Başlamak için, insan uterus fibroblastlarının% 70 ila 90'lık bir birleşik kültürünü alın. Ortamı şişelerden aspire edin. Hücreleri beş mililitre ılık kalsiyum ve magnezyum içermeyen DPBS ile yıkayın.
DPBS'yi aspire ettikten sonra, her şişeye dört mililitre ılık tripsin EDTA pipetleyin. Hücreler ayrılana kadar hücreleri 37 santigrat derecede üç ila beş dakika inkübe edin. Daha sonra, her şişeye altı mililitre damla ve nötralize edici çözelti ekleyin.
Daha sonra hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Süspansiyonu iyice karıştırmak için bir pipet kullanın ve hücre sayımı için 10 mikrolitrelik bir alikot alın. 10 mikrolitre hücre süspansiyonunu 10 mikrolitre Tripan Blue ile karıştırın.
Lekeli hücre süspansiyonunu hücre sayımı için bir hemositometreye aktarın. Daha sonra hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında beş dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı aspire ettikten sonra, peleti ılık fibroblast ortamında yeniden süspanse edin.
Şimdi bir mikroakışkan organ çipinin bazal kanalını 200 mikrolitre fibroblast ortamı ile yıkayın. Daha sonra apikal kanalı 200 mikrolitre ısıtılmış vajinal epitel ortamı ile yıkayın. Apikal kanal girişine 200 mikrolitre tam vajinal epitel ortamı ekleyin ve çıkışı bir pipet ucuyla kapatın.
Ortamı, giriş ve çıkış ucu hacimleri eşit olana kadar dağıtın. Ardından pipet ucunu pipetten serbest bırakın ve ucu girişte bırakın. İnsan uterus fibroblast hücre süspansiyonunun 50 mikrolitresini yavaşça bazal kanal girişine pipetleyin ve aynı anda çıkıştan aspire edin.
Pipet ucunda yaklaşık iki mikrolitre hücre süspansiyonu kaldığında pipet ucunu girişten çıkarın. Fiş çiplerini 15 mililitrelik bir tüp rafında baş aşağı çevirin. Hücre eki için inkübasyondan sonra çipleri kontrol edin.
Ardından, bazal kanalın çıkışını bir pipet ucuyla takın. Ardından, pipet pistonunu aşağı itmeden bazal kanal girişine 200 mikrolitre fibroblast ortamı ekleyin. Ortamın yerçekimi akışıyla kanaldan çıkış pipet ucuna serbestçe akmasını sağlamak için ucu pipetten serbest bırakın.
Fibroblast tohumlu cipsleri% 5 karbondioksit takviyesi ile gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
