Başlamak için, %60 ila %70 birleşme ile kültürlenmiş U2OS hücrelerini alın ve bunları %0.25 Tripsin-EDTA kullanarak bölün. Yuvarlak 13 milimetre lamel ekleyerek 60 milimetrelik plakalar hazırlayın. Plaka 400.000 hücre, birden fazla 13 milimetre yuvarlak kapak fişi içeren 60 milimetrelik bir plakada.
Ardından, kültür ortamını plakalardan çıkarın. 25 mikromolar etoposit içeren kültür ortamı ekleyin ve hücreleri 20 dakika, 1 saat ve 3 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, ortamı plakalardan çıkarın.
Hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Hücreleri sabitlemek için, kapak kayma yüzeyini kaplayacak kadar hacimde buz gibi soğuk metanol ekleyin ve 20 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Daha sonra lamelleri PBS ile üç kez yıkayın ve bir nem odasına aktarın.
PBS'yi kapattıktan sonra, 30 ila 40 mikrolitre geçirgenlik tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Bundan sonra, kapak fişlerini PBS ile üç kez yıkayın. Ardından, örneklerden PBS'ye dokunun.
Her bir kapak kızağına PLA kitinde verilen 30 ila 40 mikrolitre engelleme solüsyonu ekleyin. Plakayı önceden ısıtılmış bir nem odasında 37 santigrat derecede 1 saat inkübe edin. Şimdi kitte sağlanan antikor seyrelticisindeki birincil antikorları seyreltin.
Bloke etme solüsyonunu çıkardıktan sonra, birincil antikor solüsyonunu her bir kapak kaymasına ekleyin ve gece boyunca bir nem odasında dört santigrat derecede inkübe edin. Antikor seyrelticisindeki eksi ve artı probları bir ila beş arasında seyreltin. Eşek anti-Fare MINUS ile Eşek anti-Goat PLUS ve Eşek anti-Fare EKSI ile Donkey anti-Rabbit PLUS gibi kombinasyonlar kullanın.
Şimdi, birincil antikor solüsyonunu kapatın ve TBST ile bir kez yıkayın. Fazla TBST'yi kestikten sonra, kapak fişlerine 20 mikrolitre PLA prob çözeltisi ekleyin. Daha sonra önceden ısıtılmış nem odasında 37 santigrat derecede 1 saat inkübe edin.
5x ligasyon tamponunu yüksek saflıkta suyla seyreltin. PLA prob solüsyonunu kapatın ve TBST ile bir kez yıkayın. Şimdi, numunelere uygulamadan hemen önce 1:40 seyreltmede ligasyon çözeltisine ligaz ekleyin.
Önceden ısıtılmış nem odasında 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Ardından, 5x amplifikasyon tamponunu yüksek saflıkta suyla seyreltin. Ligasyon solüsyonu numunelerden çıkarıldıktan sonra, numuneleri TBST ile bir kez yıkayın.
Polimerazı, numunelere uygulamadan hemen önce 1:80 seyreltmelerde amplifikasyon çözeltisine ekleyin. Önceden ısıtılmış nem odasında 37 santigrat derecede 100 dakika inkübe edin. Amplifikasyon tamponunu hafifçe vurun, ardından SSC tamponu ile her biri 10 dakika boyunca iki kez yıkayın.
Numuneleri PBS ile iki kez yıkadıktan sonra, birincil antikor solüsyonunu her bir örtü astarına ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, birincil antikor solüsyonunu kapatın ve TBST ile üç kez yıkayın. Daha sonra, ikincil antikor çözeltisini her bir örtü astarına ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
Daha sonra TBST ile beş kez, SSC tamponu ile iki kez ve 0.01x SSC tamponu ile iki kez yıkayın. Son olarak, homojen olmayan inkübasyondan kaynaklanan artefaktları önlemek için farklı kuyulardan veya kapak kayma bölgelerinden görüntüler alın ve tüm kanalları aynı ad deseniyle kaydedin.
