Protokolü, uygun şekilde traş edilmiş ve %70 etanol ile dezenfekte edilmiş ötenazi faresi üzerinde bir biyogüvenlik kabini içinde gerçekleştirin. Makas kullanarak hayvanın karnında 0,5 inçlik yüzeysel bir kesi oluşturun. Orta hat boyunca boyuna ve alt karın bölgesine doğru uzunlamasına kesin.
Ek olarak, cildi kanat çırparak açmak için yanal kesimler yapın. Künt forseps kullanarak, hayvanın gövdesinin etrafından dolaşırken, cildi boynun ve alt karın bölgesinin etrafında yanal olarak keserken, cildi çevreleyen dokulardan nazikçe ayırın. Cildi, dermis tarafı aşağı bakacak şekilde 100 milimetrelik bir doku kültürü plakasına dikkatlice yerleştirin.
Ve cildin mümkün olduğunca gergin olduğundan emin olun. Plakaya altı mililitre Dispase solüsyonu ekleyin ve cildin tamamen kaplandığından emin olun. Ardından plakayı örtün.
Plakayı Parafilm ile sarın. Eksplantı düzleştirmek için plakayı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Ertesi gün, bir pipet kullanarak, sıvıyı izole edilmiş cildi içeren plakadan çıkarın.
Daha sonra, forseps yardımıyla, dermisi epidermisten ayırırken, ondan herhangi bir görünür yağ dokusunu çıkarın. Ve izole edilmiş dermisi temiz bir doku kültürü plakasına yerleştirin. Kültür plakasındaki dermise 1X antibiyotik-antimikotik solüsyon içeren bir mililitre DMEM ekleyin.
Sıvıyı plakanın bir tarafında biriktirmek için plakayı eğin. Daha sonra dermisi bir ila iki milimetre karelik parçalar halinde kıyın. Ve bunları 50 mililitrelik yeni bir konik tüpe aktarın.
Tüpe 10 mililitre kollajenaz tip II çözeltisi ekleyin. Dermisi sindirmek için 30 ila 50 rpm'de sürekli çalkalama ile 37 santigrat derecede iki saat inkübe edin. Hücre süspansiyonunu 70 mikronluk bir hücre süzgecinden süzün.
Ve beş dakika boyunca 250g'de santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, peleti antibiyotik-antimikotik çözelti içeren 10 milimetre DMEM içinde yeniden süspanse edin. Daha önce gösterildiği gibi, santrifüjlemeden önce hücre süspansiyonunu 40 mikronluk bir hücre süzgecinden süzün.
Elde edilen hücre peletini bir mililitre tam LEC ortamında yeniden süspanse edin. Ardından, hücreleri kollajen kaplı 60 milimetrelik bir doku kültürü plakasında tam LEC ortamında kaplayın. Hücreleri PBS ile iki kez yıkayarak ve taze LEC ortamı ekleyerek ortamı iki günde bir değiştirin.
Murin dermisinden izole edilen hücrelerin düşük büyütmeli görüntüleri, karışık bir hücre popülasyonu gösterdi.
