Başlamak için, DMSO'da mililitre başına 0.1 miligram konsantrasyonda pozitif bir kontrol görevi gören sentezlenmiş peptidi yeniden süspanse edin. Standart bir eğri oluşturmak için yeniden süspanse edilmiş peptidi biyotinile histon H4 peptidi ile karıştırın. Daha sonra, asetilasyon reaksiyonlarını 96 oyuklu PCR plakalarında iki kopya halinde birleştirin.
20 mikrolitrelik bir reaksiyon, 10 mikrolitre enzim, bir mikrolitre H4 peptit, bir mikrolitre 20X tampon ve bir mikrolitre DTT içermelidir. Her kuyucuğa bir mikrolitre DMSO veya test bileşiği ekleyin. Karıştırmak için karışımı hafifçe pipetleyin.
Daha sonra enzim inhibitörü kompleksleşmesine izin vermek için karışımı buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. Asetilasyon reaksiyonunun devamı için, iki mikrolitre 4-Penten yağ ko-enzimi A'yı dört mikrolitre su ile birleştirin. Bu karışımdan altı mikrolitre kuyucuklara ekleyin.
Hafifçe karıştırdıktan sonra, karışımı oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 300G'de santrifüjleyin. İçeriği 37 santigrat derecede bir saat boyunca kapaklı tüplerde inkübe edin. İçeriği 20 mikrolitre sekiz molar Üre ile söndürün ve daha fazla işleme kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın.
Daha sonra, BSA önceden bloke edilmiş siyah NeutrAvidin kaplı 96 oyuklu plakaların her bir kuyucuğuna 80 mikrolitre PBST pipetleyin. Plakanın kuyucuklarına 40 mikrolitre reaksiyon içeriği ekleyin. Daha sonra standart eğri peptitlerini kalan kuyucuklara kopya halinde pipetleyin.
Bağlanmayı kolaylaştırmak için peptitleri bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında bir saat boyunca hafifçe çalkalayın. Bağlama tamamlandıktan sonra, sıvıyı kuyulardan aspire edin. Kuyuları 200 mikrolitre PBST ile yıkamak için bir plaka yıkayıcı kullanın.
Tıklama reaksiyonu için, THPTA bakır karışımını sudaki sodyum askorbata ve DMSO'daki biyotin azide ekleyin. Her bir kuyucuğa 19 mikrolitre taze karıştırılmış reaktif dağıtın. Plakayı alüminyum folyo ile kapatın.
Sonra bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha önce olduğu gibi yıkamadan önce çözeltiyi kuyulardan aspire edin. Daha sonra, her bir kuyucuğa 100 mikrolitre seyreltilmiş Streptavidin yaban turpu peroksidaz karışımı ekleyin.
Orbital çalkalayıcı üzerinde hafif çalkalama ile oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Amplex Red algılama reaktiflerini birleştirmek için, Amplex Red reaktifine 500 mikrolitre seyreltilmiş hidrojen peroksit pipetleyin. Bu karışımın 50 mikrolitresini 4.5 mililitre sodyum fosfata ekleyin.
Yıkanmış kuyucuklara 100 mikrolitre Amplex Red reaksiyon karışımını pipetleyin. Daha sonra plakayı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ışıktan uzakta inkübe edin. SmartControl yazılımını başlatın ve Plate Out'a tıklayın.
Plaka cihaza aktarıldıktan sonra, Amplex Red simgesine tıklayın ve plaka düzenini değiştirin. Değiştirilen düzeni görmek için Amplex Red simgesine tekrar basın. Ardından düzenden sol üstteki standart kuyuları seçin.
Dosya adını değiştirin, sonra Ayarlamayı Başlat'a basın. Kazanç ayarlandıktan sonra, Ölçümü Başlat'a tıklayın. Gerçek zamanlı ölçümü gözlemlemek için Mevcut Durum'a basın.
Ölçüm sona erdikten sonra sekmeyi kapatın. Ardından üst paneldeki Son Çalıştırmayı Aç'a tıklayın. Mars sekmesine gidin.
Ardından, veri sonuçlarını dışa aktarmak için ana menüden Excel'e Aktar'a basın. A ve C bileşiklerinin, çeşitli seyreltmeler için HAT1 aktivitesini yaklaşık% 100 oranında inhibe ettiği gözlenmiştir.
