Dr Randy Elkins, Robin Kastenmayer, Ted Torrey Dan Pare ve Tovi Lehman el yazmaları eleştirel okuma için teşekkür ederiz. Bu çalışma ve 973 Çin Ulusal Temel Araştırma Programı, # 2007CB513103 İntramural İntramural Araştırma Bölümü Araştırma Programı, Ulusal Enstitüsü Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından da desteklenmiştir. NIAID intramural editörü Brenda Rae Marshall yardım için teşekkür ederim.

Farelere deneysel sonuçların bulandırabilir eksojen enfeksiyöz ajanların yanlışlıkla giriş önlemek için hayvanlar içine yönetilmektedir olacak bütün malzemeleri aseptik teknikler uygulanmalıdır. 1. Kan sahne Sıtma Parazitler Laboratuvar Fare Enfeksiyon <ol><li> Oda sıcaklığında çözünme, dondurulmuş kan sahne sıtma parazitleri içeren iki şişeleri geçilebilir. Bu örnekte, iki kemirgen sıtma paraziti suşları Plasmodium yoelii yoelii ve Plasmodium yoelii nigeriensis. </li><li> Fit bir şırınga ve bir 22-30 gauge (G) iğne ile steril, ilaç sınıf PBS (pH 7.4) 400 mcL hazırlamak. </li><li> Içerik homojen olarak karıştırılmış kadar şırınga kadar ters ve aşağı aynı şırıngayı kullanarak, 100 mcL çözülmüş enfekte kan hazırlamak. (Opsiyonel: Bir pipet enjeksiyon için bir şırınga içine aktarılmadan önce bir toplama tüpüne PBS ve enfekte kan aktarmak için kullanılır olabilir). </li><li> Parazit doğrudan bir fare periton içine solüsyon içeren 200 mcL enjekte edilir. Bittiğinde, kavuz bin şırınga atın. (Laboratuar farelerine bakım için Ek Malzemeleri). Genel olarak, standart inokulum boyutu orijinal dondurulmuş malzeme parazit enfeksiyonları düzeyleri bağlı olarak, 100-500 mcL arasında. </li><li> Iki fareler her geçtiler iki parazit suşları enjekte edilir. Fareler enjeksiyondan sonra 3 ila 5 gün mikroskobik pozitif olacak. % 1-5 arasında parasitemias ulaştığınızda, bir sonraki adıma geçin. </li></ol> 2. Fare Karma Clone Enfeksiyon <ol><li> Karışık klon enfeksiyonu önce, mikroskobik inceleme Giemsa lekeli Kan frotilerinin (Şekil 3) farklı parazit suşları ile enfekte olan iki donör farelerden alınan kuyruk kan toplamak ve kırmızı kan hücre yoğunluğu ölçümü için (ayrıntılı yordamlar için Yardımcı Malzemeler) . </li><li> Daha önce elde edilen parasitemia ve kırmızı kan hücre yoğunluğu ölçümleri kullanarak, serum fizyolojik (% 1.5 w / v trisodyum sitrat dihidrat, 0.85% w / v sodyum klorür) ve inokulum karışımı üretmek için gerekli fare kan hacmi hesaplayın. </li><li> 100μl başına bir milyon bulaşmış kırmızı kan hücrelerinin bir final konsantrasyon parazit çözüm ayarlayın. </li><li> Karışık bir klonu inokulum elde etmek için iki vericilerden 1:1 oranında enfekte kan birleştirin. Iki ebeveyn klonların büyüme hızında farklılık, oranlarını ayarlamak 1:2 veya 1:5 yavaş büyüyen bir ebeveyn klonu ebeveyn hızlı büyüyen bir. </li><li> Enfekte olduğu için her fare periton içine karışık örnek 100 mcL enjekte edilir. (3.9 adım enjekte edilen farelerin sayısını belirlemek için ayrıca bkz.) </li><li> Bu yöntemi kullanarak, tek ebeveyn suşları ile her iki fareleri enfekte. Tek klonu enfeksiyonları iki ebeveyn suşlarının başarılı iletim belirlenmesine olanak sağlayacaktır. </li></ol> 3. Besleme Sivrisinekler <ol><li> 300-500 yetişkin (erkek ve kadın), pupa gelen Anofel stephensi sivrisinekler, her yaş sonrası 5-7 gün ortaya çıkması içeren üç kafesleri hazırlayın. Kapları, plastik ya da metal kapağı güvenli file ile kaplıdır. İki kafesleri ebeveyn klonlar beslemek için; üçüncü kafes genetik bir haç hazırlanması için. </li><li> Karma klonu enfeksiyon dört gün sonra başlayarak, enfekte olmuş fareler Giemsa lekeli ince kan kuyruk smear hazırlamak. </li><li> 1000x büyütme en az 50 mikroskobik alanları tarayarak, bir mikroskop altında smear incelemek ve erkek ve kadın gametocytes mevcut olup olmadığını belirlemek. </li><li> Erkek ve kadın gametocytes büyük vakuol ve büyük granüller (Şekil 3) varlığı nedeniyle dikkatleri üzerine çekiyor. Erkek ve kadın gametocytes sırasıyla, pembe ve mavi sitoplazma var. Gametocytes varsa, 3.6 adım izleyin. </li><li> Gametocytes yok ise, günlük izleme göründükleri kadar tutun. Gametocytes varsa, aşağıdaki adımla devam edin. </li><li> 50 mcL ketamin ve 3 mg / ksilizin ml her enfekte fare (20 gram fare vücut ağırlığı başına) uyutmak için bir fare periton içine 33 mg / ml içeren anestezik ilaç kokteyli enjekte edilir. Final doz ketamin ve ksilizin sırasıyla 82.5 ve 7.5 mg / Kg. </li><li> Fareler 24 saat açlık ve şeker kaynağı sivrisinek kesinti olmadan 30 dakika boyunca beslemek için izin yetişkin Anofel stephensi sivrisinek içeren bir kafesin üstünde yüz aşağı yerleştirin. </li><li> Standart koşullar (laboratuvar sivrisinek bakım için Ek yöntemleri sıcaklığı 24-26 arasında tutulur ° C) altında bir insectary sivrisinek koruyun. </li><li> Her 50-100 dişi sivrisinekler için bir enfekte fare kullanın. Fareler anestezi altında iken, beslenme sonrasında servikal dislokasyon farelerin hemen Euthanize. </li></ol> 4. Diseksiyon Sivrisinek Midguts ve Sayma ookistleri <ol><li> Besleme dokuz gün sonra, sivrisinek, böcek midgut ookistleri için ele alınacaktır. Tek klonu enfekte fareler üzerinde beslenen iki ebeveyn suşlarının bu gametocytes gösterir sivrisinek ookistleri varlığı bulaşıcıdır. </li><li> Bir sivrisinek midgut incelemek için, 5-10 enfekte sivrisinek kafes toplamak için küçük bir kapta bağlı bir aspiratör kullanın. </li><li> CO 2 gazı kullanılarak, sivrisinek uyutmak ve buz üzerinde bir cam petri kabı içine aktarabilirsiniz. Ayrı ve erkek sivrisineklerin atın. Antenler erkeklerde kadınlara oranla belirgin şekilde bushier vardır. </li><li> PBS ile iki şırınga doldurun ve 26 göstergesi yarım inç (G ½) iğne ile bunlara uyan. Mevduat bir cam slayt üzerine bir şırınga PBS yaklaşık 100 mcL. </li><li> PBS damla üzerine aktarın ve 5 ila 10 anestezi dişi sivrisineklerin diseksiyon mikroskobu slayt yerleştirin. </li><li> Aynı iğneler kullanarak, toraks ve arka karın böcek tutan, daha sonra, her bir sivrisinek kanatlarını ve bacaklarını kaldırmak dışında vücudun midgut, beyaz bir kese gibi vücut yayınlandı kadar çekin. Midgut ayırın ve vücudun geri kalanı atın. </li><li> Slaytlar kuru midgut hakkında daha fazla PBS ekleyin. Kurutulmuş izin verirseniz midgut dejenere olacaktır. Midguts üzerinde bir kapak kayma yerleştirin. </li><li> 100x büyütmede ışık mikroskobunda midguts inceleyin. (Şekil 3) her midgut ookistleri sayıları sayma. Ookistleri midguts dış yüzeyinde yer alan kalın duvarlı yuvarlak yapılar olarak dikkatleri üzerine çekiyor. </li><li> Tamamlandığında, şırıngalar, iğneler, ve bir dikiş iğnesi bin slayt atmayın. </li><li> Ookistleri midguts yok ise, yüksek sayıda gametocytes ile enfekte fare ile sivrisinek beslemek ve daha uzun bir beslenme zaman vermek. Sıcaklık bu adım için kritik öneme sahiptir. Sıcaklık 24 - 26 ° C&#39;de ayarlanmış olduğundan emin olun. </li></ol> 5. Santrifüj tarafından Sivrisinekler Sporozoites toplanıyor <ol><li> Aşağıdaki gibi sporozoite toplama tüpleri hazırlayın: 0.5 mL temiz bir santrifüj tüpüne kapağı kesme ve Alevli 19 G iğne kullanılarak tüp dibinde (0.1-0.2 mm çapında) bir delik yumruk. </li><li> 1 / 3 &#39;tüp cam yünü ile doldurun. (~ 100 sivrisinek hasat sporozoites için yeterli bir tüp), 1.5 ml toplama tüpünün içine filtre tüp takın </li><li> Gün 17 Mesaj beslenme, küçük bir kap içine bir aspiratör kullanarak kafesleri sivrisinek (Adım 4) toplamak. </li><li> CO 2 gaz, sivrisinekler uyutmak için kullanın . </li><li> Erkek sivrisineklerin dişileri ayırın. Buz üzerinde bir cam petri kabı konteyner anestezi dişi sivrisinekler aktarın. </li><li> PBS ile dolu, 26 G ½ iğne ile iki şırınga hazırlayın . Mevduat bir cam slayt üzerine bir şırınga PBS yaklaşık 100 mcL. </li><li> Sivrisinekler bir mikroskop lamı üzerine aktarın. Diseksiyon mikroskobu altında sivrisinek &#39;kafa, kanatlar, bacaklar ve karın çıkarın. </li><li> Ince uçlu forseps kullanma, 1.5 ml homojenizatör (havanda) 0.5 ml PBS thoraxes transfer. (Sporozoite 2-3 saat için infektif kalır) thoraxes buz üzerinde saklayın. </li><li> (Bkz. Şekil 3), tükürük bezlerinin sporozoites serbest bırakmak için buz üzerinde thoraxes homojenize ve cam yünü (Adım 5,1-5,2) bir cam pipet kullanarak dolu tüpe ilginçtir (homojenatlarında) aktarmak. </li><li> Oda sıcaklığında 1000 rpm&#39;de 10 ila 20 saniye boyunca santrifüjleyin. </li><li> Toplayın akış yoluyla 22-30 G iğne ile (saflaştırılmış sporozoite süspansiyon) bir şırınga kullanarak. (Opsiyonel: damla 10-50 mcL akış ile mikroskopik bir slayt, bir kapak, 400X büyütme standart bir ışık mikroskobu altında canlı sporozoites kayma ve görselleştirmek yer, ayrıca bkz Şekil 3) </li><li> Fareler (bkz. ref 12 kadar 200.000 parazitler tek bir sivrisinek hasat edilebilir) içine sporozoite süspansiyon ip 0.1-0.5 ml enjekte edilir. Başarılı bir durumda, hayvanın bir enjeksiyondan sonra 72 saat enfekte olacak. </li></ol> 6. Sınırlı Seyreltme kullanarak Klonlama Döl <ol><li> Sporozoite enjeksiyondan sonra yetmiş iki saat, Kan frotilerinin Giemsa boyama sonrası ve kırmızı kan hücre yoğunluğu ölçümü için mikroskobik inceleme için farklı parazit suşları (ayrıntılı yordamlar için Yardımcı Malzemeler) ile enfekte iki donör farelerin kuyruk kan toplamak. </li><li> % 0.1 ila 1 parasitemia gösteren bir fare seçin ve enfekte kırmızı kan hücreleri, klonlama işlemi için bir bağış olarak çoğunlukla tek parazitleri içerir. Farelerin mikroskobik negatif ise 6.1 önümüzdeki günlerde adımı yineleyin. Hayvanlar 14 gün içinde enfekte değilse) 5 Adım 2 tekrarlayın ve adım 5.11 sporozoites varlığını belirlemek. </li><li> Buzağı serum ve memeli Ringer solüsyonu (2.7 mM potasyum klorür, 1.8 mM kalsiyum klorür, 154 mM sodyum klorür) soğuk bir çözüm 01:01 hasat kuyruk kan sulandırınız kadar, con ulaşmak1 bulaşmış kırmızı kan 100 mcL başına hücre ve buz üzerinde inokulum saklamak için 0,6 santrasyondan. Bu şekilde, bireysel fare çoğu ya bir veya sıfır parazitler almalıdır. </li><li> Intravenously, her 50 ila 100 farelerin seyreltilmiş enfekte kan 100 mcL enjekte. </li><li> Beş ila yedi gün sonra fareler, Giemsa lekeli Kan frotilerinin inceleyerek kan sahne parazitlerin varlığı için ekran. Başarılı bir deneyde, farelerin% 20-50 enfekte olmakta ve% 0,1-5,0 gün 8 yazılan enfeksiyon parasitemia gösterecektir. </li></ol> 7. Genetik Markers kullanarak Döl Karakterizasyonu <ol><li> 0.2 mL soğutulmuş fizyolojik sitrat salin solüsyonu, vorteks kısaca ve pelet kan hücreleri için oda sıcaklığında 3000 rpm&#39;de 3 dakika santrifüj içeren 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içinde 20 ila 40 mcL fare kuyruğu kan toplayın. Hemen DNA özü veya -80 ° C pelet tutmak </li><li> Parazit DNA herhangi bir standart DNA ekstraksiyonu yöntemleri kullanarak hazırlayın. Hızlı DNA izolasyonu için, bir Yüksek Saf PCR şablon hazırlık seti (Roche Uygulamalı Bioscience) kullanın. </li><li> Rekombinant döl mikrosatellit (MS) veya farklı kromozomlar üzerinde genetik çapraz iki ebeveyn suşları ayırt tek nükleotid polimorfizmi (SNP) kullanarak genotipleme sonra tespit edilir. P. MS genotipleme için tek floresan etiketli primerler kullanılarak basitleştirilmiş bir yöntem yoelii (bkz. ref 8,9) kullanılmalıdır. </li></ol> 8. Kan aşamalı Sıtma Parazitler, Kriyoprezervasyon <ol><li> 5-10 ml% 5-20 parasitemia ile bir anestezi fare kalp ponksiyonu ile enfekte kan toplayın 0.5-1 ml serum fizyolojik solüsyonu soğutulmuş. </li><li> Oda sıcaklığında 2000 rpm&#39;de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatant atın. </li><li> Glycerolyte 57 çözüm açılan bilge 2x hacmi (Fenwal Laboratories) kan pelet üzerine ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> Süspansiyon (tüp başına 0.2-0.5 ml) cryotubes aktarın. </li><li> -80 ° C&#39;ye kadar (1 ay) sıvı nitrojen ya da Kriyoprezerve kan saklayın. </li></ol> 9 - Temsilcisi Sonuçlar: Başarılı bir deneyde, klonlanmış hatların% 5-10, bağımsız rekombinant döl olacaktır. <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1, genetik çapraz sırasında yaşam döngüsü ve genetik rekombinasyon olayları şematik . Genetik rekombinasyon olayları sivrisinek gelişiminin erken aşamasında yer alır. Sivrisinek midgut farklı genetik kökenden &quot;haploid&quot; erkek ve dişi eşey hücrelerinin döllenme sonrasında, &quot;diploid&quot; zigot oluşur. Zigot, parazitin yaşam döngüsünün sadece diploid aşamasını teşkil etmektedir, mayoz bölünme, döllenme 12 saat içinde izler ve sivrisinek ve memeliler sonraki tüm aşamalarında haploid kalır. Ortaya çıkan zigot ookinetes ve ookistleri dönüşebilir. Büyüme ve mitoz bölünme her ookist sivrisinek &#39;hemoceal salınan sporozoites binlerce üretir. Tükürük bezlerinin göç olanlar sporozoites, karaciğer ve kırmızı kan hücre aşamalarında gelişme gerçekleşir bir konak memeli, iletilebilir konumda bulunmaktadır. Kırmızı kan hücre siklusu seyri sırasında, bazı parazitler, olgun erkek ve kadın gametocytes ayırt edebilirsiniz. Bu gametocytes başka bir sivrisinek, sürdürmekte iletim tarafından alındığında, parazitin yaşam döngüsü tamamlanmış olur. <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2, sıtma parazitleri ve rekombinant döl üretiminde nükleer genlerin Devralma . Genetik rekombinasyon kromozomal reassortment yoluyla veya çapraz olaylar oluşturulabilir. Homozigot döl aynı ebeveyn klon 1 veya 2 (A ve D), sırasıyla gamet arasında selfing tarafından üretilen. B) İki farklı ebeveyn klonlar, sadece kromozom reassortment tarafından oluşturulan rekombinant çekirdekleri (mavi oval) gamet arasındaki çapraz döllenme tarafından üretilen heterozigot döl. C) homolog kromozomların kardeş olmayan kromatidler arasındaki geçitler tarafından oluşturulan iki farklı ana klonlar, rekombinant çekirdekleri (kırmızı oval) gamet arasındaki çapraz döllenme üretilen heterozigot döl. <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 kemirgen sıtma paraziti Plasmodium yoelii morfolojisi. 10 gün sonrası ookistleri A) halka aşaması, B) trophozoite, C) schizont, D) merozoites, E) olgunlaşmamış erkek gametocyte, F) olgun erkek gametocyte G) olgunlaşmamış dişi gametocyte, H) olgun kadın gametocyte, I) midgut besleme (oklarla gösterilen olgun ookistleri, 200x büyütme), J) sivrisinek tükürük bezleri (100x büyütme), K) sporozoites (400x büyütme).

<ol>
	<li>Hayton, K., Ranford-Cartwright, L. C., Walliker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulfadoxine-pyrimethamine+resistance+in+the+rodent+malaria+parasite+Plasmodium+chabaudi.">Sulfadoxine-pyrimethamine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46, 2482-2489 (2002).</li><li>Cravo, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+mefloquine+resistance+in+the+rodent+malaria+parasite+Plasmodium+chabaudi.">Genetics of mefloquine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi.</a> Antimicrob Agents Chemother. 47, 709-718 (2003).</li><li>Hunt, P., Cravo, P. V., Donleavy, P., Carlton, J. M., Walliker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroquine+resistance+in+Plasmodium+chabaudi:+are+chloroquine-resistance+transporter+(crt)+and+multi-drug+resistance+(mdr1)+orthologues+involved?.">Chloroquine resistance in Plasmodium chabaudi: are chloroquine-resistance transporter (crt) and multi-drug resistance (mdr1) orthologues involved?.</a> Mol Biochem Parasitol. 133, 27-35 (2004).</li><li>Yuan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mapping+of+targets+mediating+differential+chemical+phenotypes+in+Plasmodium+falciparum.">Genetic mapping of targets mediating differential chemical phenotypes in Plasmodium falciparum.</a> Nat Chem Biol. 5, 765-771 (2009).</li><li>Su, X., Kirkman, L. A., Fujioka, H., Wellems, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+polymorphisms+in+an+approximately+330+kDa+protein+are+linked+to+chloroquine-resistant+P.+falciparum+in+Southeast+Asia+and+Africa.">Complex polymorphisms in an approximately 330 kDa protein are linked to chloroquine-resistant P. falciparum in Southeast Asia and Africa.</a> Cell. 91, 593-603 (1997).</li><li>Hayton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythrocyte+binding+protein+PfRH5+polymorphisms+determine+species-specific+pathways+of+Plasmodium+falciparum+invasion.">Erythrocyte binding protein PfRH5 polymorphisms determine species-specific pathways of Plasmodium falciparum invasion.</a> Cell Host Microbe. 4, 40-51 (2008).</li><li>Pattaradilokrat, S., Cheesman, S. J., Carter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenicity+and+genetic+polymorphism+in+cloned+lines+derived+from+a+single+isolate+of+a+rodent+malaria+parasite.">Congenicity and genetic polymorphism in cloned lines derived from a single isolate of a rodent malaria parasite.</a> Mol Biochem Parasitol. 157, 244-247 (2008).</li><li>Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hundreds+of+microsatellites+for+genotyping+Plasmodium+yoelii+parasites.">Hundreds of microsatellites for genotyping Plasmodium yoelii parasites.</a> Mol Biochem Parasitol. 166, 153-158 (2009).</li><li>Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Typing+Plasmodium+yoelii+microsatellites+using+a+simple+and+affordable+fluorescent+labeling+method.">Typing Plasmodium yoelii microsatellites using a simple and affordable fluorescent labeling method.</a> Mol Biochem Parasitol. 155, 94-102 (2007).</li><li>Walliker, D., Carter, R., Morgan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+recombination+in+malaria+parasites.">Genetic recombination in malaria parasites.</a> Nature. 232, 561-562 (1971).</li><li>Sinden, R. E., Hartley, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+meiotic+division+of+malarial+parasites.">Identification of the meiotic division of malarial parasites.</a> J Protozool. 32, 742-744 (1985).</li><li>Ozaki, L. S., Gwadz, R. W., Godson, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+centrifugation+method+for+rapid+separation+of+sporozoites+from+mosquitoes.">Simple centrifugation method for rapid separation of sporozoites from mosquitoes.</a> J Parasitol. 70, 831-833 (1984).</li><li>Yoeli, M., Most, H., Bone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+berghei:+cyclical+transmission+by+experimentally+infected+Anopheles+quadrimachulatus.">Plasmodium berghei: cyclical transmission by experimentally infected Anopheles quadrimachulatus.</a> Science. 144, 1580-1581 (1964).</li><li>Landau, I., Boulard, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Life cycles and Morphology. , (1978).</li><li>Vanderbergh, J. P. Y., M, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+on+sporogonic+development+of+Plasmodium+berghei.">Effects of temperature on sporogonic development of Plasmodium berghei.</a> J Parasitol. 52, 559-564 (1966).</li><li>Gadsby, N., Lawrence, R., Carter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+on+pathogenicity+and+mosquito+transmission+success+in+the+rodent+malaria+parasite+Plasmodium+chabaudi+adami.">A study on pathogenicity and mosquito transmission success in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi adami.</a> Int J Parasitol. 39, 347-354 (2009).</li><li>Pattaradilokrat, S., Culleton, R. L., Cheesman, S. J., Carter, R. G. e. n. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=encoding+erythrocyte+binding+ligand+linked+to+blood+stage+multiplication+rate+phenotype+in+Plasmodium+yoelii+yoelii.">encoding erythrocyte binding ligand linked to blood stage multiplication rate phenotype in Plasmodium yoelii yoelii.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 7161-7166 (2009).</li><li>Pattaradilokrat, S., Cheesman, S. J., Carter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage+group+selection:+towards+identifying+genes+controlling+strain+specific+protective+immunity+in+malaria.">Linkage group selection: towards identifying genes controlling strain specific protective immunity in malaria.</a> PLoS One. 2, e857-e857 (2007).</li><li>Mackinnon, M. J., Read, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Relationships+between+Parasite+Virulence+and+Transmission+in+the+Rodent+Malaria+Plasmodium+chabaudi.">Genetic Relationships between Parasite Virulence and Transmission in the Rodent Malaria Plasmodium chabaudi.</a> Evolution. 53, 689-703 (1999).</li></ol>

Yazarlar, kamu çalışanları ve bu bir hükümet çalışması olduğundan, Amerika Birleşik Devletleri&#39;nde kamu malı. Başka herhangi bir anlaşma ile bağlı kalınmaksızın, NIH görüntülemek için PubMedCentral çalışmalarını sağlamak ve kamu tarafından kullanılması hakkını saklı tutar ve töreleri ile PubMedCentral tutarlı çalışma etiket veya değiştirebilir. ABD konunun dışında bir hükümet kullanım lisans hakları kurabilir.

Biz, aynı zamanda diğer kemirgen malarias genetik haçlar üretimi için geçerli kemirgen sıtma Plasmodium yoelii, genetik bir haç üretim teknikleri göstermektedir. Tek ebeveyn klonları ile farelerin enfeksiyonları genellikle ebeveynlerin çapraz yapmadan önce fonksiyonel gamet üretiminde yetkin olmalarını sağlamak için ebeveyn parazitlerin başarılı iletim belirlemek için yapılmaktadır. Başarılı bir sivrisinek yoluyla aktarımı insectary sıcaklığı, kulla...

Yardımcı Malzemeler: <ul><li> Laboratuar farelerine Bakım </li><li> Laboratuvar sivrisinek Bakım </li><li> Giemsa ile boyanmış Kan frotilerinin mikroskobik muayene leke </li><li> Kırmızı kan hücre yoğunluğu ölçümü </li></ul> Laboratuar farelerine Bakım Kendilenmiş laboratuar faresi zorlanma 5 ila 8 hafta yaşlı BALB / c, Kadınlar çalışmaya kullanılır. Fare, besleyici ve bir su şişesi ile donatılmış tel bar kapaklı bir standart alt katı polikarbonat kafes, ev sahipliği yapmaktadır. Fare sabit bir sıcaklıkta korunur (25 ± 1 ° C) 00:12 saat ışık karanlık döngüsü. (Sterilize; Harlan-Teklad) Fare 2018S Harlan Teklad Küresel% 19 protein ekstrüde kemirgen diyet beslemek için izin verilir ve asitlendirilmiş içme suyu ad libitum ile birlikte. Hayvanlar üzerinde deney protokolü LMVR11E (Sağlık, Bethesda, Maryland Ulusal Sağlık Enstitüleri) altında Ulusal Alerji ve Enfeksiyon Hastalıkları Enstitüsü Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak yapılmaktadır. Laboratuvar sivrisinek Bakım Sivrisinek Anofel stephensi bir laboratuarda yetiştirilmiş koloni. Yetişkinler, bir sıcaklık ve nem kontrollü odası (25 ila 23 saklanır naylon kafeslerde korunur ° C ve Plasmodium yoelii ve Plasmodium chabaudi için 21 ila 19 ° C Plasmodium berghei; 80 -% 95 nem ; 12:12 saat ışık: karanlık döngüsü). Yetişkin sivrisinek% 10 glikoz ve% 2.00 &#39;para-aminobenzoik asit (PABA) takviye su solüsyonu ile beslenir. Yüksek kaliteli yetişkin elde etmek için yaklaşık 1 mg sodyum bikarbonat ile birlikte 1000 cm 3 açık çanak, distile su ile 1 L düşük yoğunluklu bir durumda, 500 larva yetiştirilmektedir. Yumurtadan çıkan larvalar pupa aşaması haline kadar Tetramarin tozu (Petco) verilmiştir ve gelişmekte olan erişkin sivrisinek kafeslerine aktarılır. Giemsa ile boyanmış Kan frotilerinin mikroskobik muayene leke Temiz bir makas kullanarak enfekte fare kuyruğunun ucu (1.0 mm) snip. Yeri bir damla temiz bir örnek slayt üzerine kuyruk kan (0.5-1.0 mcL). Fare 1-2 dakika içinde kanama durur. Numune slayt 45 ° açıyla bakımı, kan damlası üstüne temiz bir dağıtıcı slayt yerleştirin ve kan serpme tüm genişliği tutunmasını sağlar. Örnek slayt tutun ve ince yayma üretmek için hızlı ve sorunsuz bir dağıtıcı slayt ileri itin. Kan filmi kurumasını bekleyin ve daha sonra mutlak metanol slaytlar batırmayın. Giemsa boyama (% 10 distile su Giemsa boyası) ile kaplayıp önce bir kez daha kuru hava slayt izin verin. Ince kan filmler 10-15 dakika oda sıcaklığında inkübe sonra, musluk suyu ile dikkatlice slaytlar yıkayın ve kuru, hava sağlar. 1000x büyütme (100x objektif lens ile birlikte) ve hesaplamak parasitemia (RBC sayılır 100 iRBC ortalama sayısı) immersiyon yağı ile hafif bir mikroskop altında; bulaşmış kırmızı kan hücreleri (enfekte eritrosit morfolojisi bkz. Şekil 3 iRBC) sayısı inceleyin. Sıtma parazitlerinin farklı türlerin büyüme oranı ve patojenite değişir. Kan aşamasında sıtma parazitleri doza bağlı olarak kan aşamada parasitaemias izlenmesi, enjeksiyondan sonra 24 saat gerçekleştirilen olabilir. Örneğin, 10 7 enfekte RBC intraperitoneal veya intravenöz 10 6 enfekte RBC ile enjekte edildiğinde farelerin mikroskobik olarak pozitif 24 saat olacak. Kırmızı kan hücre yoğunluğu ölçümü Parasitaemias, enfekte farelerde kırmızı kan hücre (RBC) yoğunluk seviyeleri gibi enfeksiyon seyri boyunca değişir. RBC yoğunluğu tek ve karma klonu enfeksiyonunun başlangıç ​​ve klonlama deneyleri önce 1-2 saat içinde ölçülmelidir. RBC yoğunluğu ölçümü için iki yöntem vardır: Cellometer kullanarak Neubauer hemasitometre ve otomatik sayma (Nexcelom Bioscience) kullanarak bir manuel sayım. Her iki yöntemde de, fare kuyruğu kan kılcal bir cam (VWR) kullanarak 1 mcL çekilme ve 10 ml PBS içinde sulandırmak ve iyice karıştırın. Neubauer hemasitometre kullanmak için, süspansiyon 20 mcL hemasitometre üzerine yerleştirin. 10x objektif lens ile ışık mikroskobu hemasitometre yerleştirin. Hemasitometre 16 küçük kareler daha ayrılır, 9, büyük meydanlar, ve 4 büyük köşesinde kareler ayrılmıştır bir tablo içerir. 16 küçük kareler her dört köşe kareler hücrelerinin toplam sayısını sayın. Önyargı sayma ya da bir grid çizgisi üst üste hücreleri sayma önlemek için, &quot;&quot; olarak hücre sayımı örtüşür, üst veya sağ çizgiler ve &quot;out&quot;, alt ya da sol hatları örtüşür. Küçük bir kare başına hücrelerinin sayısını tahmin etmek ve 0.00625 (küçük bir kare hacmi 6.25 nL) bölün. Bu mikrolitrelik başına hücreleri (&amp; numarasını verir.mu; L). Bu verilere göre, 10.000 (seyreltme faktörü) ile çarpılarak son kırmızı kan hücre yoğunluğu hesaplar. Kuru hava, saf su ve% 70 etanol ile kapak kayma ve sayma odasına durulayın. Alternatif olarak, bir Cellometer sayma odası slayt üzerine süspansiyon 20 mcL yükleyin. Slayt Cellometer slayt odası (okuyucu) içine yerleştirin. Cellometer yazılımını başlatın &quot;kırmızı kan hücresi&quot; seçeneğini seçin ve 10.000 seyreltme faktörü girin. RBC yoğunluğu kaydedin.

protocol for production of a genetic cross of the rodent malaria parasites

Antimalaryal yanıt ve sıtma parazitleri, patojenite Varyasyon, biyolojik ve tıbbi önemi. Bağlantı haritalama 1-3 kemirgenler ve insanlarda 4-6 sıtma parazitleri çeşitli özelliklerin altında yatan gen veya lokusların başarılı tanımlanmasına yol açmıştır. Sıtma paraziti Plasmodium yoelii vahşi Afrika kemirgenler izole birçok sıtma türlerinin biridir ve laboratuvarlarda büyümeye adapte edilmiştir. Bu tür birçok insan sıtma parazitlerinin biyolojik özellikleri yeniden üretmesidir; parazit 7-9 mikrosatellit ve amplifiye parça uzunluk polimorfizmi (AFLP) işaretleyicileri gibi genetik belirteçleri için geliştirilmiştir. Böylece, kemirgen sıtma parazitleri Plasmodium falciparum araştırma tamamlamak için genetik çalışmalar yapılabilir. Burada, P. genetik bir çapraz üretmek için teknikler göstermektedir yoelii ilk kez Dr tarafından öncülük edilmiştir . David Walliker Richard Carter ve arkadaşları 10, Edinburgh Üniversitesi. P. de Genetik haçlar yoelii ve diğer kemirgen sıtma parazitleri ilgi fenotipleri ve sivrisinek, 4 gün sonra enfeksiyon enfekte fareler üzerinde beslemek için izin vererek farklı genetik olarak farklı iki klonların gametocytes içeren bir inokulum ile enfekte fareler Mus musculus tarafından yapılmaktadır . Erkek ve dişi fare kan gametocytes varlığı mikroskobik beslemeden önce teyit edilir. Beslenmeden sonra 48 saat içinde, sivrisinek midgut, haploit gametocytes, erkek ve dişi eşey hücrelerinin içine ayırt döller ve diploid zigot formu (Şekil 1). Bir ookinete bir zigot gelişimi sırasında, mayoz 11. meydana görünür. Zigot genetik olarak farklı iki parazitler, genetik değişim (homolog kromozom çiftinin olmayan kardeş kromatidler arasında kromozomal reassortment ve cross-over; Şekil 2) gamet arasındaki çapraz döllenme yoluyla elde edilen ise, rekombinasyon sonuçlanan oluşabilir homolog lokusların genetik materyal. Her zigot dört haploit çekirdeklerin önde gelen, birbirini izleyen iki nükleer bölünmeler uğrar. Bir ookinete daha bir ookist içine geliştirir. Ookist olgunlaştıkça sonra, sporozoites (çapraz döl) binlerce oluşan ve sivrisinek hemoceal salınır. Sporozoites tükürük bezleri hasat öncesi eritrosit ve eritrosit aşama bir gelişme gerçekleşir yeni bir fare ev sahibi, içine enjekte edilir. Eritrosit formları klonlanmış ve genetik bağlantı haritalama önce ebeveyn hatları ayırt edici karakter bakımından sınıflandırılır. Bireysel ebeveyn klonların Kontrol enfeksiyonlar, genetik çapraz üretim olarak aynı şekilde yapılmaktadır.

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites at JoVE.com

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Kemirgen sıtma parazitleri Genetik haçlar sivrisineklerin genetik olarak iki farklı parazitler besleyerek yapılmaktadır. Rekombinant döl sivrisinek enfekte farelerde ısırık izin sonra fare kandan klonlanmış. Bu video genetik haçlar üretmek nasıl gösterir<em&gt; Plasmodium yoelii</em&gt; Ve diğer kemirgen sıtma parazitleri için geçerlidir.

Kemirgen Sıtma Parazitler Genetik Haç üretimi için protokol

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

protocol-for-production-genetic-cross-rodent-malaria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.1K Görüntüleme.  National Institutes of Health. Kemirgen sıtma parazitleri Genetik haçlar sivrisineklerin genetik olarak iki farklı parazitler besleyerek yapılmaktadır. Rekombinant döl sivrisinek enfekte farelerde ısırık izin sonra fare kandan klonlanmış. Bu video genetik haçlar üretmek nasıl gösterir Plasmodium yoelii Ve diğer kemirgen sıtma parazitleri için geçerlidir.

Video: Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

Canlı bir Host Transgenik Leishmania Parazitlerinin in vivo Imaging

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

Yellow Fever Sivrisinek Hemocytes Toplama ve Boyama için Protokol Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

Tüm Influenza Kantitatif Analiz Basit Slot Blot Tahliller Evrensel Antikorlar kullanarak Viral Hemagglutinins ve nöraminidaz yazın

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

DNA ekstraksiyonu için A Simple Chelex Protokolü<em&gt; Anofel</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

Genetik Manipülasyon<em&gt; Δku80</emFonksiyonel Genomik Analiz&gt; Suşlarının<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Eğitim için bir genetik Yaklaşım olarak yardımcı T hücrelerinin retroviral İletimi Mekanizmaları kendi Farklılaşma ve Kontrol Fonksiyonunun

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new method with a powerful and simple strategy for the establishment of B-LCLs, the red blood cell lysis method. This method simplified the PBMC separation procedure with red blood cell removal, and used as little as 0.5 mL of whole blood for establishing EBV-immortalized cell lines, which can proliferate to large cell numbers in a relatively short amount time with a 100% success rate. The method is simple, reliable, time saving, and applicable to treating a large number of the clinical samples.

A simple red blood cell lysis method for establishing B-LCLs was developed with high immortalization efficiency, requiring a small amount of blood and saving time from initiation to cryopreservation.

B lenfoblastoid hücre dizilerinde Kurulması için Basit Kırmızı Kan Hücresi Lizis Yöntemi

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. However, effective malaria parasite targets for vaccine and chemotherapy development are still limited. This is largely due to the unavailability of relevant and practical in vivo infection models for human Plasmodium species, most notably for P.&#160;falciparum and P. vivax. Therefore, rodent malaria species have been extensively used as practical alternative in vivo models for malaria vaccine, drug targeting, immune response, and functional characterization studies of conserved Plasmodiumspp. genes. Indeed, rodent malaria models have proven to be invaluable, especially for exploring mosquito transmission and liver stage biology, and were indispensable for immunological studies. However, there are discrepancies in the methods used to evaluate the phenotypes of transgenic and wild-type asexual and sexual blood-stage parasites.&#160;Examples of these discrepancies are the choice of an intravenous vs. intraperitoneal infection of rodents with blood-stage parasites and the evaluation of male gamete exflagellation. Herein, we detail standardized experimental methods to evaluate the phenotypes of asexual and sexual blood stages in transgenic parasites expressing reporter-gene or wild-type rodent malaria parasite species. We also detail the methods to evaluate the phenotypes of malaria parasite mosquito stages (gametes, ookinetes, oocysts, and sporozoites) inside Anopheles mosquito vectors. These methods are detailed and simplified here for the lethal and non-lethal strains of P. berghei and P. yoelii but can also be applied with some adjustments to P. chabaudi and P. vinckei rodent malaria species.

Due to the striking similarities of the life cycle and biology of rodent malaria parasites to human malaria parasites, rodent malaria models have become indispensable for malaria research. Herein, we standardized some of the most important techniques used in the phenotypic analysis of wild-type and transgenic rodent malaria species.

Kemirgen Sıtma paraziti Asexual ve cinsel kan aşamaları ve sivrisinek aşamaları phenotypic Analizi

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Roman besleyici-Alerjik sistemi fare doğal katil hücreler Vitro seri üretim için

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate hosts, respectively. While pathogenic symptoms of leishmaniasis can vary widely, from benign cutaneous lesions to highly fatal visceral disease forms depending on the infective species, all Leishmania species reside inside host macrophages during the vertebrate stage of their lifecycle. Leishmania infectivity is therefore directly related to its ability to invade, survive and replicate within parasitophorous vacuoles (PVs) inside macrophages. Thus, assessing the parasite&#39;s ability to replicate intracellularly serves as a dependable method for determining virulence. Studying leishmaniasis development using animal models is time-consuming, tedious and often difficult, particularly with the pathogenically important visceral forms. We describe here a methodology to follow the intracellular development of Leishmania in bone marrow-derived macrophages (BMMs). Intracellular parasite numbers are determined at 24 h intervals for 72 - 96 h following infection. This method allows for a reliable determination of the effects of various genetic factors on Leishmania virulence. As an example, we show how a single allele deletion of the Leishmania Mitochondrial Iron Transporter gene (LMIT1) impairs the ability of the Leishmania amazonensis mutant strain LMIT1/&#916;Lmit1 to grow inside BMMs, reflecting a drastic reduction in virulence compared to wild-type. This assay also allows precise control of experimental conditions, which can be individually manipulated to analyze the influence of various factors (nutrients, reactive oxygen species, etc.) on the host-pathogen interaction. Therefore, the appropriate execution and quantification of BMM infection studies provide a non-invasive, rapid, economical, safe and reliable alternative to conventional animal model studies.

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

All pathogenic Leishmania species reside and replicate inside macrophages of their vertebrate hosts. Here, we present a protocol to infect murine bone marrow-derived macrophages in culture with Leishmania, followed by precise quantification of intracellular growth kinetics. This method is useful for studying individual factors influencing host-pathogen interaction and Leishmania virulence.

Hızlı ve güvenilir yöntem LEISHMANIA parazit virülans değerlendirmek için hücre içi büyüme makrofajlar içinde miktar olduğunu

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...