Murin Lenfatik Endotel Hücre Saflaştırması

İdrar lenfatik endotel hücrelerini saflaştırmak için, yaklaşık% 80 ila 90 Co-fluency'ye ulaştıktan sonra murin dermisinden izole edilen hücreleri kullanın, bir mililitre manyetik boncuk kaplama çözeltisi kullanarak manyetik bir ayırıcıda önceden kodlanmış manyetik boncukları yıkayarak başlayın. Boncukları% 0.1 BSA içeren 150 mikrolitre DMEM'de tekrar süspanse edin. Daha sonra, 60 milimetre doku kültürü plakasındaki hücreleri PBS ile iki kez yıkayın.

50 mikrolitre antikor konjuge boncukları% 0.1 BSA içeren üç mililitre DMEM ile karıştırın ve hücrelere ekleyin. Çanağı biyofilm ile kapatın, ardından çanağı oda sıcaklığında 10 RPM'de çalkalayan bir çalkalayıcı üzerinde tam olarak 10 dakika inkübe edin. Hücreleri PBS ile bir kez yıkamadan önce ortamı atın.

Plaka üzerinde LEC kolonilerinin varlığını doğrulamak için hücreleri hızlı bir şekilde inceleyin. Hücrelere bir mililitre tripsin EDTA ekleyin ve hücreleri tripsinize etmek için 37 santigrat derecede üç dakika inkübe edin. Hücrelerde başarılı hücre ayrılması olup olmadığını kontrol edin.

Çözeltiyi iki mililitre tam LEC ortamı ile nötralize ettikten sonra. Hücre çözeltisini beş mililitrelik steril bir polipropilen tüpe aktarın. Manyetik bir ayırıcı kullanarak, bağlanmamış hücreleri çıkarmak için hücreleri %0.1 BSA içeren üç mililitre DMEM ile yıkayın.

Kalan boncuk bağlı hücreleri tam LEC ortamında yeniden süspanse edin ve bunları kollajen kaplı 60 milimetre doku kültürü plakalarına yerleştirin. Brightfield ve floresan görüntüleme, saflaştırmadan sonra LYVE1 pozitif lenfatik endotel hücrelerini kolayca tanımladı ve bunlara bağlı birkaç boncuk gösterdi. Hücreler, saflaştırmadan 24 saat sonra düşük birleşme gösterirken, saflaştırmadan yedi gün sonra oldukça akıcı oldular.