Protein Modelleri Oluşturmak için disiLID İşlevselleştirilmiş Desteklenen Lipid Çift Katmanlarına (SLB'ler) mOrange-Nano Alımı

Başlamak için, bir mikro slayt 18 oyuklu cam alt hazne alın, odanın her bir oyuğuna 150 mikrolitre sodyum hidroksit ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Daha sonra sodyum hidroksit çözeltisini çıkarın ve kuyuları üç ila beş kez deiyonize su ile yıkayın, ardından 10 milimolar kalsiyum klorür içeren tampon ile üç yıkama yapın. Daha sonra, 10 milimolar kalsiyum klorür ile 150 mikrolitre tampon içeren kuyucuklara 15 mikrolitre taze hazırlanmış SUV ekleyin.

Oda sıcaklığında 30 dakikalık inkübasyondan sonra, SLB'leri kalsiyum klorür içermeyen bir tamponla en az yedi kez yıkayın. Biyotinile SLB'lerin streptavidin ile işlevselleştirilmesi için bir streptavidin çözeltisi ekleyin. Daha sonra fazla streptavidini çıkarmak için SLB'leri en az beş kez tamponla yıkayın.

Daha sonra, kuyuya bir mikromolar nihai konsantrasyona b-disiLID ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakikalık inkübasyondan sonra, fazla proteini en az beş kez tampon ile yıkayın. Daha sonra mOrange-Nano'yu 200 nano molar nihai konsantrasyona ekleyin.

Numuneyi alüminyum folyo ile örtün ve karanlıkta tutun. Daha sonra, mikro slaytı floresan mikroskobunun altına yerleştirin. mOrange-Nano'yu görselleştirmek için 552 nanometre lazeri ayarlayın.

Floresan mikroskobu, b-disiLID ile işlevselleştirilmiş SLB'ler üzerinde mOrange-Nano desenli olduğunu ortaya çıkardı. Foto aktivasyondan sonra, ilgilenilen bölgedeki turuncu kanalda floresan sinyalinde hızlı bir artış olur. mOrange-Nano'nun floresansı, her fotoğraf aktivasyonu 120 saniye içinde doygunluğa ulaştıktan sonra artar ve sonraki 120 saniye içinde arka plan seviyelerine düşer.