Bu çalışma DJB için NIH hibe (AI041930, AI073142, AI075931 ve AI091461) tarafından desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Fox, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+II+Toxoplasma+gondii+KU80+knockout+strains+enable+functional+analysis+of+genes+required+for+cyst+development+and+latent+infection.">Type II Toxoplasma gondii KU80 knockout strains enable functional analysis of genes required for cyst development and latent infection.</a> Eukaryot. Cell. 10, 1193-1206 (2011).</li><li>Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+replacements+in+Toxoplasma+gondii+strains+deficient+for+nonhomologous+end+joining.">Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining.</a> Eukaryotic Cell. 8, 520-529 (2009).</li><li>Fox, B. A., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avirulent+uracil+auxotrophs+based+on+disruption+of+orotidine-5'-monophosphate+decarboxylase+elicit+protective+immunity+to+Toxoplasma+gondii.">Avirulent uracil auxotrophs based on disruption of orotidine-5'-monophosphate decarboxylase elicit protective immunity to Toxoplasma gondii.</a> Infection and Immunity. 78, 3744-3752 (2010).</li><li>Hortua Triana, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+molecular+characterization+of+the+pyrimidine+biosynthetic+enzyme+dihydroorotate+dehydrogenase+from+Toxoplasma+gondii.">Biochemical and molecular characterization of the pyrimidine biosynthetic enzyme dihydroorotate dehydrogenase from Toxoplasma gondii.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 184, 71-81 (2012).</li><li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+the+model+apicomplexan.">Toxoplasma gondii: the model apicomplexan.</a> Int. J. Parasitol. 34, 423-432 (2004).</li><li>Gajria, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToxoDB:+an+integrated+Toxoplasma+gondii+database+resource.">ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource.</a> Nucleic Acids research. 36, 553-556 (2008).</li><li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma:+the+next+100+years.">Toxoplasma: the next 100 years.</a> Microbes and infection / Institut Pasteur. 10, 978-984 (2008).</li><li>Butcher, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+rhoptry+kinase+ROP16+activates+STAT3+and+STAT6+resulting+in+cytokine+inhibition+and+arginase-1-dependent+growth+control.">Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control.</a> PLoS pathogens. 7, e1002236 (2011).</li><li>Daher, W., Klages, N., Carlier, M. F., Soldati-Favre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+Toxoplasma+gondii+formin+3,+an+actin+nucleator+dispensable+for+tachyzoite+growth+and+motility.">Molecular characterization of Toxoplasma gondii formin 3, an actin nucleator dispensable for tachyzoite growth and motility.</a> Eukaryot. Cell. 11, 343-352 (2012).</li><li>Fentress, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+immunity-related+GTPases+by+a+Toxoplasma+gondii-secreted+kinase+promotes+macrophage+survival+and+virulence.">Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence.</a> Cell Host Microbe. 8, 484-495 (2010).</li><li>Musiyenko, A., Majumdar, T., Andrews, J., Adams, B., Barik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRMT1+methylates+the+single+Argonaute+of+Toxoplasma+gondii+and+is+important+for+the+recruitment+of+Tudor+nuclease+for+target+RNA+cleavage+by+antisense+guide+RNA.">PRMT1 methylates the single Argonaute of Toxoplasma gondii and is important for the recruitment of Tudor nuclease for target RNA cleavage by antisense guide RNA.</a> Cellular microbiology. 14, 882-901 (2012).</li><li>Straub, K. W., Peng, E. D., Hajagos, B. E., Tyler, J. S., Bradley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+moving+junction+protein+RON8+facilitates+firm+attachment+and+host+cell+invasion+in+Toxoplasma+gondii.">The moving junction protein RON8 facilitates firm attachment and host cell invasion in Toxoplasma gondii.</a> PLos Pathog. 7, e1002007 (2011).</li><li>Szatanek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cactin+is+essential+for+G1+progression+in+Toxoplasma+gondii.">Cactin is essential for G1 progression in Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 84, 566-577 (2012).</li><li>Donald, R. G., Carter, D., Ullman, B., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+tagging,+cloning,+and+expression+of+the+Toxoplasma+gondii+hypoxanthine-xanthine-guanine+phosphoribosyltransferase+gene.+Use+as+a+selectable+marker+for+stable+transformation.">Insertional tagging, cloning, and expression of the Toxoplasma gondii hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene. Use as a selectable marker for stable transformation.</a> J. Biol. Chem. 271, 14010-14019 (1996).</li><li>Donald, R. G., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+knock-outs+and+allelic+replacements+in+Toxoplasma+gondii:+HXGPRT+as+a+selectable+marker+for+hit-and-run+mutagenesis.">Gene knock-outs and allelic replacements in Toxoplasma gondii: HXGPRT as a selectable marker for hit-and-run mutagenesis.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 91, 295-305 (1998).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Borotz, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+characterization+of+a+mutant+resistant+to+6-thioxanthine.">Toxoplasma gondii: characterization of a mutant resistant to 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 79, 374-382 (1994).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2, 1-4 (2007).</li><li>Oldenburg, K. R., Vo, K. T., Michaelis, S., Paddon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination-mediated+PCR-directed+plasmid+construction+in+vivo+in+yeast.">Recombination-mediated PCR-directed plasmid construction in vivo in yeast.</a> Nucleic Acids Res. 25, 451-452 (1997).</li><li>Fox, B. A., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+lacks+the+enzymes+required+for+de+novo+arginine+biosynthesis+and+arginine+starvation+triggers+cyst+formation.">Toxoplasma gondii lacks the enzymes required for de novo arginine biosynthesis and arginine starvation triggers cyst formation.</a> Int. J. Parasitol. 34, 323-331 (2004).</li><li>Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+tools+for+the+identification+and+analysis+of+drug+targets+in+Toxoplasma+gondii.">Molecular genetic tools for the identification and analysis of drug targets in Toxoplasma gondii.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 219, 247-259 (1996).</li><li>Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii.">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods in Cell Biology. 45, 27-63 (1994).</li><li>Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+tachyzoite+to+bradyzoite+differentiation+mutants+in+Toxoplasma+gondii+reveals+a+hierarchy+of+gene+induction.">Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction.</a> Molecular Microbiology. 44, 721-733 (2002).</li><li>vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F., Lamers, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+in+'intracellular'+buffer+increases+cell+survival.">Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival.</a> Nucleic Acids Research. 20, 2902 (1992).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Bzik, D. J., Honsinger, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+mechanism+of+the+parasitostatic+action+of+6-thioxanthine.">Toxoplasma gondii: mechanism of the parasitostatic action of 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 99, 235-243 (2001).</li><li>Mital, J., Meissner, M., Soldati, D., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+expression+of+Toxoplasma+gondii+apical+membrane+antigen-1+(TgAMA1)+demonstrates+that+TgAMA1+plays+a+critical+role+in+host+cell+invasion.">Conditional expression of Toxoplasma gondii apical membrane antigen-1 (TgAMA1) demonstrates that TgAMA1 plays a critical role in host cell invasion.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 4341-4349 (2005).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Burada hedeflenen gen silme, gen yerine, ve / veya etiketli genlerin sahip genetik olarak manipüle döl etkin kurtarma sağlamak için Δ Ku80 parazit suşları hedef verimli gen için bir protokol sağlar. Bu yöntemlerin ardışık yürütüm 1-3 tek veya birden fazla hedef içeren genetik manipülasyonlar parazit mutantların izolasyonu için güvenilir bir yöntem sağlar. Bir delesyonu üretimi birçok faktöre bağlıdır da, sunulan strateji ve protokole Δ Ku80 suşunun kullanımı büyük ölçüde T. kesin olarak tanımlanmış mutant yapma verimliliği ve kolaylığını arttırmaktadır Fonksiyonel çalışmalar için genomik gondii. T. genomu eşeysiz aşamalarında gondii grubu yarı yarıya edilir. Bu nedenle, bir gen silmek için planlama yapmak için bir göz genin in vitro gerekli olmayabilir olmasıdır. Bununla birlikte, küçük kalkan veriminiΔ Ku80 suşları ting gen tırnakları son derece yüksek olduğunu ve bu önemli ölçüde bozulmuş çoğaltma oranları ile mutant suşların izolasyonu sağlar. Bir hedef gen gerekli ise, parazit genellikle seçimi sırasında çoğaltmak için ateşkes. Hedeflenen genetik manipülasyon bir diğer kritik faktör genomik hedef kanadını en az 620 bp tespit hedeflenen entegrasyon 2 elde etmek için gerekli olan mükemmel bir homoloji olduğunu. Homoloji uzun bölgeleri hedefleyen ve yaklaşık 1000 bp DNA yanları hedef 1-4 güvenilir ve verimli bir yaklaşımdır kullanarak yüksek verim üretmek. Bu nedenle, genomik hedef alan yanları T. Aynı soydan üretilen önemlidir genetik olarak manipüle ediliyor gerginlik olarak gondii (RH, Pru). Yeterli homolojiye eksikliği sıklıkla bir genomik hedef alan yan olarak hedeflenen entegrasyonu ile sonuçlanabilir, ancak diğer olamaz. Eksik entegrasyon veya bir nakavt ma elde etmek için başarısızlıky da epizomal sebat nedeniyle. Hemen transfeksiyon sonra, hedef moleküllerin tüm epizomlar nonintegrated ve bazen hedef moleküller nesiller için epizomlar olarak devam edebilir. ~ 1 Kbp hedef DNA yanları kullanarak ve önceki yeniden alt klonlama için seçimi altında parazitler geçmek için devam sık epizomal sebat ile ilgili sorunları giderir. Bir nakavt doğrulanır ve HXGPRT işareti kaldırıldıktan sonra, gen hedeflemesi stratejisi 1-3 tek bir parazit gerginlik birden fazla gen silme oluşturmak için ikinci bir Goa üzerinde tekrarlanabilir. Silme, değiştirme ya da etiketli genlerin üretimi de farklı seçilebilir belirteçler (bleomisin, CAT, primetamin, dayanıklı DHFR, vs) ile yapılabilir. CAT seçilebilir marker şu tip II Δ Ku80 Pru genom 1 mevcut olsa da, bu işaretçi HXGPRT kullanılarak temizlenebilir </em&gt; seçimi Burada açıklanan protokol. Bizim ellerde, HXGPRT seçimi tek kopyasını hedef ekleme MPA + X orta. HXGPRT sağlam seçimi için yeterli olduğu en yüksek hedef verimlilik ile en güvenli ve en verimli işareti aynı zamanda bir hedeflenen silinmesi için sadece şu anda yararlı bir yaklaşım sağlar 6-thioxanthine (6TX) seçimi 2,3 kullanarak seçilebilir işaretleyici (Şekil 3). Böylece bu protokolü birkaç hedeflenen genetik manipülasyonlar ile tanımlanan mutant suşlar geliştirmek için tek geçerli yaklaşım sağlar. Bu protokol, Toxoplasma gondii Δ Ku80 suşları hedeflenen genetik manipülasyon için bir değerli ve etkili bir yöntem sağlar ve tek bir gen, bir gen ailesi veya genom fonksiyonel genomik çalışmaları analizi için de geçerlidir. Önce Δ Ku80 suşları 1,2 durumu için, bu yaklaşımların ine nedeniyle yaygın olarak mümkün değildiBu yöntemlerin Verim. Sonuç olarak, bu protokol Toxoplasma gondii hedeflenen genetik manipülasyon için yaygın olarak uygulanabilir ve parazit biyoloji, konak cevabı, ve işlevsel genomik üzerinde sorular bir dizi ele ilgilenen tüm araştırmacılar için erişilebilir.

Toxoplasma sık sık ortak bir obligat hücre içi protozoandır kronik ve hayvanlarda ve insanlarda 5 geniş bozar. Bu patojen tarafından 1 milyardan fazla insan şu anda olduğu tahmin ve kronik bulaşmıştır. T. neden olduğu hastalığın öneminin yanı sıra in vitro büyüme ve mükemmel fare modellerinde T. yaptık gondii enfeksiyonu, deneysel araçları, güçlü genomik kaynak 6 artan durumu, kolaylığı gondii hücre içi ökaryot patojenler ve sıtma (Plasmodium sp.) ve Cryptosporidiosis (Cryptosporidium) 5,7 gibi yıkıcı hastalıklara neden diğer önemli Apicomplexan parazitlerin daha geniş çalışma için önde gelen bir model sistem. Bir model organizma olarak Toxoplasma gondii önemli bir sınırlama genetik manipülasyonlar hedef taşımak döl verimsiz kurtarma olmuştur. Bu problemin çözümündeGen hedefleme m, T. yabani tip suşları nonhomologous rekombinasyon çok yüksek frekanslı göre homolog rekombinasyon bir düşük frekans nedeniyle yaygın DNA homoloji genetik çalışmalar 2&#39;de kullanılan DNA hedef moleküller sağlanmaktadır gondii bile. Biz son zamanlarda genetik tip nonhomologous rekombinasyon en önemli yolu bloke Ku80 proteini 1,2 kodlayan gen silerek I ve tip II Toxoplasma gondii suşları. I ve tip II Δ Ku80 suşları normal büyüme oranları, boyut ve in vitro ve in vivo, in vitro olarak taşizoit ve bradizoit aşamaları sırasında ve hem de in vivo davranış sergileyen Elde edilen tipi, ancak, bu suşlar esasen% 100 homolog rekombinasyon frekansını ve bu belgedeki fenotip birkaç Tho için birkaç yüz ile hedeflenen genetik manipülasyon hızla izole istenen döl olasılığını artırırusand kat 1,2,4. Son topluluk çapında I ve tip II Δ Ku80 suşları hızını önemli ölçüde hızlandırıldığını sahip tipi kullanımı çeşitliliği, hem de T. hedeflenen genetik yaklaşımların başarı oranı gondii 1-4,8-13. Burada T. Δ Ku80 suşları hedef gen silme, gen değiştirme, ve gen etiketleme için kapsamlı bir protokol açıklar gondii. Biz tasarım ve güvenilir Toxoplasma gondii Δ Ku80 suşları belirli genleri veya genetik lokus için genetik manipülasyonlar hedef göstermek.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overlap Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4 nmole Ultramer DNA oligos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Validation Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>100 nmole DNA Oligo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Strain #90845</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Designation FY834</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shuttle Vector pRS416</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>87521</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH10B E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12033-015</td>
			<td>SOC broth in kit with E. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resuspension Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Buffer P1 in QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-BG05</td>
			<td>0.5 mm acid-washed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiacube Automated Robotic Work Station</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation Cuvette</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9104-5050</td>
			<td>2 mm-gap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX600 electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxiprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12662</td>
			<td>QIAprep Spin Maxiprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 Canted neck plug seal flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430168</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 cm2 Canted Neck plug seal flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430823</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC1041</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swin-lok Filter Holder</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>420200</td>
			<td>25-mm-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110612</td>
			<td>Nucleopore Track-etched Membrane 3 mm pore size, 25-mm-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycophenolic acid (MPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xanthine (X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Tissue Culture Tray</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Tissue Culture Tray</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Eagle Media</td>
			<td>Lonza Biowhittaker</td>
			<td>12-611F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-111</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (Anti-Anti)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Column</td>
			<td>Primm Labs</td>
			<td>PAE-100</td>
			<td>Easy Clean DNA Extraction Spin Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-thioxanthine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue DNA Minikit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Freeze/Recovery Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>126-48-010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td>minus calcium, minus magensium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic manipulation in &delta;ku80 strains for functional genomic analysis of toxoplasma gondii

Homolog rekombinasyon kullanılarak hedef genetik manipülasyon gen fonksiyonu ve fenotip (ler) daha ayrıntılı bir görünümünü elde etmek için işlevsel genom analizleri için tercih edilen bir yöntemdir. Hedeflenen gen silme, hedef mutasyonlar, tamamlanmaktadır gen fonksiyonu ve / veya etiketli genleri ile mutant suşlar gelişimi bu genetik manipülasyonlar verimli çift tarafından entegrasyon aracılı ile ilgi gen odağı hedeflenebilir özellikle, gen fonksiyonu yönelik güçlü stratejiler sağlar homolog rekombinasyon üzerinde çapraz. Toxoplasma gondii nonhomologous rekombinasyon, fonksiyonel genomik analiz çok yüksek oranları nedeniyle daha önce belirli genetik lokus için gen silme ve gen değiştirmeleri hedef için etkin yöntemler yokluğu ile sınırlı kalmıştır. Son zamanlarda, tip I ve tip II T. suşları nonhomologous rekombinasyon en önemli yolu kaldırıldı Gen encodin silerek gondiig Ku80 proteini 1,2. Δku80 suşları taşizoit (akut) ve in vitro ve in vivo olarak bradizoit (kronik) aşamaları esnasında normal olarak davranır ve homolog rekombinasyon esasen% 100 frekanstan sergiler. Δ Ku80 suşları tek gen yanı sıra genom ölçekli 1-4 fonksiyonel genomik çalışmalar mümkün olun. Burada, I ve tip II Δku80Δhxgprt suşları T. gen hedef yaklaşımlar geliştirmek için türünü kullanarak yöntemleri rapor gondii. Biz hipoksantin-ksantin-guanin phosphoribosyltransferase (HXGPRT) seçilebilir marker hedef ekleme veya silme ile gen silme, gen yerine, ve etiketli genleri oluşturmak için etkin yöntemler özetlemektedir. Protokol hedef geni tarif parazit genomunun fonksiyonel analiz ilerlemek için ve taşıma tek suşları geliştirmek Δku80 suşları çeşitli şekillerde kullanılabilirçoklu genetik manipülasyonlar hedef. Bu genetik yöntem ve sonraki fenotipik testlerin uygulanması T. biyolojisi temel ve eşsiz yönlerini ortaya çıkaracaktır gondii ve sıtma (Plasmodium sp.) ve kriptosproidiyozis (Cryptosporidium) neden ilgili önemli insan patojenleri.

Ayrıntılı bir şablon restriksiyon enzim bölgesi yerleştirilmesi ve bir de HXGPRT arasında sürekli silme için genetik hedefleme ve gen doğrulama hedef, hem de plazmit yapımını kolaylaştırmak primerlerin üretimi de dahil olmak üzere bir gen silmek için bir hedefleme plazmid oluşturmak için sağlanan Tek aşamalı bir süreç (Şekil 1A-C, Şekil 2A, Şekil 3A). Genel şematik olarak, örneğin, bir hedef gen silinmesi (Şekil 2A), bir nakavt silme doğrulamak için kullanılan bir primer çifti yapmak için sunulmuştur, tip I rop18 (Şekil 2B), ve bir PCR doğrulama için temsili sonuçlar gösterilmektedir (Şekil 2C). Bu temsili bir sonuç hedef nispeten zor olan genetik lokus elde edilebilir sonuçlar aralığını göstermek için gösterilir. Başarılı bir şekilde hedeflenen gen silme geninin olmaması ile sonuçlanacaktırzasyonu PCR ürünü (PCR 1), 3 varlığı &#39;genomik hedef kanadını (PCR2) ve düzgün 5 arasında entegre HXGPRT seçilebilir marker varlığı&#39; ve (PCR3 ve PCR4) silme tanımlamak 3 &#39;genomik hedef yanları . Klonlar, 3, 4, 5, 6, 8, 9 ve 11 HXGPRT Goa (Şekil 2C) yerini alan hedefli gen delesyonlu (tırnaklar) doğrulanır. Bir gen silinmesi içermeyen bir klon bantlama desenleri çeşitli ile temsil edilebilir. Tipik olarak, bir gen silinmesi olmayan bir klon PCR1 ve PCR2 için gözlenen bantlar ile ebeveyn suş (ebeveyn deseni) ayna değil, klon 1 ve 2 (Şekil 2C) için görüldüğü gibi PCR3 veya PCR4 süreliğine. Bu &quot;ebeveyn model&quot; birkaç potansiyel mekanizmaları doğar. Bazen, MPA dayanıklı seçilen parazit plazmid hedef pΔGOI bir nonintegrated kalıcı epizomlar taşımak, ve biz devam seçimi genellikle bu epizomlar zorlar unutmayınentegre. Biz de Δ pΔGOI istenmeyen entegrasyonu nedeniyle Ku80 gerilme DHFR 5 &#39;ve 3&#39; promotör elemanları, DHFR lokus ya da içine ya da kısmen silinmiş HXGPRT içine ile ifade edilen bir HXGPRT cDNA ihtiva eden plazmid hedef türü bazı nadir arka gözlemlemek odağı 14. Bu nadir bir olay bir hedef entegrasyon iken, amaçlanan entegrasyon değildi ve herhangi bir gen değiştirme stratejisi tasarımında hatırlamak önemli bir nokta olarak hizmet vermektedir. Hedefleme pΔGOI devam 120 bp daha büyük DNA homoloji plazmid istenmeyen bir arka plan geri verebilir Δ Ku80 suşları 2 rekombinasyon için bir alternatif site sağlayabilir. HXGPRT seçilebilir işaret türü tip II DNA ile karşılaştırıldığında nükleotid polimorfizmleri var ben dizileri dayalı olduğu için tip II Pru Δ Ku80 gerginlik bu arka plan azaltılabilir veya varolmayan tip I ile karşılaştırıldığında hangibüyük ölçüde, tip II Pru Δ Ku80 suşu 1 kullanılarak yapılan deneyler, bu nadir arka azaltır. Bir gen lokusu (silinemez) esastır, ya da lokustaki frekans hedef, ya da son derece düşük bir gen varsa eğer epizomlar kolayca büyüme ve seçim yoluyla ortadan değildir [nonintegrated], bu ebeveyn desen MPA gözlenen desen hakim olacak ısrar dirençli klonlar. Alternatif olarak, hedef DNA molekülü bazen sadece 5 &#39;ya da 3&#39; genomik hedef alan yan ve bir grup (ama ikisini değil) Klon 10 görüldüğü gibi PCR1 ve PCR2 ile birlikte (5 PCR3 veya PCR4 ya da görülmektedir bütünleşmeyen görülmektedir &#39;entegrasyon) ve klon 7 (3&#39; entegrasyon) (Şekil 2C). Bu modeller HXGPRT entegre ama bu hedef entegrasyon ilgi gen silmez lokustaki hedef plazmid entegrasyonu üzerinden tek bir haç pek rastlanmayan öneririz. Bu model (şerit 7 ve Şekil 2C 10) emBu hedeflenen entegrasyon yerine meydana doğrulamak için PCR verileri rapor ihtiyacı phasizes tek homolog üzerinde çapraz ve hedef molekülün bir nonhomologous ikinci entegrasyon. Nadiren, bir ebeveyn desen ve bir hedef silme desen de temsil klon 12 (Şekil 2C) tarafından temsil edilen bir genetik karışım görüyoruz. Bu model büyük olasılıkla iyi bir klonlama aynı yerde mevcut iki parazit genotip gelen vesilesiyle ortaya çıkar. Δ ku80Δgoi ikinci HXGPRT ortadan kaldırılması için genel bir şematik :: HXGPRT suşundan HXGPRT silmek için (Şekil 3A) gösterilmiştir. Klon 4, 7, 9, 11 ve 12 (Şekil 3C) &#39;de görüldüğü gibi Δ Ku80 Δ gra2 :: HXGPRT (Şekil 3B) HXGPRT çıkarılması doğrulamak için kullanılan bir primer çifti PCR5 benzersiz ~ 1.2 Kbp bant güçlendirir. HXGPRT odağı, bir ~ 3 kaldırılır değilse.4 Kbp bant (klon 1, 2, 3, 6, 8, 10, ve ebeveyn kontrolü) görülmektedir. Çeşitli mekanizmalar HXGPRT ortadan kaldırılması (6TX seçimi) daha zorlu ve HXGPRT bütünleştirilmesi (MPA + X seçimi) daha az verimli hale getirmek için hareket ederler. MPA seçimi 6TX seçimi 14,16 daha sadece daha fazla etkilidir. Buna ek olarak, HXGPRT ifade yüksek düzeyde MPA seçim 16,24 için daha 6TX seçimi için ihtiyaç vardır. Sonuç olarak, HXGPRT enzim aktivitesi veya mutasyon ya da bir genin lokus HXGPRT ifade seviyesini azaltmak epigenetik değişiklikler azaltabilir mutasyonlar potansiyel 6TX seçimi etkinliğini ortadan kaldırabilmektedir. Hatta 6TX seçimi bu zorluklarla, Δ Ku80 suşları 6TX seçimi başarı oranı 1-3 ilk denemede% 90 daha büyüktür. Protein kodlayan genlerin doğrudan C-terminal etiketleme için genel bir şeması (Şekil 4) gösterilmiştir. Budüzeni etiketli HXGPRT geninin 3 &#39;arasında homolog rekombinasyon üzerinden çift çapraz yoluyla doğrudan entegrasyon kullanır ve aynı zamanda yukarıda tarif edilenlere benzer bir doğrulama stratejiler kullanılmaktadır. Bir gen Bu plazmid bir bağımsız izole hedef DNA ile ikinci bir transfeksiyon kullanılarak doğrulanabilir önemli bir gen olduğundan şüphelenilen zaman. Bu tür düzenleyicili gen ifadesi için düzenleri gibi alternatif yöntemleri, bir gen 25 gerekli ise daha fazla doğrulamak için kullanılabilir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1.jpg" /> Şekil 1. Plazmid DNA, bir hedefleme tasarımı nedeniyle genel bakış. Tasarımı için bir. Şematik PCR pRS416 servis vektör ve HXGPRT minigen kaset için 33 bp çakışıyor ile 5 &#39;ve 3&#39; hedef yanları yükseltmek için kullanılan astar üst üste. Şematik tasvir Astarlar vardı5 &#39;ve 3&#39; pΔROP18 10 hedef yanları. bir hedef DNA molekülü tasarımı B. Genel strateji oluşturmak için kullanılır. PΔGOI omurgası pRS416 servis vektör içeren urasil (URA) ve ampisilin (AMP) seçilebilir işaretleri olduğunu. Bir ~ 1 Kbp 5&#39;tir pRS416 takılan &#39;F1 ve R1 primerler kullanılarak HXGPRT minigen kaset ve pRS416 için çakışıyor ile genomik DNA amplifiye DNA hedef kanadında, bir ~ 1 Kbp 3&#39; DNA hedef kanadı için çakışıyor ile genomik DNA yükseltilir HXGPRT minigen kaset ve F2 ve R2 astar ve HXGPRT minigen kaset kullanarak pRS416. Aşağıdaki benzersiz kısıtlama enzim sindirimi siteleri astar eklenir: F1 astar RE.X (kısıtlama enzim X kesim sitesi) R2 RE.Y, DNA hedef kanadını 5 &#39;5 sonunda&#39; plazmid kesmek için tüketim HXGPRT min R1 ve F2 astar DNA hedef yan ve RE.Z 3 &#39;3 sonunda&#39; plazmid kesmek için astarrop18 bölgesinin silinmesi için hedef yapı oluşturmak için kullanılan igene kaseti. ° C. Primer dizileri. kalın bölgeler T. uygun gondii&#39;den genomik dizisi ve nonbold bölgeler pRS416 ve HXGPRT minigen kaseti ile üst üste restriksiyon enzim bölgesi ve sekanslarına karşılık gelir. HX_F ve HX_R primer çifti HXGPRT minigen kaset 14 güçlendirir. Primerler 5&#39;ten-3 &#39;okuyun. Fentress ve arkadaşları 10 uyarlanan Tablo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig1large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2.jpg" /> Şekil 2. HXGPRT kullanarak bir geninin iptali için protokol genel bir bakış. Bir. Disruption çift çapraz tarafından Δ ku80Δhxgprt gerginlik bir Goa bir ~ 1 Kbp 5 &#39;DNA hedef yan ve bir ~ 1 Kbp 3&#39; plazmid pΔGOI DNA hedef yan kullanarak homolog rekombinasyon olay. Bir PCR PCR1 kullanarak strateji, PCR2, PCR3 ve PCR4 (ölçekli değildir) GOI odağı hedef HXGPRT entegrasyonu ve silme ile klonlar doğrulamak için genotip doğrulama sağlayan gösterilmiştir. B. Örnek primer çiftleri rop18 en silme doğrulamak için tasarlanmıştır . ROP18_DF ve ROP18_DR PCR1, ROP18_ExF ve ROP18_CxR PCR2, ROP18_CxF ve DHFR_CxR PCR4 (Şekil 2A bakınız) yükseltmek PCR3 ve DHFR_CxF ve ROP18_CxR yükseltmek yükseltmek yükseltmek. Primerler 5&#39;ten-3 &#39;okuyun. Tablo Fentress ve ark HXGPRT kullanarak bir hedef gen silme (rop18) doğrulama 10. C. Temsilcisi sonuçları adapte. MPA içinde Δ ku80Δhxgprt ve seçim haline plazmid pΔROP18 takiben transfeksiyon +X, MPA + X dirençli klonlar rop18 en silinmesi için test edildi. Ebeveyn gerginlik kontrolü PCR 3 (~ 1.200 bp) ve PCR için PCR 1 (~ 400 bp) ve PCR 2 (~ 650 bp) ürün için pozitif ve negatif 4 (~ 1.300 bp) ürün. Bir hedef Goa nakavt PCR2, PCR3 ve PCR4 ürünleri için pozitif ve (Şekil 2A bakınız) PCR 1 ürün için negatiftir. Gösterildiği PCR1 ve PCR2 (üst panel) sonuçlarını temsili paneller PCR3 (orta panel) ve PCR4 (alt panel) vardır. Klonlar, 3, 4, 5, 6, 8, 9 ve 11 klon hedeflenen bir gen silinmesi olayları tanımlar PCR 1, PCR2, PCR3 ve PCR4 arasında doğru bir bant deseni gösterir. Klonlar, 1, 2, 7, 10 ve 12 gen silme değildir ve diğer potansiyel temsili sonuçlar karşılık gelmektedir. (C = ebeveyn kontrol suşu Δ ku80Δhxgprt, M = boyutu işaretleri). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig2large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3," fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3.jpg" /> Şekil 3,. İlgi konusu genin HXGPRT silmek için yeniden hedefleme için protokol bakış. Çift çapraz tarafından HXGPRT seçilebilir marker çıkarılması gerginlik Δ ku80Δgoi homolog rekombinasyon olay :: HXGPRT bir ~ 1 Kbp 5 &#39;DNA hedef yan ve bir ~ 1 Kbp 3&#39; plazmid pΔGOIc DNA hedef yan kullanarak A. Stratejisi. Genotip doğrulama için PCR stratejisi (ölçekli değildir) silme yayılan bir PCR ürünü (PCR5) için test için bir primer çifti kullanılarak tasvir edilmiştir. B. gra2 gelen HXGPRT seçilebilir marker çıkarılması doğrulamak için tasarlanmış bir temsilci primer çifti gerginlik Δ ku80Δgra2 içinde odağı :: HXGPRT. Astarlar GRA2 _CLF ve GRA2_CxR PCR5 yükseltmek. Astarlar<html> 5 ila 6TX içinde Δ ku80Δgoi :: HXGPRT ve seçim plazmid pΔGOIc arasında aşağıdaki transfeksiyon elde edilebilir 6TX dirençli klonların. ° C. Örnek paneli-3 &#39;okuyun. Klonlar 4, 7, 9, 11 ve 12 HXGPRT marker hedef silme (~ 1.2 Kbp ürün olduğunu kanadını &#39;5 ile hafif üst üste yan&#39; ve 3 &#39;dışında 3 açıklıklı karşılık PCR5 en doğru bantlama desen sergilemek yan). Klonlar 1, 2, 3, 6, 8, ve 10 (bu grup hafif) Bu klonlar izin 6TX direnç bir ölçüde sergiledi rağmen, ebeveyn klon genotip karşılık 3.4 Kbp ~ yaklaşık beklenen bant deseni temsil kendi seçimi (bu fenotip zaman (protokol 2.1 (adım 8) olarak not ve Temsilcisi Sonuçlar bölümüne bakın) kapatma HXGPRT ifade ile kendiliğinden ortaya çıkabilir. (C = ebeveyn kontrol suşu Δ ku80Δgoi :: HXGPRT, M = boyutu işaretleri).w.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig3large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; büyük rakam görmek için buraya tıklayın. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4.jpg" /> Şekil 4. Bir proteinin C-terminal ucuna etiketlemek için bir hedef DNA molekülünün tasarımı. Stratejisi aynı zamanda bir 3 &#39;alt düzenleyici bölge olarak işlev HXGPRT marker yeteneğine dayanır. PΔGOItag omurgası pRS416 servis vektör içeren urasil (URA) ve ampisilin (AMP) seçilebilir işaretleri olduğunu. DNA hedef kanadını için çakışıyor ile genomik DNA amplifiye bir ~ 1 Kbp 5 &#39;Fgoi ve rtag astar, bir ~ 1 Kbp 3 kullanarak HXGPRT minigen kaset ve pRS416 için çakışıyor ile genomik DNA amplifiye DNA hedef kanadını&#39; olduğunu pRS416 takılı F2 ve R2 ile HXGPRT minigen kaseti ve pRS416astar ve HXGPRT minigen kaset. 5 &#39;DNA hedef yan yerine bitirme kodonunun izlediği etiketi (HA, myc, His, vs) bir sonlandırma kodonu ile değiştirir. MPA + X seçimi ve C-terminal etiketi ve bir alt-HXGPRT entegre ve HXGPRT işaretleyici aşağıdaki bir konuma 3 &#39;UTR hareket eder. Aşağıdaki benzersiz kısıtlama enzim sindirimi siteleri astar eklenir: Fgoi astar RE.X (kısıtlama enzim X kesim sitesi) DNA hedef yan 5 &#39;5 sonunda&#39; plazmid kesilmiş ve RE.Y &#39;de plazmid yapımı için kullanımına yeniden hedef etiketli gen lokusu silmek için HXGPRT minigen kaset tüketim için rtag ve F2 astar olarak DNA hedef kanadını 3 &#39;3 sonunda&#39; plazmid ve RE.Z kesmek için R2 astar 3 &#39;UTR yerleştirilmesi geri yüklenir HXGPRT işareti.

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Manipulation in Î”ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii at JoVE.com

Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

Burada, tip I ve tip II olarak kullanmak için bir yöntem rapor<em&gt; Δku80</emBir&gt; suşları<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Verimli bir şekilde işlev genom analizleri için hedeflenen gen silme ve gen yedek elde etmek için.

Genetik Manipülasyon<em&gt; Δku80</emFonksiyonel Genomik Analiz&gt; Suşlarının<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

genetic-manipulation-ku80-strains-for-functional-genomic-analysis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

16.9K Görüntüleme.  The Geisel School of Medicine at Dartmouth. Burada, tip I ve tip II olarak kullanmak için bir yöntem rapor Δku80 suşları Toxoplasma gondii Verimli bir şekilde işlev genom analizleri için hedeflenen gen silme ve gen yedek elde etmek için.

Video: Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with causing food- and water-borne disease outbreaks. The definitive host is the feline species where sexual replication occurs resulting in the development of the highly infectious and environmentally resistant oocyst. Infection occurs via ingestion of tissue cysts from contaminated meat or oocysts from soil or water. Infection is typically asymptomatic in healthy individuals, but results in a life-long latent infection that can reactivate causing toxoplasmic encephalitis and death if the individual becomes immunocompromised. Meat contaminated with T. gondii cysts have been the primary source of infection in Europe and the United States, but recent changes in animal management and husbandry practices and improved food handling and processing procedures have significantly reduced the prevalence of T. gondii cysts in meat1, 2. Nonetheless, seroprevalence in humans remains relatively high suggesting that exposure from oocyst contaminated soil or water is likely. Indeed, waterborne outbreaks of toxoplasmosis have been reported worldwide supporting the theory exposure to the environmental oocyst form poses a significant health risk3-5. To date, research on understanding the prevalence of T. gondii oocysts in the water and environment are limited due to the lack of tools to detect oocysts in the environment 5, 6. This is primarily due to the lack of efficient purification protocols for obtaining large numbers of highly purified T gondii oocysts from infected cats for research purposes. This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation7.

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation

Yüksek Saflaştırılmış Alınması Toxoplasma gondii Süreksiz Sezyum Klorür Gradient ookistleri

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

Aktif Kemik İliği türetilen Makrofajlar ve Bradyzoite Koşullar Toxoplasma gondii Kist Duvar Oluşumu

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged antigen-specific T cell receptor (TCR) have been an indispensable tool to study T cell development and function. However, such TCRs are usually isolated from the relevant T cells after long-term culture often following repeated antigen stimulation, which unavoidably selects for T cells with high affinity. Random genomic integration of the TCR &alpha;- and &beta;-chain and expression from non-endogenous promoters can lead to variations in expression level and kinetics.
Epigenetic reprogramming via somatic cell nuclear transfer provides a tool to generate embryonic stem cells and mice from any cell of interest. Consequently, when SCNT is applied to T cells of known specificity, these genetic V(D)J rearrangements are transferred to the SCNT-embryonic stem cells (ESCs) and the mice derived from them, while epigenetic marks are reset. We have demonstrated that T cells with pre-defined specificities against Toxoplasma gondii can be used to generate mouse models that express the specific TCR from their endogenous loci, without experimentally introduced genetic modification. The relative ease and speed with which such transnuclear models can be obtained holds promise for the construction of other disease models.

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

We demonstrate here that epigenetic reprogramming via Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) can be used as a tool to generate mouse models with pre-defined T cell receptor (TCR) specificities. These transnuclear mice express the corresponding TCR from their endogenous locus under the control of the endogenous promoter.

Karşı Önceden tanımlanmış T Hücre Reseptör özgüllükleri Transnuclear Fare Toxoplasma gondii SCNT ile Elde Edilen

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

Isolate A Genetik Ekran Toxoplasma gondii Host-hücre çıkış Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its intractability to experimental transformation with recombinant DNA. We developed an approach to perform genetic analysis in C. trachomatis&#160;despite the lack of molecular genetic tools. Our method involves: i.) chemical mutagenesis to rapidly generate comprehensive libraries of genetically-defined mutants with distinct phenotypes; ii.) whole-genome sequencing (WGS) to map the underlying genetic lesions and to find associations between mutated gene(s) and a common phenotype; iii.) generation of recombinant strains through co-infection of mammalian cells with mutant and wild type bacteria. Accordingly, we were able to establish causal relationships between genotypes and phenotypes. The coupling of chemically-induced gene variation and WGS to establish correlative genotype&#8211;phenotype associations should be broadly applicable to the large list of medically and environmentally important microorganisms currently intractable to genetic analysis.

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

We describe a methodology to perform genetic analysis in Chlamydia based on chemical mutagenesis and whole genome sequencing. In addition, a system for DNA exchange within infected cells is described that can be used for genetic mapping. This method may be broadly applicable to microbial systems lacking transformation systems and molecular genetic tools.

Ileri Genetik Yaklaşımlar<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. Despite advances in knowledge of this illness, the availability of intensive care units (ICU), and the use of potent antimicrobial agents and effective vaccines, the mortality rates remain high1. Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen of community-acquired pneumonia (CAP) and one of the most common causes of bacteremia in humans. This pathogen is equipped with an armamentarium of surface-exposed adhesins and virulence factors contributing to pneumonia and invasive pneumococcal disease (IPD). The assessment of the in vivo role of bacterial fitness or virulence factors is of utmost importance to unravel S. pneumoniae pathogenicity mechanisms. Murine models of pneumonia, bacteremia, and meningitis are being used to determine the impact of pneumococcal factors at different stages of the infection. Here we describe a protocol to monitor in real-time pneumococcal dissemination in mice after intranasal or intraperitoneal infections with bioluminescent bacteria. The results show the multiplication and dissemination of pneumococci in the lower respiratory tract and blood, which can be visualized and evaluated using an imaging system and the accompanying analysis software.

Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen causing severe community-acquired pneumonia and responsible for over 2&#160;million deaths worldwide. The impact of bacterial factors implicated in fitness or virulence can be monitored in real-time in an acute mouse pneumonia or bacteremia model using bioluminescent bacteria.

Biyoluminesen Bakteriler Kullanılarak Gerçek Zamanda Bir Akut Fare Pnömoni Modelinde Pnömokok virulans faktörlerinin etkisi aşağıdaki

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Miyeloid hücrelerin Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme<em&gt; Süm<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Bağırsak Tümörleri Disk Eşodaklı Mikroskopi Spinning tarafından

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

Periyodik Asit Schiff Boyama ile periferik kan mononükleer hücreleri glikojen algılama

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&amp;#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

İleri Genetik tanımak makrofajlar kullanılarak Ekranlar<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Genler önemli direnç için IFN-γ-bağımlı hücre otonom bağışıklık

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

Dinamik yapışma tahlil için anti-yapışma tedaviler iltihabi bağırsak hastalığı fonksiyonel analiz

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...