Başlamak için, 15 mililitrelik konik bir tüpe bir ila iki mililitre yapışma önleyici durulama solüsyonu pipetleyin. Yüzeyini kaplamak için tüpü döndürün. Daha sonra, yapışma önleyici solüsyonu çıkardıktan sonra tüpe beş mililitre DPBS solüsyonu pipetleyin.
Kaplanmış tüpleri ihtiyaç duyulana kadar kapatın. İnsan bağırsağı organoid kubbelerini içeren bir plakadaki herhangi bir ortamı pipetleyin. Bir mililitrelik bir pipetle, plakadan ayırmak için kubbeye doğrudan bir mililitre soğuk DMEM/F-12 ortamı ekleyin.
Kalan organoidleri hasat etmek için ortamdan bir mililitre daha pipetleyin. Süspansiyonu kaplanmış 15 mililitrelik konik tüplere aktarın. İstenen organoid boyutuna sahip tek tip bir parça süspansiyonu oluşturulana kadar organoidleri parçalamak için süspansiyonu yukarı ve aşağı pipetleyin.
Ardından, saymak için süspansiyonun bir kısmını pipetleyin. Kalan süspansiyonu buzun üzerine yerleştirin. Düz tabanlı 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunun dibine bir XY ızgarası çizin.
Kuyucuklara 50 mikrolitre DPBS pipetleyin. Her bir kuyucuğa beş mikrolitre alikot aktarın. Çapı 50 ila 200 mikrometre olan toplam organoid sayısını manuel olarak sayın.
Ardından, organoid süspansiyonun hacmini hesaplamak için verilen denklemi kullanın. Organoidleri saydıktan sonra, kalan yığın süspansiyonunu içeren tüpten süpernatanı ve bulanık tabakayı çıkarın. Ardından iki mililitre soğuk DMEM/F-12'yi doğrudan peletin üzerine pipetleyin.
Süspansiyonu oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200 G'de santrifüjleyin. Hayvan kaynaklı bir sistem için, 40 mikrolitre soğuk bir hayvandan elde edilen matris organoid pelet ekleyin. Organoidleri matrise dağıtmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.
Matris organoid karışımını steril, önceden ısıtılmış 24 oyuklu bir doku kültürü plakasının merkezine nazikçe aktarın. Kubbe jelleşmesini sağlamak için plakayı 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, inkübasyondan önce kubbeyi rahatsız etmeden kuyu kenarlarına 0.5 mililitre ılık bağırsak organoid büyüme ortamını pipetleyin.
Matris dört kseno içermeyen organoid sistem için, sferoid pelete 50 mikrolitre 3X organoid büyüme ortamı ekleyin. Ardından, seçilen matrisin 100 mikrolitresini dört kseno içermeyen organoidi süspansiyona pipetleyin. 24 oyuklu bir doku kültürü plakasının merkezine 40 mikrolitre hidrojel organoid karışımı ekleyin.
Plakayı 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Kuluçkadan sonra, kuyu kenarları boyunca 0.5 mililitre organoid büyüme ortamı pipetleyin. Daha sonra plakayı tekrar 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit takviyesi ve% 95 nem altında inkübe edin.
