İpekböceklerinde Beslemeye Dayalı RNA Etkileşimi için Kitosan / dsRNA Nanopartiküllerinin Hazırlanması

Başlamak için 0.1 molar sodyum asetat ve 0.1 molar asetik asidi pH 4.5'te deiyonize suda karıştırın. Daha sonra oda sıcaklığında deiyonize suda 100 milimolar sodyum sülfat tamponu hazırlayın. Hacimce ağırlıkça% 0.02'lik bir çözelti hazırlamak için ticarileştirilmiş kitosanı tartın ve hazırlanan 100 milimolar sodyum asetat tamponunda çözün.

Daha sonra 20 mikrogram çift sarmallı RNA veya dsRNA'yı 50 mikrolitre nükleaz içermeyen suda çözün. 100 mikrolitrelik bir dsRNA çözeltisi yapmak için bu çözeltiyi 50 mikrolitre sodyum sülfat tamponuna ekleyin. Daha sonra, hazırlanan kitosan çözeltisinden 100 mikrolitre, dsRNA çözeltisinin her birine 100 mikrolitre ve 50 milimolar sodyum sülfat ekleyin.

Karıştırdıktan sonra, çözeltileri bir dakika boyunca 55 santigrat derecede ısıtın. Nanopartikül oluşumunu kolaylaştırmak için karışımı hemen 30 saniye boyunca yüksek hızda girdaplayın. Beyaz bir pelet elde etmek için karışımı oda sıcaklığında 13.000 G'de 10 dakika santrifüjleyin.

Süpernatanı 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve pelet havasının oda sıcaklığında 10 dakika kurumasını bekleyin. Bir mikro hacim spektrofotometresi kullanarak, süpernatanttaki dsRNA konsantrasyonunu belirleyin. Kapsüllenen dsRNA yüzdesini hesaplamak için, süpernatantta kalan miktarı başlangıçtaki dsRNA miktarına bölün.