Başlamak için, üç set steril 1.7 mililitre tüp ve bir set steril 15 mililitre konik alt tüp etiketleyin. 15 mililitrelik tüp eklerine sahip bir döner kova santrifüjü hazırlayın ve dört santigrat dereceye kadar önceden soğutun. Transfekte edilmiş 293FT hücrelere sahip altı oyuklu hücre kültürü plakasını alın.
Medyayı kuyulardan aspire edin. 250 mikrolitre tripsin-EDTA ekleyin ve hücreler ayrılmaya başlayana kadar 37 derecede inkübe edin. Daha sonra her bir oyuğa bir mililitre %10 FBS takviyeli tahlil ortamı ekleyin ve tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için kuvvetlice pipetleyin.
Bir mililitre hücre süspansiyonunu önceden etiketlenmiş 15 mililitrelik tüplere aktarın. Bu tüplerin her birine bir mililitre %10 FBS takviyeli tahlil ortamı ekleyin ve karıştırmak için beş kez ters çevirin. Daha sonra hemen 20 mikrolitre hücre süspansiyonunu birinci tüp setine aktarın.
Şimdi 15 mililitrelik tüpleri önceden soğutulmuş bir santrifüjde 250 g'da beş dakika santrifüjleyin. 20 mikrolitre tripan mavisi hücre boyasını birinci setteki hücrelerle karıştırın ve bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak sayın. 15 mililitrelik tüpleri santrifüjden çıkardıktan sonra, hücre peletlerinden ortamı aspire edin ve tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için peletleri serumsuz tahlil ortamında yeniden süspanse edin.
384 oyuklu ve altı oyuklu plakalardaki hücreleri yeniden rafine etmek için, homojen bir hücre süspansiyonu için 15 mililitrelik tüpleri birkaç kez ters çevirin ve ikinci ve üçüncü sette 500 mikrolitreyi 1,7 mililitrelik tüplere aktarın. İkiye ayarlamak için 0,5 mikrolitre DMSO ve üçüncü tüp setine 0,5 mikrolitre Halo 618 ligand ekleyin ve iyice karıştırın. DMSO ve ligand-pozitif hücre süspansiyonlarını reaktif rezervuarlarının ayrı kuyularına aktarın.
Her süspansiyonun 40 mikrolitresini 384 oyuklu kültür plakasına aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın. Kalan hücreleri, sonraki western blot analizi için taze altı oyuklu kültür plakalarına aktarın ve hem 384 oyuklu hem de altı oyuklu plakaları gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. 37 santigrat derecede önceden ısıtılmış serumsuz tahlil ortamını alın.
Çözülmüş nanolusiferaz substratını serum içermeyen tahlil ortamında 1:100 oranında seyreltin ve bir reaktif rezervuarına aktarın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, 384 oyuklu kültür plakasının her bir oyuğuna 10 mikrolitre substrat karışımı aktarın. Plakayı bir dakika boyunca yavaşça döndürün.
384 kuyulu plakayı çok modlu bir plaka okuyucuya yerleştirin ve hücreli tüm kuyucuklardan gelen 460 ve 618 nanometre emisyonları kaydedin. Verilen denklemi kullanarak miliBRET birimlerinde araç pozitif ve ligand pozitif için ham BRET oranlarını hesaplayın. Araç pozitif BRET oranını ligand pozitifinkinden çıkararak düzeltilmiş BRET oranını hesaplayın.
Nano-CRAFS259A mutant, BRET sinyalini yaklaşık% 45 ve nano-CRAFS621A mutantı yaklaşık% 25 oranında azaltır.
