Başlamak için, mikroskop düzeninin optik tablonun yüzeyinde tüm mesafeler doğru bir şekilde ölçülerek hazırlandığından emin olun. Ardından uyarma lazerini masaya monte edin. Lazerin amaçlanan yüksekliğine iki iris ayarlayın ve ışının düz ve ortalanmış olduğundan emin olmak için bu irisleri kullanın.
Çeviri aşamasını veya TS1'i ayna 1 veya M1'in konumuna yerleştirin. İstenen çıkış ışını yolunu tanımlamak ve her bir yansıtıcı elemanın yerleşimini ve hizalamasını yönlendirmek için tam yüksekliğe ayarlanmış süsen çiftini kullanın. Ardından, M1'i TS1'in üstüne yerleştirin. Ardından dikroiği masanın üzerine monte edin ve hizalayın.
Benzer şekilde, galvoyu monte edin ve süsenlerle hizalayın. Hizalamalar yapıldıktan sonra, M2'yi konumlandırın ve ardından M3'ü masaya sıkıştırın. Işın her iki buzlu cam hizalama diskinde kabaca ortalanana kadar yüksekliği ve konumu ayarlayın.
Ardından M3'e destek ekleyin. Ardından, lens 1'i masaya monte etmeye başlayın. Işın M3'ün üzerindeki buzlu cam plakalar üzerinde ortalanana kadar eğimi ve yanal konumu ayarlayın. Mercek 2'yi konumlandırın ve ışını uzak bir yüzeye yansıtmak için bir ayna kullanarak kolimasyonu kontrol edin.
Işını izlemek ve ışının boyutunun değişmediğinden emin olmak için bir dizin kartı veya hedef kullanın. Ardından, iletimi en üst düzeye çıkarmak için XY montajı ile iğne deliğinin x, y konumunu ve eksenel mesafeyi tek boyutlu aşama ile ayarlayın. Uyarma ışınını galvo yüzeyine odaklamak için merceği 4'ü eksenel olarak ayarlayın ve merceği 3'ü masanın üzerine yerleştirin, ardından SL1'i izleyin.
SL1'in eksenel mesafesini, mercek 4 ile sütunlu bir teleskop oluşturacak şekilde ayarlayın, ardından TL1'i SL1'e paralel olarak konumlandırın. Kiriş tavanda havadar bir disk oluşturana kadar kafes sistemindeki objektif 1'in yüksekliğini ayarlayın. Ardından, diskin boyutu küçültülene kadar ayarlamaya devam edin.
Kare aynayı hedef 1'in örnek aşamasına yerleştirin ve dikroikten sonra ışın profilinin boyutu en aza indirilene kadar aynayı eksenel olarak ayarlayın. Kafes çubuklarını iki kafes plakasının boş deliklerine kaydırarak hizalama lazerini monte edin. Hizalama ve uyarma ışınlarının yollarını hizalamak için bir kinematik ayna montajı ve bir açılır ayna kullanın.
Dikroikten sonra ışın profilini en aza indirmek için kare aynayı hedef 1'in s'ye eksenel olarak konumlandırın.tage. SL2 ve TL2'yi ilgili mesafelerde emisyon yoluna yerleştirin. XY düğmelerini ve objektif 2'nin eğimini, kırmızı hizalama ışını iris ve buzlu cam diskten geçecek şekilde ayarlayın.
Işın yüzeyde küçük bir havadar disk oluşturana kadar çeviri aşaması 2'yi ayarlayın ve ardından havadar diskin boyutunu en aza indirmek için çeviri aşaması 2'yi ayarlamaya devam edin. Varyant taramasında galvoyu eğim için optimize etmek için, galvo için bir üçgen dalga sinyali seçmek ve bunu 1 hertz gibi düşük bir frekansa ayarlamak için dalga formu üreteci üzerindeki FSK düğmesine basın. Hizalama ışınını aynı uzak yüzeyde veya duvarda gözlemleyin.
Objektif 3'ü objektif 2'nin yaklaşık 4-5 milimetre önüne 0 derecelik bir açıyla monte edin ve yüksekliği buna uyacak şekilde ayarlayın. Buzlu cam hizalama diskini, bir cetvelle ölçüldüğü gibi SL2 ve TL2 arasındaki paylaşılan odak düzlemine yerleştirin. Emisyon ışığı O3'ün arka açıklığını doldurduğunda, kamera sensörünün pürüzlü konumuna buzlu bir cam disk takın ve diskin merkezini O3'ten çıkan emisyon ışığıyla hizalayın. TL3'ü objektif 3'ün arkasına yerleştirin ve çıkan ışığı buzlu cam diskle hizalamak için eğimi ayarlayın.
Kamerayı tüp lensten ölçülen mesafeye yerleştirin ve delik kameraya odaklanana kadar objektif 3'ü kafes öteleme aşamasından eksenel olarak ayarlayın. Masadaki çizgileri kılavuz olarak kullanarak hedef 3'ü hedef 2'nin optik ekseninden 30 derecelik bir açıyla yeniden ayarlayın. Pozitif ızgara test hedefini aynı eksenel yüksekliğe yeniden monte edin ve ızgarayı parlak alan ışığıyla aydınlatın.
Izgara kareleri tek tip bir boyutu korurken, görüş alanının odak kısmını ekran boyunca yatay olarak tarayın. Eğik ışık tabakasını hizalamak için, ışın CL3'ün odak düzleminde yatay bir tabaka profiline odaklanacak şekilde silindirik lensleri veya CL'yi konumlandırın. CL3 ile lens 3 arasındaki odak düzlemine dikey yönde bir yarık yerleştirin ve yerleştirin.
Kamera sensöründe, 0 derecelik ışık tabakasının ince ve dikey göründüğünü onaylayın. Motorlu öteleme aşaması kontrolünü kullanarak, ışık levhasına açı vermek için M1'i silindirik lenslere doğru çevirin. Önceden hazırlanmış rodamin etiketli mikrotübül test örneğini numune üzerine yerleştirin.ampve boya, görüş alanının merkezi ile ekranın sağ tarafı arasında beş farklı derinlikte ışık tabakası tarafından aydınlatılacak şekilde eksenel olarak ayarlayın.
Ardından her görüntüyü kaydedin. Görüntüleri Fiji'de açın. Her görüntü için, Çizgi aracını kullanarak görüş alanının ortasından ışık sayfasının ortasına doğru yatay bir çizgi çizin.
Ardından Analiz Et'e ve ardından 01'in üzerindeki ışık sayfasının açısını hesaplamak için Arsa Profili'ne gidin. Cihazı kalibre ettikten sonra, önceden hazırlanmış üç boyutlu boncuk örneğini monte edin ve bir üçgen dalga ayarlamak için fonksiyon üretecindeki FSK düğmesine tıklayın. Örneği bulmak için, 20 megahertz frekansından, 400 milivolt tepeden tepe genliğine ve 0.4 ofsetten başlayarak parametreleri ayarlamak için fonksiyon üretecini kullanın.
Örnek düzleme ulaşılana kadar Z'de manuel olarak kaydırın ve Z ayarını optimize edin. Micromanager programında, bir pozlama süresi seçin ve çok boyutlu alım penceresini açın. Aralığı 30 olarak ayarlayın ve kare sayısını seçmek için sayma kutusunu kullanın.
Parametreler ayarlandıktan sonra, birimin tam taraması için bir zaman atlaması kaydedin. Yeniden yapılandırılmış mikrotübül ağının hacimsel taramaları, üç boyutlu yapıların merkeze doğru yoğunlaştığını ve bunun sonucunda parlak floresan bölgelerine neden olduğunu gösterdi. Kapak kaymasının yakınındaki görüntüleme düzlemlerinde, konfokal mikroskopi, yukarıdan gelen odak dışı floresan sinyalleri nedeniyle merkeze doğru ek arka planla Astar'ın çevresindeki tek filamentleri çözdü.
Bununla birlikte, Z'de birkaç mikron hareket ettirmek, Astar'ın odak dışı yoğun bölümleri nedeniyle görüntülerin kalitesini hızla düşürdü. Işık tabakasının tek düzlemli aydınlatması, odak dışı sinyalleri ortadan kaldırarak düzlemler arasında karşılaştırılabilir görüntü kalitesi sağladı.
