Bu proje kısmen Ulusal Kanser Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden ZIA BC 010329 proje numarası altında federal fonlarla finanse edilmiştir.

NOT: Bu test 293FT hücrelerde gerçekleştirilir. İnsan embriyonik böbrek hücrelerinden türetilen, iyi karakterize edilmiş ve kolayca transfekte edilebilir bir epitel hattı. Bu hücrelerin tek bir birleşik 10 cm'lik kültür kabı tipik olarak 20 oyuklu 6 oyuklu doku kültürü plakalarının tohumlanması için yeterli hücre sağlar. Adım 1-3, biyolojik bir güvenlik kabininde steril teknik kullanılarak gerçekleştirilmelidir.
1. Hücre tohumlama (1. Gün)
NOT: Bu adımda, hücreler doku kültürü kabından/kaplarından ayrılır, sayılır ve 2. adımda transfeksiyon için 6 oyuklu doku kültürü plakalarına ekilir (Şekil 2).
<ol><li>Ortamı 10 cm'lik tabaktaki hücrelerden aspire edin. Hücreleri 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve aspire edin.</li>
	<li>1 mL tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ekleyin ve hücreleri tabaktan ayırmak için 37 ° C'de 3-5 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Tripsini nötralize etmek için hücrelere 9 mL tam Dulbecco'nun modifiye kartal ortamını (DMEM) ekleyin ve homojen bir tek hücre süspansiyonu oluşturmak için tekrar tekrar yukarı ve aşağı pipetleyin.</li>
	<li>Hemen 20 μL hücreyi 1.7 mL'lik bir tüpe aktarın ve 20 μL tripan mavisi lekesi ile karıştırın. Otomatik bir hücre sayacı (Malzeme Tablosu) veya hemositometre kullanarak hücreleri sayın.</li>
	<li>Hücreleri tam DMEM ortamında 2 x 105 hücre / mL'ye seyreltin ve 6 oyuklu bir doku kültürü plakasının (4 x 105 hücre / oyuk) her bir oyuğuna 2 mL ekleyin. Hücreleri gece boyunca 37 ° C ve% 10 CO2'de inkübe edin. NOT: 20x'ten daha az geçiş yapmış 293FT hücrelerin kullanılması önerilir. Daha önce, daha büyük geçiş sayılarına sahip hücrelerin kullanılmasının, BRET oranlarının azalmasına ve kuyudan kuyuya sinyal değişkenliğinin artmasına neden olabileceğini bulmuştük.</li>
</ol>2. Hücre transfeksiyonu (2. Gün)
NOT: Burada hücreler, pCDNA3.1 boş vektörü ile birlikte pCMV5-NanoLuc-CRAF ve pCMV5-14-3-3ζ-Halo ekspresyon yapıları ile transfekte edilir (Şekil 2).
<ol><li>Transfeksiyondan önce, N-BRET plazmitlerini 5 ng / μL'ye ve pCDNA3.1'i 100 ng / μL'ye seyreltin ve bir dizi steril 1.7 mL tüp numaralandırın.</li>
	<li>Her tüpe 5 ng pCMV5-NanoLuc-CRAF, 10 ng pCMV5-14-3-3ζ ve 200 ng PCDNA3.1 ile birlikte 100 μL transfeksiyon ortamı (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.</li>
	<li>2 μL transfeksiyon reaktifi ekleyin (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın) ve karıştırmak için hafifçe girdaplayın. Tüm sıvının tüplerin dibinde toplandığından emin olmak için tüpleri bir mikrosantrifüjde kısa bir süre döndürün ve ardından yaklaşık 25 ° C'de 15 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Transfeksiyon komplekslerini hücrelere damla damla ekleyin ve Halo ve Nano etiketli proteinlerin eksprese edilmesini sağlamak için 16-20 saat boyunca 37 °C /% 10 CO2'de inkübe edin. NOT: Boş bir vektör (pCDNA3.1) taşıyıcı DNA'nın eklenmesi, N-BRET ekspresyon yapılarının yüksek transfeksiyon verimliliğini elde etmek için gereklidir. Boş vektör eklenememesi, 14-3-3ζ-Halo ve Nano-CRAF proteinlerinin ekspresyon seviyelerinin azalmasına neden olur ve daha önce tartışıldığı gibi zayıf ve tutarsız BRET oranlarına neden olur22.</li>
</ol>3. Hücre yeniden kaplaması (3. Gün)
NOT: Bu adımda, hücreler 384 oyuklu bir plakaya ve Halo 618 ligandına (+ligand; Malzeme Tablosu) veya 4. adımda BRET emisyonlarını okumak için DMSO (+araç) eklenir. Kalan hücreler, Adım 5'te western blot analizi için taze 6 oyuklu kültür plakalarına aktarılır (Şekil 2).
<ol><li>Aşağıdaki malzemeleri toplayın ve çalışma alanını aşağıda anlatıldığı gibi hazırlayın.<ol><li>37 °C'lik bir su banyosu kullanarak, hem serumsuz Tahlil Ortamı hem de %10 FBS takviyeli Tahlil Ortamı ile birlikte önceden ısıtılmış tripsin-EDTA (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın).</li>
		<li>Ölçülecek numune sayısına bağlı olarak, üç set steril 1,7 mL tüp (Set 1-3) ve bir set steril 15 mL konik alt tüp ön etiketleyin. Döner kovalı bir santrifüjü 15 mL tüp ekleri ile donatın ve 4 °C'ye kadar önceden soğutun.</li>
		<li>Doku kültürü başlığına aşağıdaki öğeleri yerleştirin: reaktif rezervuarları, 384 oyuklu doku kültürü plakaları, 6 oyuklu doku kültürü plakaları, çok kanallı bir pipet ve uçlar, hücre sayma slaytları/odaları ve tripan mavisi lekesi (Malzeme Tablosu), 1,7 mL tüp Setleri 1-3 ile birlikte.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücreleri aşağıda açıklandığı gibi toplayın ve sayın.<ol><li>Ortamı 6 oyuklu plakalardan aspire edin ve hücrelere 250 μL tripsin-EDTA ekleyin. 6 oyuklu plakaları, hücreler ayrılmaya başlayana kadar (3-5 dakika) 37 ° C'de inkübe edin.</li>
		<li>Tripsini nötralize etmek için her bir oyuğa 1 mL %10 FBS takviyeli tahlil ortamı ekleyin ve tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleyin.</li>
		<li>1 mL hücre süspansiyonunu önceden etiketlenmiş 15 mL'lik tüplere aktarın. 15 mL'lik tüplerin her birine 1 mL daha %10 FBS takviyeli tahlil ortamı ekleyin.</li>
		<li>Karıştırmak için tüpleri 5x ters çevirin ve hemen 20 μL hücre süspansiyonunu tüp Set 1'e aktarın.</li>
		<li>Önceden soğutulmuş salıncak kova santrifüjünde ~ 250 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Santrifüjleme aşaması sırasında, 20 μL tripan mavisi hücre boyasını tüp seti 1'deki hücrelerle karıştırın ve ardından otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak hücreleri sayın. 6-8 x 105 hücre / mL'lik bir verim tipiktir.</li>
		<li>15 mL'lik tüpleri santrifüjden çıkarın ve ortamı hücre peletlerinden aspire edin. Hücre peletlerini serumsuz tahlil ortamında 2 x 105 hücre / mL'ye yeniden süspanse edin ve tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için kuvvetlice pipetleyin. NOT: Serum içermeyen Tahlil Ortamının kullanımı, normal hücre sinyal yollarını susturmak için kullanılır.</li>
	</ol></li>
	<li>384 oyuklu ve 6 oyuklu plakalardaki hücreleri aşağıda açıklandığı gibi yeniden plakalayın.<ol><li>Homojen bir hücre süspansiyonu sağlamak için 15 mL'lik tüpleri birkaç kez ters çevirin ve 500 μL'yi 1.7 mL'lik tüplere set 2 ve set 3'e aktarın.</li>
		<li>Set 2'ye 0,5 μL DMSO (+araç) ve tüp seti 3'e 0,5 μL Halo 618 ligandı (+ligand) ekleyin ve karıştırmak için pipetleyin.</li>
		<li>+Araç ve + ligand hücresi süspansiyonlarını reaktif rezervuarlarının ayrı kuyularına aktarın. Çok kanallı pipeti (Malzeme Tablosu) kullanarak, reaktif rezervuarlarından 40 μL + araç hücresi süspansiyonunu 384 oyuklu kültür plakasının dört katlı kuyularına aktarın. +ligand hücresi süspansiyonları için bu adımı tekrarlayın.</li>
		<li>Kalan hücreleri taze 6 oyuklu kültür plakalarına aktarın. 384 oyuklu ve 6 oyuklu plakaları gece boyunca 37 °C ve% 5 CO2'de inkübe edin.</li>
	</ol></li>
</ol>4. BRET emisyonlarının okunması (4. Gün)
NOT: Bu adımda, nanolusiferaz substratı (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız) 384 oyuklu kültür plakasındaki hücrelere eklenir ve N-BRET alıcısı (618 nm) ve donör (460 nm) emisyonları okunur (Şekil 2). Düzeltilmiş BRET oranları daha sonra hesaplanır.
<ol><li>Serumsuz tahlil ortamını 37 °C'lik bir su banyosunda önceden ısıtın ve nanolusiferaz substratını 25 °C'de çözün. Nanolusiferaz substratını serum içermeyen tahlil ortamında 1:100 oranında seyreltin ve bir reaktif rezervuarına aktarın. 384 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 10 μL artı %10-15 ekstra hacim eklemek için bu karışımdan yeterince hazırlayın.</li>
	<li>Çok kanallı bir pipet (Malzeme Tablosu) kullanarak, 10 μL substrat karışımını 384 oyuklu kültür plakasındaki hücreleri içeren oyukların her birine aktarın. Plakayı manuel olarak veya bir orbital çalkalayıcı kullanarak 1 dakika boyunca yavaşça döndürün.</li>
	<li>384 kuyulu plakayı çok modlu plaka okuyucuya yerleştirin ve hücre içeren tüm kuyucuklar için 460 nm ve 618 nm emisyonları kaydedin. NOT: Bu adım için kullanılan çok modlu plaka okuyucu için (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın), 6.5 sn okuma süresi ölçümü ile 0.1 mm'lik bir okuma yüksekliği kullanılmıştır, ancak diğer plaka okuyucular kullanılıyorsa daha fazla optimizasyon gerekebilir.</li>
	<li>Aşağıdaki denklemi kullanarak +araç ve +ligand için ham BRET oranlarını miliBRET birimleri (mBU) cinsinden ayrı ayrı hesaplayın: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66436/66436eq01.jpg" style="margin: auto;"></li>
	<li>+Araç BRET oranını +Ligand'ınkinden çıkararak düzeltilmiş BRET oranını hesaplayın (Ek Tablo 1). NOT: Birden fazla deneyin sonuçlarını karşılaştırırken, düzeltilmiş BRET oranları bir araya getirilebilir ve Nano-CRAFWT ve 14-3-3ζ WT-Halo'dan oluşan Wildtype (WT) N-BRET çiftinin ortalamasına normalleştirilebilir (Ek Tablo 1).</li>
</ol>5. Protein ekspresyon seviyelerinin doğrulanması (4. ve 5. günler)
NOT: Bu adımda, 6 oyuklu plakalardaki hücreler parçalanır ve Nano-CRAF ve 14-3-3ζ-Halo proteinlerinin protein ekspresyon seviyeleri, Halo ve Nano etiketlerine özgü antikorlar kullanılarak western blot analizi ile belirlenir. (Şekil 2).
<ol><li>NP40 lizis tamponuna (Malzeme Tablosu) proteaz ve fosfataz inhibitörleri ekleyin ve numune başına 200 μL lizis tamponuna izin verin.</li>
	<li>Hücre içeren 6 oyuklu plakalardan ortamı aspire edin. Hücreleri bir kez 1 mL soğuk PBS ile yıkayın ve aspire edin.</li>
	<li>Her bir oyuğa 125 μL NP40 lizis tamponu ekleyin ve hücreleri parçalamak için 6 oyuklu plakaları 4 ° C'de sallanan bir platformda 15 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Lizatları buz üzerinde 1.7 mL'lik tüplere aktarın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjleyin. Temizlenmiş lizatları tekrar buzun üzerine yerleştirin ve Bradford veya Biskinkoninik asit (BCA) tahlilleri gibi ticari olarak mevcut tahlilleri kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin.</li>
	<li>Uygun hacimde lizat ve NP40 lizis tamponunu taze 1.7 mL'lik tüplere toplam 100 μL hacme aktararak tüm numunelerdeki protein konsantrasyonunu normalleştirin.</li>
	<li>5x protein numune tamponunu (Malzeme Tablosu) 1 dakika kaynatın ve her numuneye 25 μL ekleyin. Numuneleri 5-6 dakika kaynatın ve ardından tüm numunenin tüpün tabanında toplandığından emin olmak için tüpleri kısa bir süre santrifüjleyin.</li>
	<li>Çift protein jellerinin (Jel 1 ve Jel 2) her bir oyuğuna 25 μL numune yükleyin ve daha sonra proteinleri, daha önce tarif edildiği gibi standart western blotlama prosedürlerini kullanarak nitroselüloz veya PVDF membranlarına aktarın22.</li>
	<li>Membranları 30 dakika boyunca 25 ° C'de% 3 BSA-PBS'de bloke edin ve daha sonra membranları gece boyunca Halo antikoru (1: 1.000 seyreltme; Jel 1) ve nanolusiferaz veya CRAF antikoru (1:500 seyreltme; Jel 2) tris tamponlu salin içinde,% 0.2 Tween-20 (TBST; Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Membranları 10 mL TBST'de 5 dakika boyunca 1x yıkayın ve daha sonra TBST'de 1: 10.000 oranında seyreltilmiş anti-fare HRP ikincil antikoru ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.</li>
	<li>Membranları 3x sallanan bir platformda 10 mL TBST'de 25 ° C'de her biri 5 dakika boyunca yıkayın. TBST'yi çıkarın ve ECL reaktifleri ve bir X-ışını film işlemcisi veya başka bir uygun görüntüleme sistemi kullanarak protein bantlarını görselleştirin.</li>
</ol>

CRAF-14-3-3 BRET Tabanlı Bir Yaklaşım Kullanılarak Canlı Hücrelerde Etkileşim Analizi

<ol>
	<li>Blasco, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-Raf,+but+not+B-Raf,+is+essential+for+development+of+K-Ras+oncogene-driven+non-small+cell+lung+carcinoma.">c-Raf, but not B-Raf, is essential for development of K-Ras oncogene-driven non-small cell lung carcinoma.</a> Cancer Cell. 19, 652-663 (2011).</li><li>Blasco, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+regression+of+advanced+pancreatic+ductal+adenocarcinomas+upon+combined+inhibition+of+EGFR+and+C-RAF.">Complete regression of advanced pancreatic ductal adenocarcinomas upon combined inhibition of EGFR and C-RAF.</a> Cancer Cell. 35, 573-587 (2019).</li><li>Karreth, F. A., Frese, K. K., DeNicola, G. M., Baccarini, M., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-Raf+is+required+for+the+initiation+of+lung+cancer+by+K-Ras(G12D).">C-Raf is required for the initiation of lung cancer by K-Ras(G12D).</a> Cancer Discov. 1, 128-136 (2011).</li><li>Lito, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+CRAF-mediated+MEK+activation+is+required+for+effective+MEK+inhibition+in+KRAS+mutant+tumors.">Disruption of CRAF-mediated MEK activation is required for effective MEK inhibition in KRAS mutant tumors.</a> Cancer Cell. 25, 697-710 (2014).</li><li>Sanclemente, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-RAF+ablation+induces+regression+of+advanced+Kras/Trp53+mutant+lung+adenocarcinomas+by+a+mechanism+independent+of+MAPK+signaling.">c-RAF ablation induces regression of advanced Kras/Trp53 mutant lung adenocarcinomas by a mechanism independent of MAPK signaling.</a> Cancer Cell. 33, 217-228 (2018).</li><li>Razzaque, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+gain-of-function+mutations+in+RAF1+cause+Noonan+syndrome.">Germline gain-of-function mutations in RAF1 cause Noonan syndrome.</a> Nat Genet. 39, 1013-1017 (2007).</li><li>Pandit, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+RAF1+mutations+cause+Noonan+and+LEOPARD+syndromes+with+hypertrophic+cardiomyopathy.">Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Nat Genet. 39, 1007-1012 (2007).</li><li>Terrell, E. M., Morrison, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ras-mediated+activation+of+the+Raf+family+kinases.">Ras-mediated activation of the Raf family kinases.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 9 (1), 033746 (2019).</li><li>Kondo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+a+dimeric+B-Raf:14-3-3+complex+reveals+asymmetry+in+the+active+sites+of+B-Raf+kinases.">Cryo-EM structure of a dimeric B-Raf:14-3-3 complex reveals asymmetry in the active sites of B-Raf kinases.</a> Science. 366, 109-115 (2019).</li><li>Park, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+autoinhibited+and+active+BRAF-MEK1-14-3-3+complexes.">Architecture of autoinhibited and active BRAF-MEK1-14-3-3 complexes.</a> Nature. 575 (7783), 545-550 (2019).</li><li>Tzivion, G., Luo, Z., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dimeric+14-3-3+protein+is+an+essential+cofactor+for+Raf+kinase+activity.">A dimeric 14-3-3 protein is an essential cofactor for Raf kinase activity.</a> Nature. 394, 88-92 (1998).</li><li>Spencer-Smith, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RASopathy+mutations+provide+functional+insight+into+the+BRAF+cysteine-rich+domain+and+reveal+the+importance+of+autoinhibition+in+BRAF+regulation.">RASopathy mutations provide functional insight into the BRAF cysteine-rich domain and reveal the importance of autoinhibition in BRAF regulation.</a> Mol Cell. 82, 4262-4276 (2022).</li><li>Martinez Fiesco, J. A., Durrant, D. E., Morrison, D. K., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+BRAF+monomer-to-dimer+transition+mediated+by+RAS+binding.">Structural insights into the BRAF monomer-to-dimer transition mediated by RAS binding.</a> Nat Commun. 13, 486 (2022).</li><li>Freeman, A. K., Ritt, D. A., Morrison, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+Raf+dimerization+in+cell+signaling.">The importance of Raf dimerization in cell signaling.</a> Small GTPases. 4, 180-185 (2013).</li><li>Freeman, A. K., Ritt, D. A., Morrison, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Raf+dimerization+and+its+inhibition+on+normal+and+disease-associated+Raf+signaling.">Effects of Raf dimerization and its inhibition on normal and disease-associated Raf signaling.</a> Mol Cell. 49, 751-758 (2013).</li><li>Rushworth, L. K., Hindley, A. D., O'Neill, E., Kolch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+role+of+Raf-1/B-Raf+heterodimerization.">Regulation and role of Raf-1/B-Raf heterodimerization.</a> Mol Cell Biol. 26, 2262-2272 (2006).</li><li>Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+and+mutant+B-RAF+activate+C-RAF+through+distinct+mechanisms+involving+heterodimerization.">Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization.</a> Mol Cell. 20, 963-969 (2005).</li><li>Tran, N. H., Wu, X., Frost, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-Raf+and+Raf-1+are+regulated+by+distinct+autoregulatory+mechanisms.">B-Raf and Raf-1 are regulated by distinct autoregulatory mechanisms.</a> J Biol Chem. 280, 16244-16253 (2005).</li><li>Chong, H., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Raf+through+phosphorylation+and+N+terminus-C+terminus+interaction.">Regulation of Raf through phosphorylation and N terminus-C terminus interaction.</a> J Biol Chem. 278, 36269-36276 (2003).</li><li>Cutler, R. E., Stephens, R. M., Saracino, M. R., Morrison, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoregulation+of+the+Raf-1+serine/threonine+kinase.">Autoregulation of the Raf-1 serine/threonine kinase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 9214-9219 (1998).</li><li>Park, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+a+RAS/RAF+recruitment+complex.">Cryo-EM structure of a RAS/RAF recruitment complex.</a> Nat Commun. 14, 4580 (2023).</li><li>Spencer-Smith, R., Morrison, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+measuring+BRAF+autoinhibition+in+live+cells+using+a+proximity-based+NanoBRET+assay.">Protocol for measuring BRAF autoinhibition in live cells using a proximity-based NanoBRET assay.</a> STAR Protoc. 4, 102461 (2023).</li><li>Clark, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=14-3-3+zeta+negatively+regulates+raf-1+activity+by+interactions+with+the+Raf-1+cysteine-rich+domain.">14-3-3 zeta negatively regulates raf-1 activity by interactions with the Raf-1 cysteine-rich domain.</a> J Biol Chem. 272, 20990-20993 (1997).</li><li>Machleidt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoBRET--A+novel+BRET+platform+for+the+analysis+of+protein-protein+interactions.">NanoBRET--A novel BRET platform for the analysis of protein-protein interactions.</a> ACS Chem Biol. 10, 1797-1804 (2015).</li><li>Hekman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+C-Raf+phosphorylation+and+14-3-3+protein+binding+in+response+to+growth+factor+stimulation:+differential+roles+of+14-3-3+protein+binding+sites.">Dynamic changes in C-Raf phosphorylation and 14-3-3 protein binding in response to growth factor stimulation: differential roles of 14-3-3 protein binding sites.</a> J Biol Chem. 279, 14074-14086 (2004).</li><li>Hatzivassiliou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth.">RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Nature. 464, 431-435 (2010).</li><li>Bondzi, C., Grant, S., Krystal, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+the+measurement+of+Raf-1+kinase+activity.">A novel assay for the measurement of Raf-1 kinase activity.</a> Oncogene. 19, 5030-5033 (2000).</li><li>Spencer-Smith, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+RAS+function+through+targeting+an+allosteric+regulatory+site.">Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site.</a> Nat Chem Biol. 13 (1), 62-68 (2016).</li><li>Roy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=14-3-3+facilitates+Ras-dependent+Raf-1+activation+in+vitro+and+in+vivo.">14-3-3 facilitates Ras-dependent Raf-1 activation in vitro and in vivo.</a> Mol Cell Biol. 18, 3947-3955 (1998).</li><li>Durrant, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high-throughput+NanoBRET+screening+platform+to+identify+modulators+of+the+RAS/RAF+interaction.">Development of a high-throughput NanoBRET screening platform to identify modulators of the RAS/RAF interaction.</a> Mol Cancer Ther. 20, 1743-1754 (2021).</li></ol>

Açıklanacak bir şey yok.

Önceki çalışmalar, 14-3-3 proteinlerinin RAF kinazların hem aktivasyonunda hem de inhibisyonunda kritik rol oynadığını göstermiştir. Bu bağlanma olaylarının nasıl düzenlendiğini ve bu etkileşimleri modüle etmenin RAF sinyalizasyonu ve RAF güdümlü onkogenez üzerindeki etkilerini anlamak, CRAF fonksiyonunu hedef alan yeni terapötik güvenlik açıklarını ortaya çıkarabilir. Bununla birlikte, Raf aktivasyon döngüsü, çok sayıda ilişkili protein, translasyon sonrası modifikasyonlar ve hücre...

RAF kinazlar (ARAF, BRAF ve CRAF), RAS, GTPazların doğrudan efektörleri ve pro-proliferatif / pro-hayatta kalma yanlısı RAF-MEK-ERK kinaz kaskadının başlatıcı üyeleridir. Son çalışmalar, CRAF ekspresyonunun küçük hücreli dışı akciğer kanseri ve pankreas duktal adenokarsinomu 1,2,3,4,5 dahil olmak üzere KRAS kaynaklı çeşitli kanserlerin tümörijenezinde anahtar bir rol oynadığını göstermiştir. Ayrıca, germline CRAF mutasyonları, RASopati'nin özellikle şiddetli bir formu olan Noonan sendromunaneden olur 6,7. CRAF regülasyonunu anlamak, hücrelerdeki işlevini hedefleyen başarılı terapötik yaklaşımlar geliştirmek için kritik öneme sahiptir.
Tüm RAF kinazlar, aktivitesini kontrol eden bir C-terminal katalitik (CAT) alanı ve bir N-terminal düzenleyici (REG) alanı olmak üzere iki fonksiyonel alana ayrılabilir (Şekil 1A)8. REG alanı, RAS bağlama alanını (RBD), sistein açısından zengin alanı (CRD) ve serin/treonin açısından zengin bir bölgeyi (S/T-zengin) kapsar. Özellikle, S/T açısından zengin bölge, fosforilasyona bağlı bir şekilde 14-3-3'e bağlanan N' bölgesini içerir (CRAF'ta S259; Şekil 1A) 8. CAT alanı, C' bölgesi olarak adlandırılan ikinci bir yüksek afiniteli 14-3-3 yerleştirme bölgesi ile birlikte kinaz alanını kapsar (CRAF'ta S621; Şekil 1A) 8. Dimerik 14-3-3 proteinlerinin CRD ile birlikte N' ve C' bölgelerine diferansiyel bağlanması, hem RAF aktivasyonunda hem de inhibisyonda kritik rol oynar 9,10,11,12,13. Normal sinyalleşme koşulları altında, RAF aktivasyonu, RAS tarafından plazma zarına alınmasıyla başlatılır ve BRAF-CRAF heterodimerinin baskın aktif form14,15 olduğu aktif dimerler oluşturmasına izin verir. Dimerik BRAF'ın kriyojenik elektron mikroskobu (Cryo-EM) yapıları ile birlikte BRAF ve CRAF ile yapılan biyokimyasal analizler, bir 14-3-3 dimerinin, her iki RAF protomerinin C' bölgesine aynı anda bağlanarak aktif RAF dimerlerini stabilize ettiğini göstermektedir (Şekil 1B)9,13,16,17. Tersine, çalışmalar, hareketsiz koşullar altında, RAF'ın, REG alanının CAT alanına bağlandığı veaktivitesini 12,18,19,20 inhibe ettiği sitozolik, otoinhibe edilmiş bir onay benimsediğini göstermiştir. Bu kapalı durum, REG alanındaki CRD ve N' bölgesine ve CAT alanındaki C' bölgesine bağlı bir 14-3-3 dimer ile stabilize edilir (Şekil 1B)10,13,21. BRAF'ta bu model, otoinhibe edilmiş BRAF monomerlerinin son Cryo-EM yapıları ve önceki biyokimyasal çalışmalarımız 10,12,13,21,22 tarafından desteklenmektedir. Bununla birlikte, 14-3-3'ün CRAF düzenlemesi23'te inhibe edici bir rol oynadığı gösterilirken, BRAF benzeri bir otoinhibe edilmiş durum, CRAF düzenlemesi12'de daha az rol oynayabilir; bu nedenle, 14-3-3 proteinlerinin CRAF aktivitesini düzenlediği mekanizmaları açıklığa kavuşturmak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır. RAF kinazların 14-3-3 aracılı regülasyonu, çok sayıda RAF fosforilasyonu ve fosforilasyon de-fosforilasyon olayı, çeşitli düzenleyici proteinlere bağlanma ve plazma zarı8 ile etkileşimler gerektirir. Bu nedenle, 14-3-3-RAF etkileşimlerinin fizyolojik olarak ilgili koşullar altında ve sağlam bir lipid çift tabakasının varlığında ölçülmesi kritik öneme sahiptir.
Bu sorunu ele almak için, NanoBRET (bundan sonra N-BRET olarak anılacaktır; kit detayları için Malzeme Tablosuna bakınız) teknolojisi, CRAF'ın canlı hücrelerdeki 14-3-3 proteinleri ile etkileşimlerini ölçmek için yakınlık tabanlı bir test geliştirmek üzere kullanılmıştır (Şekil 1C). Bu BRET tabanlı sistem, Halo618 enerji alıcı ligand22,24 ile etiketlemek için bir proteinin bir nanolusiferaz (Nano) donörü ve diğerinin bir Halo etiketi ile etiketlendiği iki ilgilenilen proteinin (POI) etkileşimlerini ölçer. İlgilenilen proteinlerin etkileşimi, vericiden alıcıya enerji transferi ile sonuçlanır ve bu da BRET sinyalini üretir (Şekil 1C). Son derece parlak Nano donör proteini (emisyon (em) 460 nm) ve Halo618 ligandı (em 618 nm), geleneksel BRET'e göre daha fazla spektral ayırma ve hassasiyet sağlar, bu da onu daha zayıf etkileşimleri incelemek ve bağlanmadaki ince değişiklikleri tespit etmek için ideal bir platform haline getirir24. Gerçekten de, daha önce RAF REG ve CAT alanlarının otoinhibitör etkileşimlerini ölçmek için N-BRET tabanlı bir test geliştirdik, bu da BRAF CRD'deki bir RASopati mutasyonları panelinin karakterizasyonu için gerekliydi ve bu alanın otoinhibisyonu sürdürmek ve yapısal BRAF aktivasyonunu önlemek için kritik önemini gösterdik12.
Burada açıklanan tahlil, bir N-terminal Nano etiketine (Nano-CRAF) kaynaşmış CRAF ve C-terminal Halo etiketine (14-3-3ζ-Halo) kaynaşmış 14-3-3'ün zeta izoformunun etkileşimlerini ölçer; Şekil 1C). Nano-CRAF'ın 14-3-3ζ-Halo ile etkileşimlerinin sağlam bir BRET sinyali ürettiğini ve bunun da 14-3-3'ün N' bölgesine (S259A) ve/veya C' bölgesine (S621A) bağlanmasını önleyen mutasyonlar tarafından bozulabileceğini gösteriyoruz. Aşağıdaki protokol, bu testi gerçekleştirmek, optimize etmek ve sorun gidermek için ayrıntılı adımlar sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag&#174; mouse monoclonal antibody</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9211&#160;</td>
			<td>Antibody for detecting HaloTag tagged&#160; proteins by immunoblot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoLuc&#174; mouse monoclonal antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB10026</td>
			<td>Antibody for detecting Nano-tagged proteins by immunoblot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CRAF mouse monoclonal antibody (E10)&#160;</td>
			<td>Santa Crus Biotechnology</td>
			<td>sc-7267</td>
			<td>Antibody directly detecting CRAF proteins by immunoblot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL anti-mouse HRP secondary antibody</td>
			<td>Amersham</td>
			<td>NA931-1ML&#160;</td>
			<td>Secondary HRP conjugated mouse antibody (from sheep)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE&#8482; 9</td>
			<td>Roche/Sigma</td>
			<td>6365809001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBRET&#8482; kit&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N1661&#160;</td>
			<td>NanoBRET kit containing Halo 618 ligand and NanoGlo (nanoluciferase) substrate&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, without Ca++ and Mg++&#160;</td>
			<td>Quality Biologicals&#160;</td>
			<td>114-057-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM cell culture media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995073</td>
			<td>High glucose, L-glutamine, phenol red, sodium&#160; pyruvate; without HEPES, suppliment media with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)&#160;&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;&#160;</td>
			<td>15140163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM&#8482; I reduced serum media&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985062</td>
			<td>For cell transfection&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM reduced serum media, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11058021</td>
			<td>For replating cells on Day 3. Supplement with 2 mM L-glutamine and 100U penicillin-streptomycin, along with 10% FBS (where indicated).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Trypan Blue Stain&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>T10282&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40 lysis buffer&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>20 mM Tris (pH 8.0), 137mM NaCl, 10% glycerol,&#160; NP40 alternative (Milipore, Cat# 492016). Store at 4 degrees C.. Add the following protease and phosphatase immediately prior to use: 20 &#181;M leupeptin, 0.5 mM sodium orthovanidate, 0.15 U/mL, 1mM PMSF.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x gel sample buffer</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>240 mM Tris (pH 8.0), 9.5% SDS, 30% glycerol, 500mM DTT, 3mM bromophenol blue. Store at -20 degrees C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293FT cells (human)</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>R70007&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA vectors&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV5-Nano-CRAF WT and mutant&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMV5-14-3-3&#950;-Halo&#160;&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnVision 2104 Multimode Plate Reader</td>
			<td>PerkinElmer 2104</td>
			<td>2104-0010&#160;</td>
			<td>600LP NanoBRET &#38; M460/50 nm NanoBRET emmisions filters,&#160; Luminescence 404 mirror, 6.5 mm measurement height and 0.1 s measurement time</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Countess&#8482; II Automated Cell Counter&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AMQAX1000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoFisher E1-ClipTip&#8482;&#160; Multichannel&#160; Pipettor&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;&#160;</td>
			<td>4672070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism (version 10.0.3)&#160;</td>
			<td>GraphPad&#160;</td>
			<td>www.graphpad.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoFisher ClipTip Multichannel pipette tips&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>94410153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoir, 25 mL Divided, Sterile&#160;</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1228K16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer 384-well CulturPlate&#8482;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6007680</td>
			<td>White, polystyrene, tissue culture treated&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioluminescence resonance energy transfer (bret)-based assay for measuring interactions of craf with 14-3-3 proteins in live cells

CRAF, RAS GTPazların birincil efektörüdür ve KRAS kaynaklı çeşitli kanserlerin tümör oluşumunda kritik bir rol oynar. Ek olarak, CRAF, gelişimsel RASopati, Noonan sendromuna neden olduğu gösterilen germ hattı mutasyonları için bir sıcak noktadır. Tüm RAF kinazlar, 14-3-3 düzenleyici proteinler için çoklu fosforilasyona bağlı bağlanma bölgeleri içerir. 14-3-3'ün bu bölgelere diferansiyel bağlanması, sinyalleşme koşulları altında plazma zarında aktif RAF dimerlerinin oluşumunda ve hareketsiz koşullar altında RAF otoinhibisyonunun sürdürülmesinde önemli roller oynar. Bu etkileşimlerin nasıl düzenlendiğini ve nasıl modüle edilebileceğini anlamak, RAF fonksiyonunu hedefleyen yeni terapötik yaklaşımları belirlemek için kritik öneme sahiptir. Burada, CRAF'ın canlı hücrelerde 14-3-3 proteinleri ile etkileşimlerini ölçmek için biyolüminesans rezonans enerji transferi (BRET) tabanlı bir testi anlatıyorum. Spesifik olarak, bu tahlil, bir Nano lusiferaz donörüne kaynaşmış CRAF ve bir Halo etiket alıcısına kaynaşmış 14-3-3'ün etkileşimlerini ölçer, burada RAF ve 14-3-3'ün etkileşimi, vericiden alıcıya enerji transferi ve BRET sinyalinin üretilmesi. Protokol ayrıca, bu sinyalin, yüksek afiniteli RAF yerleştirme bölgelerinin her birine 14-3-3 bağlanmasını önlediği gösterilen mutasyonlar tarafından bozulabileceğini göstermektedir. Bu protokol, BRET emisyonlarını okumak, veri analizi yapmak ve protein ekspresyon seviyelerini doğrulamak için ayrıntılı talimatlarla birlikte hücrelerin tohumlanması, transfekte edilmesi ve yeniden kaplanması prosedürlerini açıklar. Ek olarak, optimizasyon ve sorun giderme adımlarıyla birlikte örnek tahlil sonuçları sağlanır.

RAF kinases (ARAF, BRAF, and CRAF) are the direct effectors of RAS GTPases and the initiating members of the pro-proliferative/pro-survival RAF-MEK-ERK kinase cascade. Recent studies have shown that CRAF expression plays a key role in the tumorigenesis of several KRAS-driven cancers, including non-small cell lung cancer and pancreatic ductal adenocarcinoma1,2,3,4,5. Moreover, germline CRAF mutations cause a particularly severe form of the RASopathy, Noonan syndrome6,7. Understanding CRAF regulation is critical for developing successful therapeutic approaches that target its function in cells.
All RAF kinases can be divided into two functional domains, a C-terminal catalytic (CAT) domain and an N-terminal regulatory (REG) domain, that controls its activity (Figure 1A)8. The REG domain encompasses the RAS binding domain (RBD), the cysteine-rich domain (CRD), and a serine/threonine-rich region (S/T-rich). Notably, the S/T-rich region contains the N&#39; site, which binds to 14-3-3 in a phosphorylation-dependent manner (S259 in CRAF; Figure 1A)8. The CAT domain encompasses the kinase domain, along with a second high-affinity 14-3-3 docking site, referred to as the C&#39; site (S621 in CRAF; Figure 1A)8. The differential binding of dimeric 14-3-3 proteins to the N&#39; and C&#39; sites, along with the CRD, plays critical roles in both RAF activation and inhibition9,10,11,12,13. Under normal signaling conditions, RAF activation is initiated by its recruitment to the plasma membrane by RAS, allowing it to form active dimers, of which the BRAF-CRAF heterodimer is the predominant active form14,15. Biochemical assays with BRAF and CRAF, along with cryogenic electron microscopy (Cryo-EM) structures of dimeric BRAF, indicate that a 14-3-3 dimer stabilizes active RAF dimers by binding simultaneously to the C&#39; site of both RAF protomers (Figure 1B)9,13,16,17. Conversely, studies have shown that under quiescent conditions, RAF adopts a cytosolic, autoinhibited confirmation, where the REG domain binds to the CAT domain and inhibits its activity12,18,19,20. This closed state is stabilized by a 14-3-3 dimer bound to the CRD and N&#39; site in the REG domain and to the C&#39; site in the CAT domain (Figure 1B)10,13,21. In BRAF, this model is supported by recent Cryo-EM structures of autoinhibited BRAF monomers and by our previous biochemical studies10,12,13,21,22. However, while 14-3-3 is shown to play an inhibitory role in CRAF regulation23, a BRAF-like autoinhibited state may play a lesser role in CRAF regulation12; therefore further studies are required to clarify the mechanisms by which 14-3-3 proteins regulate CRAF activity. The 14-3-3-mediated regulation of RAF kinases requires a plethora of RAF phosphorylation and de-phosphorylation events, the binding to various regulatory proteins, and interactions with the plasma membrane8. Therefore, it is critical that 14-3-3-RAF interactions are measured under physiologically relevant conditions and in the presence of an intact lipid bilayer.
To address this issue, NanoBRET (from here on referred to as N-BRET; see Table of Materials for kit details) technology was utilized to develop a proximity-based assay for measuring the interactions of CRAF with 14-3-3 proteins in live cells (Figure 1C). This BRET-based system measures the interactions of two proteins of interest (POI), where one protein is tagged with a nanoluciferase (Nano) donor and the other with a Halo tag, for labeling with the Halo618 energy acceptor ligand22,24. Interaction of the proteins of interest results in donor to acceptor energy transfer, which in turn generates the BRET signal (Figure 1C). The extremely bright Nano donor protein (emission (em) 460 nm) and the Halo618 ligand (em 618 nm) provide greater spectral separation and sensitivity over conventional BRET, making it an ideal platform for studying weaker interactions and detecting subtle changes in binding24. Indeed, we previously developed a N-BRET-based assay for measuring the autoinhibitory interactions of the RAF REG and CAT domains, which was essential for the characterization of a panel of RASopathy mutations in the BRAF CRD and demonstrated the critical importance of this domain for maintaining autoinhibition and preventing constitutive BRAF activation12.
The assay described here measures the interactions of CRAF, fused to an N-terminal Nano tag (Nano-CRAF), and the zeta isoform of 14-3-3 fused to C-terminal Halo tag (14-3-3&#950;-Halo; Figure 1C). We show that the interactions of Nano-CRAF with 14-3-3&#950;-Halo generates a robust BRET signal, which can in turn be disrupted by mutations which prevent 14-3-3 binding to the N&#39; site (S259A) and/or the C&#39; site (S621A). The following protocol provides detailed steps for performing, optimizing, and troubleshooting this assay.

Yazar Spotlight: Canlı Hücrelerde RAF Kinaz Regülasyonunu Deşifre Etmek için BRET Tabanlı Tahlillerin ve Nadir Mutasyon Analizinin Entegre Edilmesi

Canlı Hücrelerde CRAF'ın 14-3-3 Proteinleri ile Etkileşimlerinin Ölçülmesi için Biyolüminesans Rezonans Enerji Transferi (BRET) Tabanlı Test

The primary focus of our research is to uncover new vulnerabilities in the Ras-MAPK kinase pathway through the study of rare disease associated mutations within. We recently developed another BRET-based assay for measuring the auto inhibitory activities of RAF kinases in live cells. Importantly, this assay was essential for characterizing a group of rare germline mutations in the BRAF cysteine rich domain, which demonstrated the critical importance of this domain for maintaining BRAF auto inhibition and for preventing constitutive BRAF biological activity.This assay measures the interactions of 1433 proteins with the RAF kinase CRAF, and these interactions play essential roles in mediating RAF function in both development and disease. In addition, this assay combined with previously established assays for measuring RAF auto inhibition and the RAF-RAF interaction form the basis of a toolkit for dissecting the regulatory mechanisms of RAF kinases in live cells.

Bu protokolde açıklandığı gibi gerçekleştirildiğinde (Şekil 2), Nano-CRAFWT ve 14-3-3ζ-Halo'nun etkileşimi, 50-60 mBU'luk düzeltilmiş BRET oranları üretmelidir (Şekil 3A; Ek Tablo 1). CRAF, N' bölgesi ve C' bölgesi olmak üzere iki fosforilasyona bağlı 14-3-3 yerleştirme bölgesi içerir (Şekil 1)8. Bu nedenle, CRAF: 14-3-3ζ bağlanmasını azaltmak için uyg...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Integrating BRET-Based Assays and Rare Mutation Analysis to Decipher RAF Kinase Regulation in Live Cells at JoVE.com

Bu protokol, canlı hücrelerde CRAF kinazın 14-3-3 proteinleri ile etkileşimlerini ölçmek için BRET tabanlı bir testi tanımlar. Protokol, hücrelerin hazırlanması, BRET emisyonlarının okunması ve veri analizi için adımların ana hatlarını çizmektedir. Tahlil optimizasyonu için uygun kontrollerin tanımlanması ve sorun gidermenin yer aldığı örnek bir sonuç da sunulmaktadır.

CRAF is a primary effector of RAS GTPases and plays a critical role in the tumorigenesis of several KRAS-driven cancers. In addition, CRAF is a hotspot ...

Araştırmamızın birincil odak noktası, içindeki nadir hastalıklarla ilişkili mutasyonların incelenmesi yoluyla Ras-MAPK kinaz yolundaki yeni güvenlik açıklarını ortaya çıkarmaktır. Yakın zamanda, canlı hücrelerde RAF kinazların otomatik inhibitör aktivitelerini ölçmek için başka bir BRET tabanlı test geliştirdik. Daha da önemlisi, bu test, BRAF sistein açısından zengin alandaki bir grup nadir germ hattı mutasyonunu karakterize etmek için gerekliydi ve bu alan, BRAF oto inhibisyonunu sürdürmek ve yapısal BRAF biyolojik aktivitesini önlemek için kritik önemini gösterdi.Bu test, 1433 proteinin RAF kinaz CRAF ile etkileşimlerini ölçer ve bu etkileşimler hem gelişimde hem de hastalıkta RAF fonksiyonuna aracılık etmede önemli roller oynar. Ek olarak, bu tahlil, RAF oto inhibisyonunu ve RAF-RAF etkileşimini ölçmek için önceden kurulmuş tahlillerle birleştirildiğinde, canlı hücrelerde RAF kinazların düzenleyici mekanizmalarını incelemek için bir araç setinin temelini oluşturur.

bioluminescence-resonance-energy-transfer-bret-based-assay-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET)-Based Assay for Measuring Interactions of CRAF with 14-3-3 Proteins in Live Cells

640 Görüntüleme.  Medical University of South Carolina. Araştırmamızın birincil odak noktası, içindeki nadir hastalıklarla ilişkili mutasyonların incelenmesi yoluyla Ras-MAPK kinaz yolundaki yeni güvenlik açıklarını ortaya çıkarmaktır. Yakın zamanda, canlı hücrelerde RAF kinazların otomatik inhibitör aktivitelerini ölçmek için başka bir BRET tabanlı test geliştirdik. Daha da önemlisi, bu test, BRAF sistein açısından zengin alandaki bir grup nadir germ hattı mutasyonunu karakterize etmek için gerekliydi ve bu alan,...

Video: Yazar Spotlight: Canlı Hücrelerde RAF Kinaz Regülasyonunu Deşifre Etmek için BRET Tabanlı Tahlillerin ve Nadir Mutasyon Analizinin Entegre Edilmesi

CRAF is a primary effector of RAS GTPases and plays a critical role in the tumorigenesis of several KRAS-driven cancers. In addition, CRAF is a hotspot for germline mutations, which are shown to cause the developmental RASopathy, Noonan syndrome. All RAF kinases contain multiple phosphorylation-dependent binding sites for 14-3-3 regulatory proteins. The differential binding of 14-3-3 to these sites plays essential roles in the formation of active RAF dimers at the plasma membrane under signaling conditions and in maintaining RAF autoinhibition under quiescent conditions. Understanding how these interactions are regulated and how they can be modulated is critical for identifying new therapeutic approaches that target RAF function. Here, I describe a bioluminescence resonance energy transfer (BRET)-based assay for measuring the interactions of CRAF with 14-3-3 proteins in live cells. Specifically, this assay measures the interactions of CRAF fused to a Nano luciferase donor and 14-3-3 fused to a Halo tag acceptor, where the interaction of RAF and 14-3-3 results in donor-to-acceptor energy transfer and the generation of the BRET signal. The protocol further shows that this signal can be disrupted by mutations shown to prevent 14-3-3 binding to each of its high-affinity RAF docking sites. This protocol describes the procedures for seeding, transfecting, and replating the cells, along with detailed instructions for reading BRET emissions, performing data analysis, and confirming protein expression levels. In addition, example assay results, along with optimization and troubleshooting steps, are provided.

This protocol describes a BRET-based assay for measuring the interactions of the CRAF kinase with 14-3-3 proteins in live cells. The protocol outlines steps for preparing the cells, reading BRET emissions, and data analysis. An example result with identification of appropriate controls and troubleshooting for assay optimization is also presented.

Biyokimya

Transfection of 293FT Cells with pCMV5-NanoLuc-CRAF and pCMV5-14-3-3&#950;-Halo Expression Constructs

To begin, take 293FT cells cultured in a 10 centimeter dish, and aspirate the media. Wash cells with five milliliters of PBS. Then add one milliliter of trypsin EDTA, and incubate for 3-5 minutes at 37 degrees Celsius to detach cells from the dish.After incubation, add nine milliliters of complete DMEM to the cells to neutralize the trypsin. Pipette up and down repeatedly to generate a homogenous single cell suspension, and transfer the cells to a 15 milliliter tube. Immediately transfer 20 microliters of cells to a 1.7 milliliter tube, and mix with 20 microliters of trypan blue stain.Count cells using either an automated cell counter or a hemocytometer. Transfer the appropriate volume of cells to a 50 milliliter tube, and dilute in complete DMEM. Add two milliliters of cell suspension to each well of a six-well plate.Incubate cells at 37 degrees Celsius and 10%carbon dioxide overnight. Prior to transfection, dilute nanoluciferase CRAF and 1433 zeta halo plasmids, along with a pCDNA3 empty vector in TE buffer. Label a set of sterile 1.7 milliliter tubes.Add 100 microliters of transfection media to each tube, along with the expression constructs. Now add two microliters of transfection reagent, and vortex gently to mix. Pulse spin the tubes briefly in a microcentrifuge, and then incubate the tubes at around 25 degrees Celsius for 15 minutes to allow transfection complexes to form.Afterwards, add transfection complexes to cells dropwise, and incubate at 37 degrees Celsius for 16-20 hours to express the halo and nanotagged proteins.

293FT Hücrelerin pCMV5-NanoLuc-CRAF ve pCMV5-14-3-3ζ-Halo Ekspresyon Yapıları ile Transfeksiyonu

Preparing 293FT Cells Transfected with pCMV5-NanoLuc-CRAF and pCMV5-14-3-3&#950;-Halo for BRET Emission Assay

To begin, label three sets of sterile 1.7-milliliter tubes and one set of sterile 15-milliliter conical bottom tubes. Prepare a swing bucket centrifuge with 15-milliliter tube inserts and pre-cool to four degrees Celsius. Take the six-well cell culture plate with transfected 293FT cells.Aspirate the media from the wells. Add 250 microliters of trypsin-EDTA and incubate at 37 degrees until cells begin to detach. Then add one milliliter of 10%FBS supplemented assay media to each well and pipette vigorously to create a single-cell suspension.Transfer one milliliter of cell suspension to pre-labeled 15-milliliter tubes. Add one milliliter of 10%FBS supplemented assay media to each of these tubes and invert five times to mix. Then immediately transfer 20 microliters of cell suspension to tube set one.Now centrifuge the 15 milliliter tubes for five minutes at 250 g in a pre-cooled centrifuge. Mix 20 microliters of trypan blue cell stain with cells in set one and count using a cell counter or hemocytometer. After removing the 15-milliliter tubes from the centrifuge, aspirate media from cell pellets and resuspend pellets in serum-free assay media to create a single-cell suspension.To reflate cells in 384-well and six-well plates, invert the 15-milliliter tubes several times for a homogenous cell suspension and transfer 500 microliters to 1.7 milliliter tubes in set two and set three. Add 0.5 microliters of DMSO to set two and 0.5 microliters of Halo 618 ligand to tube set three and mix well. Transfer the DMSO and ligand-positive cell suspensions to separate wells of reagent reservoirs.Use a multi-channel pipette to transfer 40 microliters of each suspension to the 384-well culture plate. Transfer the remaining cells to fresh six-well culture plates for subsequent western blot analysis and incubate both 384-well and six-well plates overnight at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. Take serum-free assay media prewarmed at 37 degrees Celsius.Dilute the thawed nanoluciferase substrate 1:100 in serum-free assay media and transfer it to a reagent reservoir. Using a multi-channel pipette, transfer 10 microliters of substrate mixture to each well of the 384-well culture plate. Gently rotate the plate for one minute.Insert the 384-well plate into a multi-mode plate reader and record the 460 and 618 nanometers emissions from all wells with cells. Calculate the raw BRET ratios for vehicle-positive and ligand-positive in milliBRET units using the given equation. Calculate the corrected BRET ratio by subtracting the vehicle-positive BRET ratio from that of the ligand-positive.The nano-CRAFS259A mutant reduces the BRET signal by approximately 45%and the nano-CRAFS621A mutant by around 25%The double mutant nearly eliminates the BRET signal.