Başlamak için, keratinosit serumu içermeyen ortama veya KSFM'ye batırılmış özofagus biyopsi örneklerini alın. KSFM'yi bir mililitre Dispas I ile değiştirin ve biyopsileri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Bundan sonra, 1.000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, biyopsilere veya hücre kalıntısı peletine dokunmadan Dispase'yi aspire edin.
Daha sonra biyopsileri DPBS ile durulayın. Biyopsileri santrifüjledikten sonra, süpernatanı aspire etmek için 1.000 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Daha sonra, biyopsilere 500 mikrolitre tripsin-EDTA ekleyin ve 800 rpm'de çalkalarken 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin.
Ardından, tek hücreli bir süspansiyon elde edilene kadar tekrarlanan pipetleme yapın. Bir tüberkülin şırıngasının kauçuk piston kafasını kullanarak, hücreleri 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden süzün. Daha sonra süzgeci iki ila dört mililitre soya fasulyesi tripsin inhibitörü ile yıkayın.
Daha sonra, hücreleri beş mililitrelik, yuvarlak tabanlı bir polistiren tüp üzerinde geçmeli bir kapakla 35 mikrometrelik bir hücre süzgecinden süzün. Hücre süspansiyonunu santrifüjledikten sonra, süpernatanı aspire etmek için 1.000 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Hücre peletini bazal membran ekstraktı hidrojel matrisinde yeniden süspanse edin ve önceden ısıtılmış bir süspansiyon hücre kültürü plakasında 40 mikrolitrelik damlacıklar oluşturun.
Ardından, bazal membran ekstrakt damlacıklarının katılaşmasını sağlamak için plakayı 37 santigrat derecede 20 ila 30 dakika boyunca ortam olmadan inkübe edin. 10 mikro azı dişi Y27632 ile desteklenmiş önceden ısıtılmış KSFM ekleyin. Dokuzuncu günde, organoidin merkezinde büyüyen keratinize bir çekirdekte soğan benzeri çok katmanlı yapı gözlendi.
