Tek Hücreli Dizileme için İzole Gastrülasyon Murin Embriyolarının Hücre Ayrışması

Genotipler doğrulandıktan sonra izole edilmiş murin embriyolarının hücre ayrışmasını gerçekleştirmeye devam edin. Bir P200 pipeti kullanarak, yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe %10 FBS içeren 50 mikrolitre DMEM ekleyin. Aynı genotipe sahip embriyoları yeni tüpe topladıktan sonra, buzun üzerine yerleştirin.

Havuzlanan embriyoların tüpün dibine çökmesine izin verin, daha sonra embriyoları 50 mikrolitre DPBS kullanarak yıkayın ve embriyoları çıkarmadan mümkün olduğunca fazla DPBS'yi çıkarmadan önce yerleşmelerini bekleyin. Daha sonra, havuzlanmış embriyolara 100 mikrolitre tripsin ekleyin ve beş dakika boyunca bir ısı bloğunda 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücrelerin ayrışmasına yardımcı olmak için 1,5 mililitrelik tüpü her 30 saniyede bir hafifçe vurun.

Beş dakika sonra,% 10 FBS içeren 300 mikrolitre DMEM ile tripsini nötralize edin. Embriyoları oda sıcaklığında dört dakika boyunca 100 G'de santrifüjleyin. Elde edilen küçük peleti% 10 FBS ile 40 mikrolitre DMEM'de tekrar süspanse edin ve tüpü buzun üzerine yerleştirin.

Beş mikrolitre hücre süspansiyonunu beş mikrolitre tripan mavisi ile 1,5 mililitrelik yeni bir tüpte karıştırın ve karışımı iyice yukarı ve aşağı pipetleyin. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre sayısını ve canlılığını belirlemek için karışımı bir slayt üzerine aktarın. Son olarak, üreticinin protokolünü izleyerek bir mikroakışkan çip kullanarak tek hücreli bölümlemeye devam edin.