100 mikrolitre primer antikor ekleyin.
Hafifçe sallanarak gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, birincil antikorları çıkarın ve 1X PBS ile üç kez yıkayın. Son olarak, 1X PBS'de kandırılan 100 mikrolitre floresan konjuge ikincil antikor ekleyin.
Foto ağartmayı önlemek için, plakayı ışıktan koruyun ve oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra ikincil antikorları çıkarın ve örnekleri DAPI çözeltisi ile boyayın. Ardından sabit tek katmanları görüntüleme için 100 mikrolitre 1X PBS'ye yerleştirin.
Slaytı mikroskop tablasına geri yerleştirin. Canlı görüntüleme çalışmasından X ve Y koordinatlarını yeniden yükleyin ve boyama için kullanılan ikincil antikora karşılık gelen kanaldaki her çok noktalı görüntüyü görüntüleyin. Aynı noktaları yakaladığınızdan emin olmak için canlı görüntüleme çalışmasından elde edilen görüntülere referans verin.
Bu teknik kullanılarak, rotavirüs enfeksiyonu bir hIO tek tabakasında bu tek tabaka puanlandıktan sonra görüntülendi. mRuby gibi floresan proteinleri eksprese eden rekombinant rotavirüs suşları için, canlı görüntüleme sırasında enfeksiyon doğrulandı. Oysa bir belirteç ifade etmeyen bir suş kullanıldığında, görüntüleme sonrası immünofloresan ile enfeksiyon tespit edildi.
