Murin embriyo izolasyonuna başlamadan önce, alanı %70 etanol ile iyice temizleyin. Tüm diseksiyon aletlerinin yıkandığından ve sterilize edildiğinden emin olun. % 10 FBS ve 20 mililitre DPBS içeren beş mililitre steril DMEM elde edin ve bunları buzun üzerine yerleştirin.
Embriyo izolasyonunu gerçekleştirmek için, iletilen bir ışık aşaması ve kamera ile bir stereo mikroskop kullanarak, uygun şekilde ötenazi yapılmış hamile barajını sırtına yerleştirin ve vajinal açıklığın yakınındaki alanı etanol ile sterilize edin. Diseksiyon makası ve cımbız kullanarak, vajinal açıklığın yakınındaki deri kıvrımını kaldırın ve hamile barajın uterusunu yavaşça ortaya çıkaran V şeklinde küçük bir kesi yapın. Daha sonra barajın uterus boynuzunu bir ucunu cımbızla tutarak ve keserek inceleyin.
Rahim ağzını çıkardığınızdan emin olun. Rahim boynuzunu buz üzerinde DPBS içeren 10 santimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Diseksiyon makası ve cımbızla, implantasyon bölgeleri boyunca uterus kasını çıkarın ve içindeki yaprak döken şişlikleri içeren her bir implantasyon bölgesini veya incileri kesin.
Buz üzerinde altı santimetrelik bir Petri kabında taze DPBS'ye yerleştirin. Bir implantasyon bölgesi alın. Stereo mikroskop tablasının üzerine altı santimetrelik yeni bir Petri kabına yerleştirin ve üzerine 500 mikrolitre DPBS ekleyin.
Mikroskobun ve ışık kaynağının odağını ayarlayın. İmplantasyon bölgesini bir elinizle bir cımbız seti ile tutun ve diğer elinizle uterus boynuzundan kesilen implantasyon bölgesinin ucuna yavaşça başka bir forseps çifti yerleştirin ve yavaş yavaş yaprak döken şişliği ortaya çıkarın. Embriyoyu ortaya çıkarmak için, izole edilmiş yaprak döken şişliğin anti yanlış deneme ucunu bir çift forseps ile tutun ve diğer çiftle, yanlış deneme ucundan yaprak döken şişliğin boyutunun yaklaşık dörtte biri kadar yatay bir kesim yapın.
Şimdi, her iki forsepsle, embriyo taze kesilmiş yanlış deneme ucundan çıkana kadar, yaprak döken şişliğin anti yanlış deneme ucundan yavaşça itin. Embriyo ortaya çıktıktan sonra, bağlı olan ekstra embriyonik dokuları çıkarmaya devam edin. Parietal endodermal kese ve ekto plasental koni embriyodan kendiliğinden çıkmazsa, bunları ilişkili herhangi bir maternal kanla birlikte çıkarmak için bir çift forseps kullanın.
Daha sonra embriyoyu bir çift forseps ile tutarken, başka bir çift forseps kullanarak viseral yumurta sarısı torbasını embriyodan yavaşça soyun. Parietal endodermal kese ve ektoplasental koniyi bulun. AP 20 pipet kullanarak, tabaktan en fazla 10 mikrolitre DPBS içeren yumurta sarısı kesesini buz üzerinde sekiz şeritli bir PCR tüpüne aktarın.
Çöp arkadaşlarının evrelemesinin benzer olduğundan emin olmak için yeni izole edilmiş embriyoların parlak alan resimlerini çekin. Bir P200 pipeti ile% 10 FBS içeren 50 mikrolitre DMEM içeren embriyoyu buz üzerinde tutulan 1.5 mililitrelik bir tüpe yavaşça aktarın. Her izolasyon için temiz aletler ve yeni plastikler kullanarak tüm yaprak döken şişlikler için aynısını tekrarlayın.
