Başlamak için, HEK293T hücrelerini% 10 FBS ile DMEM yüksek glikozlu ortam içeren 10 katmanlı bir Hücre Fabrikasına tohumlayın. Hücreleri, gece boyunca% 5 karbondioksit takviyesi altında% 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. Ardından, 350 mililitre Opti-MEM'i 500 mililitrelik steril bir şişeye koyun.
Transfeksiyon için plazma DNA'sını şişeye ekleyin ve iyice karıştırmak için çalkalayın. Şimdi şişeye 15 mililitre PEI çözeltisi ekleyin. Eşit şekilde karışmasını sağlamak için karışımı 30 saniye kuvvetlice çalkalayın.
Karışımı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe ettikten sonra, bir litrelik bir şişeye aktarın. Sonra 700 mililitre düşük glikozlu DMEM ekleyin. 10 katmanlı Hücre Fabrikasını kuluçka makinesinden çıkarın ve ortamı bir atık kabına vakumlayın.
DNA transfect karışımını dikkatlice Hücre Fabrikasına pipetleyin. Ardından Hücre Fabrikasını 72 ila 96 saat boyunca inkübatöre geri koyun. Üç ila dört gün sonra, arıtılmış süpernatanı 0.45 mikrometrelik bir filtre ünitesinden süzün.
Durulamak için Hücre Fabrikasına 500 mililitre DPBS ekleyin. Dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 4.000 g'da santrifüjleyin. Bir vakum sistemi ve aspirasyonlu bir pipet ile süpernatanı çıkarın ve atın.
Pelete 20 mililitre AAV Lizis Tamponu ekleyin ve peleti tamponda yeniden süspanse etmek için karıştırın. Arınana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Şimdi AAV çözeltisine %40 PEG sodyum klorür çözeltisi ekleyin ve nihai konsantrasyonu %8'e kadar çıkarın.
Karışımı, gece boyunca dört santigrat derecede düşük hızlı bir yörünge döndürücüye yerleştirin. Virüsü çökeltmek için çözeltiyi dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 4.000 g'da santrifüjleyin. Süpernatanı pipetleyin.
Daha sonra pelete beş ila 10 mililitre AAV HEPES Yeniden Süspansiyon Tamponu vardı. Aşağı akış saflaştırmasına devam etmek için süspansiyonu 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Daha sonra, 10 mililitrelik bir şırıngaya takılan 16 gauge uçlu bir iğneyi sabitleyin ve hazırlanan iyodiksanol gradyanlarını yuvarlak tepeli bir polipropilen ultrasantrifüj tüpüne yerleştirin.
22 gauge bir iğne ile, gradyanın üzerine dikkatlice 17 mililitreye kadar AAV çözeltisi ekleyin. Tüpü AAV Diyaliz Tamponu ile doldurun. Tüpleri elektrikli bir sızdırmazlık maddesi ile kapatın.
Tüpleri 350.000 g'da iki saat boyunca dört santigrat derecede bir titanyum rotorda santrifüjleyin. Ardından bunları bir ultrasantrifüj tüp rafına aktarın. Şimdi AAV virüsünü diyaliz kasetine aktarmak için 18 gauge yeni bir iğne kullanın.
Virüsü kasete enjekte ettikten sonra kasetteki havayı çıkarın. AAV Diyaliz Tamponu içeren behere bir karıştırma çubuğu yerleştirin ve bir karıştırma plakasına aktarın. Ardından diyaliz kasetini bir şamandıra şamandırası ile tampona yerleştirin.
Virüsü kasetten santrifüj filtre ünitesine aktarmak için 10 mililitrelik bir şırınga kullanın. Dört santigrat derecede 15 ila 30 dakika boyunca 4.000 g'da santrifüjleyin. Konsantre AAV'yi filtre ünitesinden toplayın.
Ardından filtreyi 300 mikrolitre AAV Diyaliz Tamponu ile durulayın. Son olarak, durulama solüsyonunu konsantre AAV'ye aktarın. İzole edilen AVV virüsünün %90'dan daha yüksek bir saflığa sahip olduğu bulundu ve bu da onu in vivo kullanım için uygun hale getirdi.
