Başlamak için, bir ila iki oranında büyüme faktörü azaltılmış bazal membran matrisi ve organoid kültür ortamı içeren bir kaplama çözeltisi hazırlayın. 48 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 115 mikrolitre kaplama çözeltisi ekleyin ve plakayı nemlendirilmiş bir inkübatörde 30 dakika boyunca 37 santigrat dereceye yerleştirin. Kollajen yöntemi için, 30 milimetrelik bir iç zar ekine bir mililitre kollajen jeli ekleyin ve nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede 30 dakika katılaşmasına izin verin.
Hücresel karışımı hasat etmek için, taze rezeke edilmiş melanom dokusunu, buz üzerine yerleştirilmiş yıkama ortamı içeren 10 mililitrelik bir Petri kabında yıkayın. Steril cımbız kullanarak, tümörü bir sonraki buz üzerinde yıkama için yıkama ortamı olan ikinci bir kaba aktarın. Steril makas ve bir bıçak kullanarak üç durulama döngüsü boyunca fazla bağ dokusunu, yağı ve kalan kanı çıkarın.
Tümörü boş bir Petri kabına koyun ve steril bıçaklarla ince ince kıyın. Daha sonra kıyma dokusunu, hazırlanan sindirim ortamının 10 mililitresini içeren 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Koniği 37 santigrat derecede bir su banyosuna yerleştirin ve her beş dakikada bir girdap yapın.
25 dakika sonra, sindirimi durdurmak için %10 FBS içeren 30 mililitre ADMEM/F12 ortamı ekleyin. Ardından, sindirilmiş hücre süspansiyonunu 70 mikrometrelik bir naylon hücre süzgecinden süzün ve süzgeci takviye edilmiş ADMEM/F12 ile durulayın. Bir pipet kullanarak, filtrenin altında kalan tüm ortamları alın.
Daha sonra hücreleri dört santigrat derecede yedi dakika boyunca 300 x g'da pellet yapın. Süpernatanı attıktan sonra, peleti organoid kültür ortamında yeniden süspanse edin. Kültürleme için, 200 mikrolitre organoid kültür ortamı ile desteklenmiş savaş öncesi matrigel kaplı kuyularda 200.000 hücre tohumlayın.
Alternatif olarak, altı oyuklu bir plakaya yerleştirilmiş önceden katılaşmış kollajen jel zar eki üzerine bir mililitre kollajen jeli ile karıştırılmış 1 milyon hücreyi tohumlayın ve organoid kültür ortamını kuyucuğa ekleyin. 150 ila 200 mikrometre organoidlerin geçişi için, bunları 15 mililitrelik bir koniğe aktarın ve Dulbecco'nun PBS'si ile yıkayın. Karışımı 300 x g'da dört santigrat derecede yedi dakika santrifüjleyin.
Süpernatanı çıkardıktan sonra, organoidleri tripsin ikamesi ile inkübe edin ve her üç dakikada bir karıştırın. Sindirimi durdurmak için,% 10 FBS içeren azaltılmış serum ortamı ile ADMEM / F12 ekleyin. Karışımı yedi dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve damağı organoid kültür ortamında yeniden süspanse edin.
Son olarak, tek hücreli süspansiyonu, inkübasyon için aynı ilk tohumlama yoğunluğunda yeni bir matrigel veya kollajen kaplı kuyucuğa tohumlayın. Matrigel'in sonlarında ikinci ve yedinci günde organoidlerin mikroskopi görüntüleri, organoidlerin boyutunun kademeli olarak arttığını gösterdi. Ek olarak, ebeveyn tümörleri ile matrigel veya kollajen içinde kültürlenen ilgili organoidler arasında alfa-beta-T-hücre oranında istatistiksel olarak anlamlı bir fark yoktu.
