Agradecemos a los Dres Randy Elkins, Kastenmayer Robin, Ted Torrey, Pare Dan y Lehman Tovi para la lectura crítica de los manuscritos. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramural de la División de Investigación Intramural del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas de los Institutos Nacionales de Salud, y por el Programa Nacional de Investigación Básica 973 de China, # 2007CB513103. Damos las gracias al NIAID intramuros editor Brenda Rae Marshall de ayuda.

Técnicas de asepsia deben ser aplicadas a todos los materiales que serán administrados a los animales para evitar la introducción accidental de agentes infecciosos exógenos en los ratones que se pueden confundir los resultados experimentales. 1. La infección de ratones de laboratorio con parásitos de la malaria el estadio en sangre <ol><li> A temperatura ambiente, descongelar dos viales que contienen la sangre congelada parásitos de la malaria etapa que se cruzaron. En este ejemplo, dos cepas de roedores parásito de la malaria utiliza son el Plasmodium yoelii yoelii y nigeriensis Plasmodium yoelii. </li><li> Adaptarse a una jeringa con un calibre 22-30 (G) la aguja y elaborar 400 l de agua estéril, farmacéutica grado PBS (pH 7,4). </li><li> Utilizando la misma jeringa, elaborar 100 L de la sangre infectada descongelado; invierta la jeringa hacia arriba y abajo hasta que el contenido es homogéneamente mezclado. (Opcional: una pipeta se puede utilizar para la transferencia de PBS y la sangre infectada en un tubo de recogida antes de transferir a una jeringa para inyección). </li><li> Inyectar 200 uL de parásito que contiene la solución directamente en el peritoneo de un ratón. Cuando termine, deseche la jeringa en un contenedor de objetos punzantes. (Véase también materiales complementarios para el mantenimiento de los ratones de laboratorio). En general, el tamaño estándar de la inoculación es de entre 100 a 500 l, en función de los niveles de infecciones del parásito en los materiales congelados original. </li><li> Inyectar las dos cepas de parásitos que se cruzaron en dos ratones cada uno. Los ratones se convertirá en positivo microscópicamente 3 a 5 días después de las inyecciones. Al llegar a parasitemias entre 1-5%, continúe con el siguiente paso. </li></ol> 2. Infección mixta de clonar ratones <ol><li> Antes de la infección clon mixto, recoger la sangre de la cola de los dos ratones donantes infectados con cepas de parásitos diferentes para el examen microscópico de frotis teñidos con Giemsa diluir la sangre (Fig. 3), y para la medición de la densidad de glóbulos rojos (ver material complementario para los procedimientos detallados) . </li><li> Calcular el volumen de una solución salina fisiológica (1,5% w / v de citrato trisódico dihidrato, 0.85% w / v de cloruro de sodio) y la sangre de ratón para producir una mezcla de inóculo, utilizando la parasitemia y el rojo las mediciones de densidad de células sanguíneas obtenidas anteriormente. </li><li> Ajustar la solución de los parásitos a una concentración final de un millón de células rojas de la sangre infectada por 100μl. </li><li> Combine la sangre infectada de los dos donantes en una proporción de 1:1 para obtener un inóculo mixto clon. Cuando los dos clones parentales difieren en la tasa de crecimiento, ajustar las proporciones de una. De más rápido crecimiento de los padres a un clon de crecimiento más lento de los padres a 01:02 o 01:05 </li><li> Inyectar 100 l de la muestra mezclada en el peritoneo de los ratones de la infección. (Véase también el paso 3.9 para determinar el número de ratones que se inyecta) </li><li> Usando este método, infectar a dos ratones cada uno con las cepas parentales individuales. Las infecciones de un solo clon permitirá la determinación de la transmisión con éxito de las dos cepas parentales. </li></ol> 3. Los mosquitos de alimentación <ol><li> Prepare tres cajas que contienen 300 a 500 adultos (hombres y mujeres) los mosquitos Anopheles stephensi cada uno, edad 5-7 días después de la aparición de pupas. Los contenedores están cubiertos con una red segura por un plástico o una tapa de metal. Dos jaulas para alimentarse de clones parentales, la tercera jaula es para la preparación de un cruce genético. </li><li> A partir cuatro días después de la infección mixta-clone, preparar Giemsa frotis finos de sangre de la cola de los ratones infectados. </li><li> Examinar los frotis en el microscopio de barrido por lo menos 50 campos microscópicos con un aumento de 1000x y determinar si gametocitos masculinos y femeninos están presentes. </li><li> Gametocitos masculinos y femeninos son reconocibles por la presencia de grandes gránulos y grandes vacuolas (Fig. 3). Gametocitos masculinos y femeninos tienen un citoplasma de color rosa y azul, respectivamente. Si gametocitos presentes, siga el Paso 3.6. </li><li> Si gametocitos están ausentes, mantener la vigilancia diaria hasta que aparezcan. Si gametocitos presentes, continuar con el siguiente paso. </li><li> Inyectar 50 L de cóctel de fármacos anestésicos que contienen 33 mg / ml de ketamina y de 3 mg / ml de xilazina en el peritoneo de un ratón para anestesiar a cada ratón infectado (por cada 20 gramos de peso corporal del ratón). Última dosis de ketamina y xilazina es de 82.5 y 7.5 mg / Kg, respectivamente. </li><li> Coloque el ratón boca abajo en la parte superior de una jaula que contenía un adulto mosquitos Anopheles stephensi que han sido privadas de abastecimiento de azúcar de 24 horas y permitir a los mosquitos para alimentarse durante 30 minutos sin interrupción. </li><li> Mantener a los mosquitos en un insectario en condiciones normales (temperatura se mantiene entre 24-26 ° C; ver también métodos complementarios para el mantenimiento del laboratorio de los mosquitos). </li><li> Utilice un ratón infectado por cada 50 a 100 hembras de los mosquitos. La eutanasia a los ratones por dislocación cervical inmediatamente después de la alimentación, mientras que los ratones están todavía bajo la anestesia. </li></ol> 4. Mosquito disección Midguts y ooquistes Contando <ol><li> Nueve días después de la alimentación, los mosquitos se examinarán de ooquistes en el intestino del insecto. La presencia de ooquistes en los mosquitos que se alimentan de un solo clon de ratones infectados indica que los gametocitos de las dos cepas parentales son infecciosos. </li><li> Para la disección de un intestino medio del mosquito, use un aspirador conectado a un pequeño recipiente para recoger 5 a 10 mosquitos infectados de la jaula. </li><li> Utilizando el gas CO 2, anestesiar a los mosquitos y transferirlos a un plato de Petri de vidrio en el hielo. Separados y desechar los mosquitos machos. Las antenas de los machos son notablemente más tupidas, en comparación con las hembras. </li><li> Llenar dos jeringas con PBS y en forma con calibre 26 de media pulgada (G ½) agujas. Depósito de 100 l de PBS a partir de una jeringa en un portaobjetos de vidrio. </li><li> La transferencia de 5 a 10 hembras de los mosquitos anestesiado sobre la gota de PBS y colocar la placa en un microscopio de disección. </li><li> Utilizando las mismas agujas, quitar las alas cada mosquito y las piernas, luego, manteniendo al insecto en el abdomen, tórax y posterior, retire el cuerpo de otro hasta el intestino medio, de color blanco en forma de saco del cuerpo, se libera. Separar el intestino medio y desechar el resto del cuerpo. </li><li> Añadir más PBS en el intestino medio, si las diapositivas se seca. El intestino medio se degeneran si deja secos. Coloque un cubreobjetos sobre el intestino medio. </li><li> Examinar el intestino medio con un microscopio óptico con un aumento de 100x. Cuente el número de ooquistes en cada intestino medio (Fig. 3). Ooquistes son reconocibles como de pared gruesa estructuras circulares que se encuentran en la superficie externa de la midguts. </li><li> Cuando haya terminado, disponer de jeringas, agujas, y se deslizan en un recipiente de objetos punzantes. </li><li> Si los ooquistes están ausentes en el intestino medio, los mosquitos se alimentan con ratones infectados con el mayor número de gametocitos y dar más tiempo de alimentación. La temperatura es crítica para este paso. Asegúrese de que la temperatura se ha fijado en 24 a 26 ° C. </li></ol> 5. Recogida de esporozoítos de los mosquitos por centrifugación <ol><li> Prepare los tubos de recogida de esporozoito de la siguiente manera: cortar la tapa de un tubo de centrífuga limpio de 0.5 ml y un agujero (0.1-0.2 mm de diámetro) en la parte inferior del tubo con una aguja de 19 G flameado. </li><li> Llene 1 / 3 del tubo con lana de vidrio. Introduzca el tubo de filtro en un tubo de recogida de 1,5 ml (un tubo es suficiente para la cosecha de esporozoitos ~ 100 mosquitos) </li><li> Sobre la alimentación después de 17 días, recoger los mosquitos (paso 4) de las jaulas en un recipiente pequeño con un aspirador. </li><li> El uso de CO 2 del gas para anestesiar a los mosquitos. </li><li> Separados de las hembras de los mosquitos machos. La transferencia de los mosquitos hembras anestesiados desde el contenedor a un plato de Petri de vidrio en el hielo. </li><li> Preparar dos jeringas con agujas de 26 G ½ lleno de PBS. Depósito de 100 l de PBS a partir de una jeringa en un portaobjetos de vidrio. </li><li> La transferencia de los mosquitos en un portaobjetos de microscopio. Quitar la cabeza de los mosquitos, las alas, piernas y abdomen, debajo de un microscopio de disección. </li><li> Utilizando unas pinzas de punta fina transferir el tórax en 0,5 ml de PBS en un homogeneizador de 1,5 mL (mortero). Guarde el tórax en el hielo (esporozoito permanece infectante durante 2-3 h). </li><li> Homogeneizar el tórax en el hielo para liberar esporozoitos de las glándulas salivales (ver Figura 3), y la transferencia de los lisados ​​(homogeneizados) en el tubo lleno de lana de vidrio (Paso 5.1 a 5.2) usando una pipeta de vidrio. </li><li> Centrífuga de 10 a 20 segundos a 1000 rpm a temperatura ambiente. </li><li> Recoger el flujo a través de (la suspensión de esporozoito purificado) con una jeringa con una aguja de 22-30 G. (Opcional: caída de 10 a 50 L de la corriente a través de una lámina de microscopio, coloque una hoja de cubierta y visualizar los esporozoitos vivir bajo un microscopio óptico estándar, 400X ampliación, véase también la Fig. 3) </li><li> Inyectar ip 0,1-0,5 ml de la suspensión de esporozoitos en ratones (hasta 200.000 parásitos pueden ser cosechados de un mosquito, ver ref 12). En un caso de éxito, el animal se infectan 72 horas después de una inyección. </li></ol> 6. La clonación de progenie con dilución limitada <ol><li> Setenta y dos horas después de las inyecciones de esporozoito, recoger la sangre de la cola de los dos ratones donantes infectados con cepas de parásitos diferentes para el examen microscópico después de la tinción de Giemsa de frotis de sangre delgado y para la medición de la densidad de glóbulos rojos (ver material complementario para los procedimientos detallados). </li><li> Elija un ratón mostrando una parasitemia 0,1 a 1% y cuyas células rojas de la sangre infectada contener parásitos en su mayoría solo como donante para el proceso de clonación. Repita el paso 6.1 próximos días si los ratones son microscópicamente negativos. Si los animales no están infectados dentro de 14 días, repita los pasos 2 a 5 y determinar la presencia de esporozoitos en el paso 5.11). </li><li> Diluir la sangre recogida en la cola de un resfriado 01:01 solución de Ringer suero de ternera y de mamíferos (2,7 mM de cloruro de potasio, cloruro de calcio 1,8 mM, 154 mM de cloruro de sodio) con el fin de alcanzar una estafaconcentración de 0,6 a 1 célula infectada rojas de la sangre por cada 100 l, y almacenar el inóculo en el hielo. De esta manera, la mayoría de los mouse persona debe recibir uno o cero parásitos. </li><li> Por vía intravenosa se inyectan 100 l de sangre diluida infectados en cada uno de 50 a 100 ratones. </li><li> De cinco a siete días más tarde, la pantalla de los ratones de la presencia de parásitos en el estadio de sangre mediante el examen de Giemsa frotis finos de sangre. En un experimento exitoso, el 20-50% de los ratones infectados y se mostrará la parasitemia de 0.1-5.0% después de la infección en el día 8. </li></ol> 7. Caracterización de la progenie con marcadores genéticos <ol><li> Recoge 20 a 40 l de sangre del ratón de cola en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 0,2 ml de solución salina fisiológica fría citrato, agitar brevemente y centrifugar durante 3 minutos a 3000 rpm a temperatura ambiente para que sedimenten las células de la sangre. Extraer el ADN de inmediato o guardar el pellet a -80 ° C. </li><li> Prepare el ADN del parásito utilizando cualquier método de extracción de ADN estándar. Para el aislamiento rápido de ADN, utilizar un High Pure PCR plantilla de la preparación del kit (Roche Applied Bioscience). </li><li> Recombinante progenie son identificados después de genotipado con microsatélites (MS) o polimorfismo de nucleótido único (SNP) en diferentes cromosomas que se pueden diferenciar las dos cepas de los padres de la cruz genética. Un método simplificado con una sola primers marcadas con fluorescencia para MS genotipo de P. yoelii se puede utilizar (ver ref 8,9). </li></ol> 8. Criopreservación de parásitos de la malaria el estadio en sangre <ol><li> Recoger 0,5-1 ml de sangre infectada por punción cardiaca a partir de un ratón anestesiado con parasitemia de 20.5% en 5-10 ml de suero fisiológico frío. </li><li> Centrifugar durante 5 min a 2000 rpm a temperatura ambiente. Desechar el sobrenadante. </li><li> Añadir gota a gota, el volumen de 2x 57 Glycerolyte solución (Fenwal Laboratories), en pellets de sangre y se mezcla bien. </li><li> Transferir la suspensión a criotubos (0,2-0,5 ml por tubo). </li><li> Almacenar la sangre criopreservados a -80 ° C (hasta 1 mes) o en nitrógeno líquido. </li></ol> 9. Los resultados representativos: En un experimento exitoso, el 5-10% de las líneas de clonado será descendencia recombinante independiente. <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Representación esquemática del ciclo de vida y los eventos de recombinación genética en un cruce genético. Eventos de recombinación genética llevará a cabo durante la fase inicial de desarrollo en el mosquito. Después de la fertilización de &quot;haploide&quot; gametos masculinos y femeninos de diferentes bases genéticas en el intestino medio del mosquito, &quot;diploide&quot; cigotos se forman. El cigoto constituye la etapa diploide sólo del ciclo vital del parásito, la meiosis se produce dentro de 12 horas de la fertilización, y todas las fases posteriores en el mosquito y los mamíferos permanecen haploides. Los cigotos resultantes se convierten en ookinetes y ooquistes. El crecimiento y la división mitótica de cada ooquiste produce miles de esporozoitos, que son liberados en hemoceal mosquitos. Los esporozoitos que migran a las glándulas salivales se encuentran en condiciones de ser transmitido a un huésped mamífero, donde el desarrollo del hígado y el rojo las etapas de células sanguíneas se lleva a cabo. Durante el curso de los ciclos de los glóbulos rojos, algunos parásitos pueden diferenciarse en madurar gametocitos masculinos y femeninos. El ciclo vital del parásito se completa cuando estos gametocitos son tomadas por otro mosquito, perpetuando la transmisión. <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Herencia de genes nucleares de parásitos de la malaria y la producción de progenie recombinante. Recombinación genética se pueden generar a través de recombinación cromosómica o por eventos de cruce. Progenie homocigótica producida por autofecundación entre gametos de un mismo clon parental 1 o 2 (A y D), respectivamente. B) progenie heterocigota producida por la interacción entre los gametos de los dos clones distintos de los padres, los núcleos recombinante (óvalos azules) está formado por recombinación cromosómica solo. C) descendencia heterocigota produce a partir de la fertilización cruzada entre los gametos de los dos clones de padres diferentes, los núcleos recombinante (óvalos de color rojo) se forma por cruces entre las cromátidas no hermanas de los cromosomas homólogos. <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Morfología del roedor parásito de la malaria Plasmodium yoelii. A) Fase de anillo, B) trofozoíto, C) esquizonte, D) merozoitos, E) gametocitos machos inmaduros, F) gametocitos varón maduro, G) gametocitos hembra inmadura, H) gametocitos hembra madura, I) del intestino medio con ooquistes en el día 10 después de alimentación (ooquistes maduros indicado por las flechas; 200x aumentos), J) las glándulas salivales del mosquito (100x), K) esporozoitos (400x aumentos).

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Nos demuestran las técnicas para la producción de un cruce genético de los roedores malaria Plasmodium yoelii, que también es aplicable a la producción de cruces genéticos en malarias roedores. Infecciones de los ratones con un solo clones parentales usualmente se realizan para determinar la transmisión correcta de los parásitos de los padres para asegurarse de que los padres son competentes en la producción de gametos funcionales antes de realizar una cruz. Transmisión co...

MATERIAL COMPLEMENTARIO: <ul><li> Mantenimiento de los ratones de laboratorio </li><li> Mantenimiento de los mosquitos de laboratorio </li><li> El examen microscópico de frotis finos de sangre teñidas con Giemsa </li><li> Medida de la densidad de glóbulos rojos </li></ul> Mantenimiento de los ratones de laboratorio Las hembras de la cepa endogámica de ratón de laboratorio BALB / c, de 5 a 8 semanas de edad, se utilizan en el estudio. Los ratones se encuentran en un nivel sólido de fondo de la jaula de policarbonato con tapa de alambre-bar, equipado con alimentador y una botella de agua. Los ratones se mantienen a una temperatura constante (25 ± 1 ° C) en 12:12 horas luz: oscuridad ciclo. Los ratones se les permite alimentarse de 2018S Harlan dieta Teklad global del 19% de proteínas de roedores extruido (esterilizable, de Harlan-Teklad) y se suministra con libitum acidificada beber agua ad. Los experimentos con animales se realizan de acuerdo con las directrices y normas establecidas por el Cuidado de Animales y el empleo en el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas en el protocolo LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland). Mantenimiento de los mosquitos de laboratorio Los mosquitos son de una colonia de laboratorio criados de Anopheles stephensi. Los adultos son mantenidos en jaulas de nylon mantienen en una temperatura y humedad ambiente controlada (23 a 25 ° C para el Plasmodium yoelii y chabaudi Plasmodium, y de 19 a 21 ° C para el Plasmodium berghei, 80 a 95%; en 12:12 horas de luz: oscuridad ciclo). Los mosquitos adultos se alimentan con glucosa al 10% y 2,00% para-aminobenzoico (PABA) solución complementa el agua. Para obtener alta calidad de los adultos, 500 larvas se desarrollan en una condición de baja densidad en 1 litro de agua destilada en un 1.000 cm 3 plato abierto suministrados con aproximadamente 1 mg de bicarbonato de sodio. Después de la eclosión, las larvas se dan TetraMin polvo (PETCO) hasta que se conviertan en la fase de pupa y se transfieren a las jaulas de los mosquitos adultos emergentes. El examen microscópico de frotis finos de sangre teñidas con Giemsa Usando tijeras limpias recortar la punta (1,0 mm) de la cola del ratón infectado. Coloque una gota (0,5 a 1,0 l) de sangre en un portaobjetos de la cola muestra limpia. Ratón detener la hemorragia en 1-2 min. Coloque una diapositiva esparcidor limpio en la parte superior de la gota de sangre, el mantenimiento a un ángulo de 45 ° respecto a la diapositiva de muestra, y permitir que la sangre para absorber a la totalidad del ancho de la cruceta. Sostenga el portaobjetos e impulsar la diapositiva esparcidor rápida y fluida para producir una capa delgada. Dejen que la sangre seca, y luego sumerja el portaobjetos en metanol absoluto. Permita que la diapositiva se seque al aire una vez más antes de cubrirla con Giemsa (10% de colorante Giemsa en agua destilada). Después de incubar las películas delgadas de sangre durante 10-15 minutos a temperatura ambiente, enjuagar cuidadosamente los portaobjetos con agua del grifo y dejar secar al aire. Examine el número de glóbulos rojos infectados (iRBC véase el cuadro 3 para la morfología de los infectados RBC) bajo un microscopio de luz con aceite de inmersión en 1000x (con lente de objetivo 100x) y calcular la parasitemia (el número de iRBC por cada 100 eritrocitos contados). Las diferentes cepas de parásitos de la malaria variar la tasa de crecimiento y patogenicidad. Seguimiento de parasitemias etapa sangre puede llevar a cabo 24 horas después de la inyección, dependiendo de la dosis de los parásitos de la malaria sangre escenario. Por ejemplo, los ratones se microscópicamente positivo de 24 horas cuando se les inyectó 10 7 RBC infectados por vía intraperitoneal o 10 6 RBC infectados por vía intravenosa. Medida de la densidad de glóbulos rojos Al igual que los niveles de parasitemias, glóbulos rojos (RBC) de densidad en los ratones infectados varía a lo largo del curso de la infección. Densidad de glóbulos rojos se debe medir al cabo de 1-2 horas antes del inicio de la infección de un solo y mezclado por clonación y los experimentos de clonación. Hay dos métodos para la medición de la densidad de glóbulos rojos: un recuento manual con hemocitómetro Neubauer y un conteo automático usando un Cellometer (Nexcelom Bioscience). En ambos métodos, extraer 1 l de sangre del ratón de cola con un capilar de vidrio (VWR) y diluir en 10 ml de PBS y mezclar bien. Para utilizar un hemocitómetro Neubauer, carga de 20 l de la suspensión en el hemocitómetro. Coloque el hemocitómetro en un microscopio óptico con lente de objetivo de 10x. El hemocitómetro contiene una cuadrícula dividida en 9 cuadrados grandes, y 4 cuadrados grandes en la esquina se dividen en 16 cuadrados pequeños. Cuente el número total de células en cada uno de los 16 pequeños cuadrados en las cuatro esquinas. Para evitar la parcialidad o el recuento de células que se superponen a una línea de cuadrícula, el recuento de una celda como &quot;en&quot; si se solapa las líneas de arriba oa la derecha y &quot;fuera&quot; si se solapa las líneas de abajo o de izquierda. Estimar el número de células por una pequeña plaza y se dividen por 0,00625 (el volumen de una pequeña plaza es de 6,25 nL). Esto produce el número de células por microlitro (ymu, L). De estos datos, calcular el final de la densidad de células rojas de la sangre, multiplicando con 10.000 (un factor de dilución). Enjuague la hoja de la cubierta y la cámara de contar con agua destilada y etanol al 70%, el aire seco. Por otra parte, la carga de 20 l de la suspensión en un portaobjetos Cellometer cámara de recuento. Insertar la diapositiva en una cámara de diapositivas Cellometer (el lector). Inicie el software Cellometer, seleccione la opción &quot;de células rojas de la sangre&quot; y, a introducir un factor de dilución de 10.000. Registro de la densidad de glóbulos rojos.

protocol for production of a genetic cross of the rodent malaria parasites

Variación en la respuesta a los medicamentos antimaláricos y en la patogenicidad de los parásitos de la malaria es de importancia biológica y médica. Mapas de los vínculos ha llevado a la identificación exitosa de los genes o loci subyacente varios rasgos en los parásitos del paludismo de los roedores y los humanos 1-3 4-6. El parásito de la malaria Plasmodium yoelii es una de las especies de malaria muchos aislado de roedores silvestres de África y ha sido adaptado para crecer en el laboratorio. Esta especie se reproduce muchas de las características biológicas de los parásitos del paludismo humano; marcadores genéticos como los microsatélites y marcadores de fragmentos amplificados polimorfismo en la longitud (AFLP) también se han desarrollado para el parásito de 7-9. Así, los estudios genéticos de los parásitos del paludismo de roedores se pueden realizar para complementar la investigación sobre el Plasmodium falciparum. En este sentido, demostrar las técnicas para la producción de un cruce genético de P. yoelii que fueron los primeros por primera vez por los Dres. David Walliker, Richard Carter, y sus colegas de la Universidad de Edimburgo 10. Cruces genéticos de P. yoelii y otros parásitos de la malaria de roedores se llevan a cabo mediante la infección de ratones Mus musculus con un inóculo que contiene gametocitos de dos clones genéticamente distintas que se diferencian en fenotipos de interés y permitiendo que los mosquitos que se alimentan de los ratones infectados cuatro días después de la infección. La presencia de gametocitos masculinos y femeninos en la sangre del ratón es microscópicamente confirmados antes de alimentar. Dentro de las 48 horas después de comer, en el intestino medio del mosquito, los gametocitos haploides se diferencian en gametos masculinos y femeninos, fertilizar, y forma un cigoto diploide (Fig. 1). Durante el desarrollo de un cigoto en un oocineto, meiosis parece ocurrir 11. Si el cigoto se deriva a través de la fertilización cruzada entre los gametos de los dos parásitos genéticamente distintos, los intercambios genéticos (recombinación cromosómica y cross-overs entre las cromátidas no hermanas de un par de cromosomas homólogos;. Fig. 2) puede ocurrir, resultando en la recombinación de material genético en loci homólogos. Cigoto experimenta dos divisiones nucleares sucesivas, dando lugar a cuatro núcleos haploides. Un oocineto más se convierte en un ooquiste. Una vez que el ooquiste madura, miles de esporozoitos (la descendencia de la cruz) se forman y se liberan en hemoceal mosquito. Esporozoitos se cosechan a partir de las glándulas salivales y se inyecta en un nuevo huésped murino, donde el desarrollo de la etapa pre-eritrocítica y eritrocítica se lleva a cabo. Formas eritrocíticas se clonan y se clasifican con respecto a los caracteres distintivos de las líneas parentales antes de mapeo de ligamiento genético. Control de las infecciones de los distintos clones de los padres se llevan a cabo en la misma forma que la producción de un cruce genético.

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Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Cruces genéticos de los parásitos de la malaria de roedores se llevan a cabo por la alimentación de dos parásitos genéticamente distintos a los mosquitos. Recombinante progenie clonada a partir de la sangre del ratón después de permitir que los mosquitos que pican ratones infectados. Este vídeo muestra cómo se producen los cruces genéticos de<em&gt; Plasmodium yoelii</em&gt; Y es aplicable a otros parásitos de roedores malaria.

Protocolo para la producción de un cruce genético de los parásitos de la malaria de roedores

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.1K vistas.  National Institutes of Health. Cruces genéticos de los parásitos de la malaria de roedores se llevan a cabo por la alimentación de dos parásitos genéticamente distintos a los mosquitos. Recombinante progenie clonada a partir de la sangre del ratón después de permitir que los mosquitos que pican ratones infectados. Este vídeo muestra cómo se producen los cruces genéticos de Plasmodium yoelii Y es aplicable a otros parásitos de roedores malaria.

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In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

Imágenes in vivo de los cultivos transgénicos parásitos Leishmania en un host en vivo

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Investigación

Inmunología e Infección

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

Un protocolo para la recolección y la tinción de los hemocitos del mosquito de la fiebre amarilla Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

El análisis cuantitativo de todos Influenza Tipo A Hemaglutininas viral y neuraminidasas el uso de anticuerpos Universal en simples ensayos Slot Blot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

Un protocolo Chelex simple para la extracción de ADN a partir de<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

La manipulación genética en<em&gt; Δku80</em&gt; Las cepas de Análisis Genómico Funcional de<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Retroviral transducción de células T colaboradoras como un enfoque genético para estudiar mecanismos que controlan su diferenciación y función

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new method with a powerful and simple strategy for the establishment of B-LCLs, the red blood cell lysis method. This method simplified the PBMC separation procedure with red blood cell removal, and used as little as 0.5 mL of whole blood for establishing EBV-immortalized cell lines, which can proliferate to large cell numbers in a relatively short amount time with a 100% success rate. The method is simple, reliable, time saving, and applicable to treating a large number of the clinical samples.

A simple red blood cell lysis method for establishing B-LCLs was developed with high immortalization efficiency, requiring a small amount of blood and saving time from initiation to cryopreservation.

Un simple Blood Red lisis celular Método para el establecimiento de líneas de células B linfoblastoides

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. However, effective malaria parasite targets for vaccine and chemotherapy development are still limited. This is largely due to the unavailability of relevant and practical in vivo infection models for human Plasmodium species, most notably for P.&#160;falciparum and P. vivax. Therefore, rodent malaria species have been extensively used as practical alternative in vivo models for malaria vaccine, drug targeting, immune response, and functional characterization studies of conserved Plasmodiumspp. genes. Indeed, rodent malaria models have proven to be invaluable, especially for exploring mosquito transmission and liver stage biology, and were indispensable for immunological studies. However, there are discrepancies in the methods used to evaluate the phenotypes of transgenic and wild-type asexual and sexual blood-stage parasites.&#160;Examples of these discrepancies are the choice of an intravenous vs. intraperitoneal infection of rodents with blood-stage parasites and the evaluation of male gamete exflagellation. Herein, we detail standardized experimental methods to evaluate the phenotypes of asexual and sexual blood stages in transgenic parasites expressing reporter-gene or wild-type rodent malaria parasite species. We also detail the methods to evaluate the phenotypes of malaria parasite mosquito stages (gametes, ookinetes, oocysts, and sporozoites) inside Anopheles mosquito vectors. These methods are detailed and simplified here for the lethal and non-lethal strains of P. berghei and P. yoelii but can also be applied with some adjustments to P. chabaudi and P. vinckei rodent malaria species.

Due to the striking similarities of the life cycle and biology of rodent malaria parasites to human malaria parasites, rodent malaria models have become indispensable for malaria research. Herein, we standardized some of the most important techniques used in the phenotypic analysis of wild-type and transgenic rodent malaria species.

Análisis fenotípico de las etapas de la sangre asexual y sexual del parásito de la malaria de los roedores y las etapas de los mosquitos

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Un novedoso sistema de alimentador-libre para la producción masiva de células de asesino naturales murinos In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate hosts, respectively. While pathogenic symptoms of leishmaniasis can vary widely, from benign cutaneous lesions to highly fatal visceral disease forms depending on the infective species, all Leishmania species reside inside host macrophages during the vertebrate stage of their lifecycle. Leishmania infectivity is therefore directly related to its ability to invade, survive and replicate within parasitophorous vacuoles (PVs) inside macrophages. Thus, assessing the parasite&#39;s ability to replicate intracellularly serves as a dependable method for determining virulence. Studying leishmaniasis development using animal models is time-consuming, tedious and often difficult, particularly with the pathogenically important visceral forms. We describe here a methodology to follow the intracellular development of Leishmania in bone marrow-derived macrophages (BMMs). Intracellular parasite numbers are determined at 24 h intervals for 72 - 96 h following infection. This method allows for a reliable determination of the effects of various genetic factors on Leishmania virulence. As an example, we show how a single allele deletion of the Leishmania Mitochondrial Iron Transporter gene (LMIT1) impairs the ability of the Leishmania amazonensis mutant strain LMIT1/&#916;Lmit1 to grow inside BMMs, reflecting a drastic reduction in virulence compared to wild-type. This assay also allows precise control of experimental conditions, which can be individually manipulated to analyze the influence of various factors (nutrients, reactive oxygen species, etc.) on the host-pathogen interaction. Therefore, the appropriate execution and quantification of BMM infection studies provide a non-invasive, rapid, economical, safe and reliable alternative to conventional animal model studies.

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

All pathogenic Leishmania species reside and replicate inside macrophages of their vertebrate hosts. Here, we present a protocol to infect murine bone marrow-derived macrophages in culture with Leishmania, followed by precise quantification of intracellular growth kinetics. This method is useful for studying individual factors influencing host-pathogen interaction and Leishmania virulence.

Cuantificación del crecimiento intracelular dentro de los macrófagos es un rápido y confiable método para evaluar la virulencia de los parásitos de Leishmania

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...