Kanada Yenilik Vakfı (S2D) projesi &#39;Hastalık Synapse&#39; fon için fon kaynakları Genom Kanada ve genom Québec ve Université de Montréal yanı sıra fon sayesinde.

1. Novo mutasyonlar neden olabilir hastalığın Seçimi Aşağıdaki kriterlere uyan bir hastalık de novo mutasyon hipotezi ile uyum: <ol><li> Üreme spor azalır. </li><li> Ortamlarda yaygın olarak değişen rağmen hastalığın sıklığı nispeten yüksek ve sabittir. </li><li> Hastalık yüksek bir baba yaşı ile ilişkilidir. </li><li> Klasik bağlantı ve ilişki çalışmaları, hastalığın kalıtım önemli bir kısmını açıklamak için başarısız oldu. </li><li> Ikiz uyumu verileri de novo modeli desteklemektedir. </li></ol> Novo mutasyonlar kısmen genetik olarak açıklayabilir yaygın bir hastalıktır kritik bir ilk adım olduğunu olasılığını Analizi. 2. Olgu ve DNA örnekleri Seçimi Uygun örneklerin seçimi de novo mutasyonlar kimlik başarısı için kritik öneme sahiptir. De novo mutasyon bulma şansı en üst düzeye çıkarmak için, aşağıdakileri öneririz: <ol><li> Etkilenmemiş anne-babalar, büyük babaları ve hastalığın hiçbir genişletilmiş aile öyküsü olan olgularda, erken yaşlarda başlangıçlı, şiddetli fenotipi seçin. </li><li> Kullanılabilir DNA&#39;lar çalışma yapmak için yeterli hastalarda seçin. Özellikle kritik kültür için tabi olmayan bir birincil hücre kaynağı (örneğin kan DNA veya tükürük DNA) DNA&#39;nın kullanılabilirliği, </li><li> (Vs de novo miras) mutasyon iletim durumunu belirlemek için her iki ebeveynin de DNA durumu kritik. Aday genler tespit kez ek etkilenen kohortlarında ve normal kontroller Durumu genetik doğrulama çalışmaları için gerekli. </li><li> Mutasyonların oranı ekranlı olması için gen miktarı ve de novo mutasyon sonucu durumlarda fraksiyonu tahmin dayalı örneklem büyüklüğü tahmin ediyoruz. </li></ol> 3. Gene resequencing, iki ana yaklaşım <ol><li> Yüksek kalite, düşük verim sıralama Bu yaklaşım, aday genler yaklaşımları üzerine dayanır. <ol><li> Seçim aday gen (ler) 6 ana kriter üzerine kurulmuş bir puanlama sistemine dayalı en iyi aday genler seçin. Sonra Tablo 1&#39;de yer alan altı kriter kullanarak atfedilen tüm puan toplamına karşılık toplam hesaplar. Seçilmiş ve seçilen genlerin dağılımı Şekil 1 projemiz örneğe bakın. <img src="/files/ftp_upload/2534/2534table1.jpg" alt="Tablo 1"/> Aday gen seçimi için kullanılan Tablo 1. Kriterleri <img src="/files/ftp_upload/2534/2534fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1: Grafik projemiz sıralaması için seçilmiş ve seçilen genlerin dağılımını gösteren . Biz onların puan değerine göre sıralama genler tarafından aday özellikleri göre sıralanmış genlerin bir dağıtım elde etti. Örneğin, SHANK3 ve NRXN1 genler, iki gen de novo mutasyon bulundu, (maksimum 12) sırasıyla 7 ve 6 bir skor vardı. </li><li> Exonprimer üzerinden Primers3 yazılım kullanarak Tasarım primerler. Sadece bölge kodlama ve ek kavşak ekson her tarafında fazladan bir 50 baz çifti de dahil olmak üzere kapalı olmalıdır. </li><li> Taq seçimi için optimize PCR koşulları, reaksiyon hacmi, vb. </li><li> Tüm PCR parçaları en iyi duruma getirme </li><li> 5 ng genomik DNA standart prosedürlere göre kan örnekleri çıkarılan yükseltin </li><li> PCR ürünleri% 2&#39;lik agaroz jel yükleme sıralaması için göndermeden önce, kalite kontrol. Rastgele seçilen numuneler. </li><li> Tek iplikli DNA Analyzer Sıra PCR ürünleri. Izleri üzerinden% 90 analiz mümkün olup olmadığını bir parçası başarılı bir şekilde sıralı olarak kabul edilir. Bu büyük ölçekli bir tarama için geçerlidir. </li><li> Varyantlar Algılama <ol><li> PolyPhred, Polyscan ve Mutasyon Surveyor olarak genomik farklılıklar algılama ve genotipleme için araçlarını kullanın. En fazla 2 algılama araçları bir arada idealdir. Örneğin, v.5 PolyPhred ve varsayılan ayarları ile aynı varyasyonlara algılamaz v.6 PolyPhred. V.3 Polyscan SNP (% 96) ve daha az INDELs (% 93) yüksek yalancı pozitif mutasyon oranı vardır. PolyPhred v.6 gerçek INDELs çoğunluğu algılandı ancak daha düşük (% 90) Polyscan v.3 genel bir yanlış pozitif mutasyon oranı (INDELs için) yoktu. Biz algılama SNP v.3 Polyscan seçeneği kaldırmak ve v.5 PolyPhred hem tutmak ve değişken tespiti için v.6 PolyPhred. Mutasyon Surveyor ve Polyscan indels saptamak için daha iyi. Not: Polyscan kullanarak SNP algılama seçeneği uygulanmamalıdır. Sadece &quot;indel&quot; seçeneği olmalıdır. Polyscan SNP tespiti için birçok yalancı pozitif sonuç elde etti. </li><li> Her benzersiz bir roman exonic türevlerini tespit için, parça ve resequ reamplifying elle onaylamak, herhangi bir teknik yapıyı ortadan kaldırmak için ileri ve ters primerler kullanarak Proband ve her iki ebeveyn encing. </li></ol></li></ol></li><li> Tüm exome sıralama Bu yaklaşım insan genomları bölgeleri kodlama çoğunluğu yüksek işlem hacmi hedefleyen bir sıralama. Şimdi şu anda potansiyel aday genlerin tespiti hızlandırarak, laboratuarımızda bu yeni yaklaşım kullanıyorsanız. <ol><li> Roche gibi başkaları tarafından Agilent veya diğer herhangi bir benzer ürün tarafından tasarlanan 16.000 &#39;den fazla gen kodlama bölgesi (50 MB genom) hedef alan &quot;SureSelect İnsan Tüm Exon&quot; sipariş edin. Yakalama seti sipariş etmek için önce, sıralama platformlar (Illumina vs katı) belirlemek olmalıdır. </li><li> Agilent protokolüne göre yakalama yapın </li><li> Sıra ilgili kullanılabilir yeni nesil bir platform ürün </li><li> Tüm exome sıralama Variant algılama: BWA, bfast, hizalama gerçekleştirecek Bioscope nesil sıralama platformu genomik farklılıklar tespit edilmesi ve genotipleme için çeşitli biyoinformatik araçlar mevcuttur. Sonra ek olarak serbestçe kullanılabilir downstream araçları (örneğin SAM araçları, Varscan, Annovar) varyantları arama ve açıklama için gerekli olacaktır. Dizi hizalama ve varyant arama ve işaretleme içermektedir Ticari yazılım NextGen (Softgenetics), CLC Bio ve diğerleri olarak da mevcuttur </li></ol></li></ol> 4. Genomik varyantları önceliklendirme Belirlenen türevleri de novo protein ya da mRNA fonksiyonu ve / veya yapı için zararlı olmaktan olasılık göre takip öncelik verilir. Varyant aşağıdaki gibi olmalıdır de novo varyant tespiti için öncelikler takip: <ol><li> Benzersiz varyasyonlarını (tek bir durumda bir zamanlar gözlemlediği) </li><li> Çeşitlemeler, veliler mevcut değil </li><li> Protein kesiliyor varyasyonları: saçmalık, Frameshift ve ekleme mutasyonlar önde gelen indels. </li><li> Missense ve sessiz değişimi (örneğin, mRNA örgüsünü etkiler) işlevsel yıkıcı öngördü. Proteinin fonksiyonel tahmin etkisi için Polyphen, SIFT ve PANTHER kullanın. </li></ol> Tüm exome sıralama kullanarak, aday genler seçimi, daha fazla çalışma için öncelik türevleri için bir strateji olarak kullanılabilir. 5. Genetik doğrulama <ol><li> Ek durumlarda hasta (diğer etken mutasyonları tespit etmek) ve kontrol grubunda tüm gen Resequence. Kontrol örnekleri öncelikli varyantları alel frekansları değerlendirmek için kullanılabilir. Farklı hastalarda (ancak kontrol örnekleri veya kamu veritabanları) bulunan en az iki farklı de novo zararlı mutasyonlar (saçmalık, yapıştırma, frameshifts ve zarar missense tahmin) içeren herhangi bir genin ileri doğrulama çalışmaları için yüksek öncelik verilmelidir. 1) hasta türetilen lenfoblastoid hücre hatları potansiyel bir ekleme kusur testi: Bu içerir. Deneyimlerimize göre, genlerin çoğu lenfoblastoid hücre hatları RT-PCR ürünlerinin verim, 2) daha fazla test fonksiyonel düzeyde gen mutasyonu /) lenfoblastoid hücre hatları ve 3 protein özleri kantitatif Western Blot analizi ile değişmiş protein ekspresyon düzeyleri araştırılması hayvan (c elegans, Zebra balığı) ve daha önce bizim grup (örn: 5,6) tarafından yapılan gibi hücre hattı modelleri. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: Bu protokol, şizofreni ve otizm için yeni genleri tanımlamak mümkün. Bir örnek, son zamanlarda SHANK3 gen bulunması (Şekil 2). SHANK3 genin iki farklı de-novo mutasyonlar, tek etkilenen kadın üç etkilenen erkek kardeşi ve bir missense mutasyon bulunan bir saçmalık mutasyon. <img src="/files/ftp_upload/2534/2534fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2. (A) etkilenen üç kardeş aile PED 419 R1117X anlamsız mutasyon ayrılığı. Proband ok ile gösterilir. PED 56 (B) Proband R536W missense mutasyon ayrımı değil, onu etkilenmeyen kardeşi.

<ol>
	<li>Bassett, A. S., Bury, A., Hodgkinson, K. A., Honer, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+fitness+in+familial+schizophrenia.">Reproductive fitness in familial schizophrenia.</a> Schizophr Res. 21, 151-160 (1996).</li><li>Jablensky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizophrenia:+manifestations,+incidence+and+course+in+different+cultures.+A+World+Health+Organization+ten-country+study.">Schizophrenia: manifestations, incidence and course in different cultures. A World Health Organization ten-country study.</a> Psychol Med Monogr. , 1-97 (1992).</li><li>Malaspina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizophrenia+risk+and+paternal+age:+a+potential+role+for+de+novo+mutations+in+schizophrenia+vulnerability+genes.">Schizophrenia risk and paternal age: a potential role for de novo mutations in schizophrenia vulnerability genes.</a> CNS Spectr. 7, 26-29 (2002).</li><li>DeLisi, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+scan+for+linkage+to+chromosomal+regions+in+382+sibling+pairs+with+schizophrenia+or+schizoaffective+disorder.">A genome-wide scan for linkage to chromosomal regions in 382 sibling pairs with schizophrenia or schizoaffective disorder.</a> Am J Psychiatry. 159, 803-812 (2002).</li><li>Gauthier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Novo+SHANK3+Mutations+in+Patients+Ascertained+for+Schizophrenia.">De Novo SHANK3 Mutations in Patients Ascertained for Schizophrenia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2010).</li><li>Piton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+calcium-related+gene+IL1RAPL1+are+associated+with+autism.">Mutations in the calcium-related gene IL1RAPL1 are associated with autism.</a> Hum Mol Genet. 17, 3965-3974 (2008).</li><li>Krawczak, M., Ball, E. V., Cooper, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neighboring-nucleotide+effects+on+the+rates+of+germ-line+single-base-pair+substitution+in+human+genes.">Neighboring-nucleotide effects on the rates of germ-line single-base-pair substitution in human genes.</a> Am J Hum Genet. 63, 474-488 (1998).</li></ol>

Burada özetlenen prosedür muhtemel sonucu, kısmen de novo mutasyonlar ve bu hipotezi kanıtlamak için belirli ortak hastalıkları tanımlamak için hedefliyor. De novo mutasyonlar, örneğin kalıtsal kanser sendromları hastalıklar, bir dizi geliştirme için iyi kurulmuş bir mekanizmadır, fakat kötü yaygın hastalıklar araştırılmalıdır olmuştur. Bu, büyük miktarda DNA, sadece sahip diziliminin gerektirir de novo mutasyonlar, tanımlanması teknik zorluklardan kısmen sonuçları çok kısa bir süre önce Yeni Nesil Sıralama gelişine uygun maliyetli hale. Buna ek olarak, insanlarda de novo mutasyon oranı, çok yakın zamanlara kadar, sadece bir tahmin. Çok kısa bir süre orada raporları doğrudan insanlarda mutasyon oranı tespit edilmiştir. Bu ölçümler öncesinde, bu tür bir çalışma için gerekli örnek boyutunu tahmin etmek ve gözlenen de novo mutasyon oranı temel oranından daha büyük olup olmadığını belirlemek için zor oldu . Tüm genom karşı aday genler Sıralama? Rapor edilen hastalık mutasyonların çoğunluğu missense / saçmalık mutasyonlar ve bizim tarama stratejisi bilinen mutasyonların% 68 üzerinde tespit splice site mutasyonları (HGMD web sitesine göre). Amino asit değişimi şiddeti ve klinik fenotip olasılığı arasında açık bir ilişki de yoktur. Gibi muhafazakar bir amino asit ikamesi ile karşılaştırıldığında, saçma bir değişikliği 9.0 kez klinik 7 sunmak için muhtemeldir. Bu nedenle, şu anda sıralama aday genler en maliyet etkin bir stratejidir. Özetlenen prosedür başarı ayrıntılı olarak özetlenen ve iki örnek, otizm ve şizofreni ile gösterilmiştir bazı kritik adımları bağlıdır. Seçmek için hangi hastalık gibi kaçınılması gereken birçok tuzaklar, hangi hastaların ekran, DNA kaynağı ve de novo mutasyon verimli bir şekilde tanımlamak için nasıl ayrıntıları. Biz en verimli şekilde, herhangi bir hastalık gibi spontan mutasyonlar sonucu vakalarının kısmını belirlenmesi için bir yöntem sağlar.

a strategy to identify de novo mutations in common disorders such as autism and schizophrenia

De novo mutasyonlar otizm ve şizofreni gibi sık görülen bozukluklar için bir mekanizma olarak rol destekleyen kanıtlar birkaç satır vardır. İlk olarak, insanlarda de novo mutasyon oranı nispeten yüksek olduğu, nüfusun yüksek bir frekansta yeni mutasyonlar üretilir. Ancak, en yaygın hastalıklar içinde de novo mutasyon bildirilmiştir. Embriyonik aşamalarında ya da düşük üreme spor öldürücülüğü olarak fenotip karşı güçlü bir negatif seçim var ciddi hastalıklara yol açan genlerin mutasyonlar, birden çok aile üyelerine iletilen olmayabilir, ve bu nedenle bağlantı gen haritası ya da dernek tarafından tespit olmayacaktır çalışmaları. Tek yumurta ikizleri çok yüksek konkordans gözlem ve çift yumurta ikizleri çok düşük uyumu da güçlü vakaların önemli bir kısmı yeni mutasyonlar sonucu olduğu hipotezini destekler. İşte bu tür otizm ve şizofreni gibi hastalıklar için böyledir. İkincisi, azaltılmış üreme spor 1 ve son derece değişken çevresel faktörlere rağmen, bazı hastalıkların görülme sıklığı nispeten yüksek ve sabit bir hızda dünya çapında korunur. Bu, dünya çapında yaklaşık% 1 oranında bir insidans, otizm ve şizofreni için böyledir. Mutasyon yük için seçim arasında bir denge ya da de novo mutasyon zararlı bir mutasyon ve üretim karşı düşünülebilir. Alt üreme oranları, nüfusun sonuçta hastalığı prevalansının azalmasına yol açan mutant allel sayısını azaltmak gerekir olumsuz bir seçim faktörü oluşturmaktadır. Bu seçici baskılar, farklı ortamlarda farklı yoğunluk olma eğilimindedir. Bununla birlikte, bu ciddi ruhsal bozukluklar, bunların 2 karşı güçlü bir negatif seçim rağmen, dünya nüfusunun kültürlerden ve ülkelerden geniş bir aralığında sabit bir nispeten yüksek yaygınlık muhafaza edilmiştir. Bu yüksek yeni bir mutasyon oranı olmadığı sürece bir üreme spor azalmış hastalıklar ne olacağını tahmin değildir. Son olarak, baba yaşı etkiler:, yaşa bağlı artış baba de novo mutasyonlar sonucu artan baba yaşı ile hastalık riski anlamlı olarak artmıştır . Bu, otizm ve şizofreni 3 için böyledir . Mutasyon oranı erkek-kadın oranı muhtemelen germ hücre bölünmesi yaşla birlikte erkeklerde daha yüksek bir sayı nedeniyle, yaklaşık 4-6:1 tahmin edilmektedir. Bu nedenle, bir de novo mutasyonlar daha sık erkeklerde, özellikle yaşlı erkeklerde 4 geleceğini tahmin olacaktır. Genetik çalışmalar, şimdiye kadar birçok kompleksleri hastalıkları, otizm ve şizofreni gibi genler, yatkınlık genleri tanımlamak için başarısız oldu, neden ve hastalıkları insan genomunun sadece% 3 gen tespit edilmiştir neden yüksek oranda yeni mutasyonlar kısmen açıklayabilir . Bir hastalığın bir nedeni olarak de novo mutasyonlar için Kimlik okuyan veliler ve etkilenen konuları içeren hedeflenen moleküler yaklaşım gerektirir. Bir hastalığın genetik temeli de novo mutasyonlar ve moleküler yaklaşım, örnek olarak otizm ve şizofreni kullanarak, bu bağlantıyı gösterilecektir kurmak için neden olmadığını belirlemek için süreç .

Watch this Scientific Journal Video about A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia at JoVE.com

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

Otizm ve şizofreni gibi ortak bir bozukluğa yol novo mutasyonlar bulmak için moleküler genetik strateji.

Ortak Bozuklukları de Novo Mutasyonlar, otizm ve şizofreni gibi tanımlayın Bir Strateji

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

a-strategy-to-identify-de-novo-mutations-common-disorders-such-as

Research

JoVE Journal

Medicine

25.6K Görüntüleme.  Universite de Montreal. Otizm ve şizofreni gibi ortak bir bozukluğa yol novo mutasyonlar bulmak için moleküler genetik strateji.

Video: A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We have established bilateral common carotid artery occlusion as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance to transient focal cerebral ischemia in C57Bl6/J mice. In this video, we will demonstrate the methodology used for this study.

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning (PC) &#x2013; a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We established bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO) as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance (IT) to transient focal cerebral ischemia (induced by middle cerebral artery occlusion, MCAO) in C57Bl6/J mice.

Odak Serebral İskemi Erken İskemik Tolerans tetikleyebilecek bir Yeterli Önkoşullama Uyarıcı olarak bilateral Ortak Karotis Arter Tıkanıklığı

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a ...

Tıp

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for personalized medicine after stratification, explaining the current interest in developing a reproducible and low-cost xenotransplant model for this disease. The chick chorioallantoic membrane is a natural immunodeficient host capable of sustaining grafted tissues and cells without species-specific restrictions. In addition, it is easily accessed, manipulated and imaged using optical and fluorescence stereomicroscopy. Histology further allows detailed analysis of heterotypic cellular interactions.
This protocol describes in detail the in ovo grafting of the chorioallantoic membrane with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines (Saos-2 and SW1353). The chick survival rates are up to 75%. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior. For localized grafting of single cell suspensions, ECM gel provides significant advantages over inert containment materials. The Ki67 proliferation index is related to the distance of the cells from the surface of the CAM and the duration of application on the CAM, the latter determining a time frame for the addition of therapeutic products.

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

The in ovo chorioallantoic membrane (CAM) is grafted with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior.

<em&gt; Ovo</emSarkoma için bir Xenograftmodel olarak&gt; CAM-testi

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for ...

Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties of the smooth muscle as well as changes induced by pathology. This method provides critical information for understanding bladder function while overcoming major methodological difficulties encountered in in vivo experiments, such as surgical and pharmacological manipulations that affect stability and survival of the preparations, the use of human tissue, and/or the use of expensive chemicals. It also provides a way to investigate the properties of each bladder component (i.e. smooth muscle, mucosa, nerves) in healthy and pathological conditions.
The urinary bladder is removed from an anesthetized animal, placed in Krebs solution and cut into strips. Strips are placed into a chamber filled with warm Krebs solution. One end is attached to an isometric tension transducer to measure contraction force, the other end is attached to a fixed rod. Tissue is stimulated by directly adding compounds to the bath or by electric field stimulation electrodes that activate nerves, similar to triggering bladder contractions in vivo. We demonstrate the use of this method to evaluate spontaneous smooth muscle contractility during development and after an experimental spinal cord injury, the nature of neurotransmission (transmitters and receptors involved), factors involved in modulation of smooth muscle activity, the role of individual bladder components, and species and organ differences in response to pharmacological agents. Additionally, it could be used for investigating intracellular pathways involved in contraction and/or relaxation of the smooth muscle, drug structure-activity relationships and evaluation of transmitter release.
The in vitro smooth muscle contractility method has been used extensively for over 50 years, and has provided data that significantly contributed to our understanding of bladder function as well as to pharmaceutical development of compounds currently used clinically for bladder management.

This manuscript presents a simple, yet powerful, in vitro method for evaluating smooth muscle contractility in response to pharmacological agents or nerve stimulation. Main applications are drug screening and understanding tissue physiology, pharmacology,&#160;and pathology.

Alt Üriner Sistem Farmakoloji değerlendirin bir Yöntem olarak mesane düz kas Şerit Kasılabilme

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties ...

Fundus Photography as a Convenient Tool to Study Microvascular Responses to Cardiovascular Disease Risk Factors in Epidemiological Studies

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an important role in maintaining cardiovascular health. The retina is a tissue that lines the interior of the eye and it is the only tissue that allows for a non-invasive analysis of the microvasculature. Nowadays, high-quality fundus images can be acquired using digital cameras. Retinal images can be collected in 5 min or less, even without dilatation of the pupils. This unobtrusive and fast procedure for visualizing the microcirculation is attractive to apply in epidemiological studies and to monitor cardiovascular health from early age up to old age.
Systemic diseases that affect the circulation can result in progressive morphological changes in the retinal vasculature. For example, changes in the vessel calibers of retinal arteries and veins have been associated with hypertension, atherosclerosis, and increased risk of stroke and myocardial infarction. The vessel widths are derived using image analysis software and the width of the six largest arteries and veins are summarized in the Central Retinal Arteriolar Equivalent (CRAE) and the Central Retinal Venular Equivalent (CRVE). The latter features have been shown useful to study the impact of modifiable lifestyle and environmental cardiovascular disease risk factors.
The procedures to acquire fundus images and the analysis steps to obtain CRAE and CRVE are described. Coefficients of variation of repeated measures of CRAE and CRVE are less than 2% and within-rater reliability is very high. Using a panel study, the rapid response of the retinal vessel calibers to short-term changes in particulate air pollution, a known risk factor for cardiovascular mortality and morbidity, is reported. In conclusion, retinal imaging is proposed as a convenient and instrumental tool for epidemiological studies to study microvascular responses to cardiovascular disease risk factors.

Retinal image analysis is an unobtrusive procedure for visualizing the microcirculation. The impact of cardiovascular disease risk factors can result in changes of retinal vessel calibers. The procedures to acquire fundus images and the steps for calculating the vessel calibers are described.

Bir Uygun Aracı Olarak Fundus Fotoğraf Epidemiyolojik Çalışmaların Kardiyovasküler Hastalıklar Risk Faktörleri için Mikrovasküler Cevapları Eğitim için

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an ...

Sublingual Immunotherapy as an Alternative to Induce Protection Against Acute Respiratory Infections

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been shown to effectively induce humoral and cellular responses at systemic and mucosal sites, namely the lungs and urogenital tract. Sublingual vaccination can promote protection against infections at the lower and upper respiratory tract; it can also promote tolerance to allergens and ameliorate asthma symptoms. Modulation of lung&#8217;s immune response by sublingual immunotherapy (SLIT) is safer than direct administration of formulations by intranasal route because it does not require delivery of potentially harmful molecules directly into the airways. In contrast to intranasal delivery, side effects involving brain toxicity or facial paralysis are not promoted by SLIT. The immune mechanisms underlying SLIT remain elusive and its use for the treatment of acute lung infections has not yet been explored. Thus, development of appropriate animal models of SLIT is needed to further explore its potential advantages. 
This work shows how to perform sublingual administration of therapeutic agents in mice to evaluate their ability to protect against acute pneumococcal pneumonia. Technical aspects of mouse handling during sublingual inoculation, precise identification of sublingual mucosa, draining lymph nodes and isolation of tissues, bronchoalveolar lavage and lungs are illustrated. Protocols for single cell suspension preparation for FACS analysis are described in detail. Other downstream applications for the analysis of the immune response are discussed. Technical aspects of the preparation of Streptococcus pneumoniae inoculum and intranasal challenge of mice are also explained.
SLIT is a simple technique that allows screening of candidate molecules to modulate lungs&#8217; immune response. Parameters affecting the success of SLIT are related to molecular size, susceptibility to degradation and stability of highly concentrated formulations.

The present work illustrates the convenience of using sublingual immunotherapy to boost the innate immune response in the lungs and confer protection against acute pneumococcal pneumonia in mouse.

Alternatifi olarak dilaltı immünoterapi Akut Solunum Enfeksiyonları Karşı Koruma tetikleyebilecek

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes (ILM), and in conjunction with astrocytes, pericytes and endothelial cells they establish the blood-retinal barrier (BRB). BRB limits material transport between the bloodstream and the retina while the ILM acts as a basement membrane that defines histologically the border between the retina and the vitreous cavity. Labeling M&#252;ller cells is particularly relevant to study the physical state of the retinal barriers, as these cells are an integral part of the BRB and ILM. Both BRB and ILM are frequently altered in retinal disease and are responsible for disease symptoms.
There are several well-established methods to study the integrity of the BRB, such as the Evans blue assay or fluorescein angiography. However these methods do not provide information on the extent of BRB permeability to larger molecules, in nanometer range. Furthermore, they do not provide information on the state of other retinal barriers such as the ILM. To study BRB permeability alongside retinal ILM, we used an AAV based method that provides information on permeability of BRB to larger molecules while indicating the state of the ILM and extracellular matrix proteins in disease states. Two AAV variants are useful for such study: AAV5 and ShH10. AAV5&#160;has a natural tropism for photoreceptors but it cannot get across to the outer retina when administered into the vitreous when the ILM is intact (i.e., in wild-type retinas). ShH10 has a strong tropism towards glial cells and will selectively label M&#252;ller glia in both healthy and diseased retinas. ShH10 provides more efficient gene delivery in retinas where ILM is compromised. These viral tools coupled with immunohistochemistry and blood-DNA analysis shed light onto the state of retinal barriers in disease.

To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

Aracı Olarak Adeno-ilişkili virüs kullanarak Hastalığında Retina Engelleri Eğitim için

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide new expandable sources of beta cells to alleviate the donor scarcity in human islet transplantation as therapy for diabetes. Although recent advances have been made towards this aim, mechanisms that regulate beta cell expansion and differentiation from a stem/progenitor cell remain to be characterized. Here, we describe a protocol for an injury model in the adult mouse pancreas that can function as a tool to study mechanisms of tissue remodeling and beta cell proliferation and differentiation. Partial duct ligation (PDL) is an experimentally induced injury of the rodent pancreas involving surgical ligation of the main pancreatic duct resulting in an obstruction of drainage of exocrine products out of the tail region of the pancreas. The inflicted damage induces acinar atrophy, immune cell infiltration and severe tissue remodeling. We have previously reported the activation of Neurogenin (Ngn) 3 expressing endogenous progenitor-like cells and an increase in beta cell proliferation after PDL. Therefore, PDL provides a basis to study signals involved in beta cell dynamics and the properties of an endocrine progenitor in adult pancreas. Since, it still remains largely unclear, which factors and pathways contribute to beta cell neogenesis and proliferation in PDL, a standardized protocol for PDL will allow for comparison across laboratories.

This protocol describes an injury model involving the surgical ligation of the pancreatic duct in the adult mouse pancreas, resulting in severe injury that establishes an environment that allows beta cell neogenesis and proliferation. This model can be used as a tool to study mechanisms involved in beta cell formation.

Endokrin ve Ekzokrin yeniden programlanması ve Silahların Yayılmasını Önleme Modeli Olarak Pankreas kanalının bağlanmasını yoluyla Fare Pankreas Cerrahi Sakatlık

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide ...

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves focal endothelial-selective transgenesis, thereby allowing an investigator to determine the biological roles of endothelial-expressed transgenes and to quantify the in vivo transcriptional activity of DNA sequences in large artery endothelial cells. The method uses surgical isolation of rabbit common carotid arteries and an arteriotomy to deliver a transgene-expressing viral vector into the arterial lumen. A short incubation period of the vector in the lumen, with subsequent aspiration of the lumen contents, is sufficient to achieve efficient and durable expression of the transgene in the endothelium, with no detectable transduction or expression outside of the isolated arterial segment. The method allows assessment of the biological activities of transgene products both in normal arteries and in models of human vascular disease, while avoiding systemic effects that could be caused either by targeting gene delivery to other sites (e.g. the liver) or by the alternative approach of delivering genetic constructs to the endothelium by germ line transgenesis. Application of the method is limited by the need for a skilled surgeon and anesthetist, a well-equipped operating room, the costs of purchasing and housing rabbits, and the need for expertise in gene-transfer vector construction and use. Results obtained with this method include: transgene-related alterations in arterial structure, cellularity, extracellular matrix, or vasomotor function; increases or reductions in arterial inflammation; alterations in vascular cell apoptosis; and progression, retardation, or regression of diseases such as intimal hyperplasia or atherosclerosis. The method also allows measurement of the ability of native and synthetic DNA regulatory sequences to alter transgene expression in endothelial cells, providing results that include: levels of transgene mRNA, levels of transgene protein, and levels of transgene enzymatic activity.

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

This method is to introduce a transgene into the endothelium of rabbit carotid arteries. Introduction of the transgene allows the assessment of the biological role of the transgene product either in normal arteries or disease models. The method is also useful for measuring activity of DNA regulatory sequences.

Vivo Gen transferi için tavşan ortak Karotid arter endotel

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves ...

An Experimental Model of Diet-Induced Metabolic Syndrome in Rabbit: Methodological Considerations, Development, and Assessment

In recent years, obesity and metabolic syndrome (MetS) have become a growing problem for public health and clinical practice, given their increased prevalence due to the rise of sedentary lifestyles and unhealthy eating habits. Thanks to animal models, basic research can investigate the mechanisms underlying pathological processes such as MetS. Here, we describe the methods used to develop an experimental rabbit model of diet-induced MetS and its assessment. After a period of acclimation, animals are fed a high-fat (10% hydrogenated coconut oil and 5% lard), high-sucrose (15% sucrose dissolved in water) diet for 28 weeks. During this period, several experimental procedures were performed to evaluate the different components of MetS: morphological and blood pressure measurements, glucose tolerance determination, and the analysis of several plasma markers. At the end of the experimental period, animals developed central obesity, mild hypertension, pre-diabetes, and dyslipidemia with low HDL, high LDL, and an increase of triglyceride (TG) levels, thus reproducing the main components of human MetS. This chronic model allows new perspectives for understanding the underlying mechanisms in the progression of the disease, the detection of preclinical and clinical markers that allow the identification of patients at risk, or even the testing of new therapeutic approaches for the treatment of this complex pathology.

We describe methods to develop an experimental model of diet-induced metabolic syndrome (MetS) in rabbits using a high-fat, high-sucrose diet. Animals developed central obesity, mild hypertension, pre-diabetes, and dyslipidemia, thus reproducing the main components of human MetS. This chronic model will allow acquisition of knowledge underlying mechanisms of disease progression.

Deneysel bir Model Diyet kaynaklı metabolik Sendromu in tavşan: metodolojik dikkat edilmesi gereken noktalar, geliştirme ve değerlendirme

In recent years, obesity and metabolic syndrome (MetS) have become a growing problem for public health and clinical practice, given their increased ...

A Rabbit Model of Durable Transgene Expression in Jugular Vein to Common Carotid Artery Interposition Grafts

Vein graft bypass surgery is a common treatment for occlusive arterial disease; however, long-term success is limited by graft failure due to thrombosis, intimal hyperplasia, and atherosclerosis. The goal of this article is to demonstrate a method for placing bilateral venous interposition grafts in a rabbit, then transducing the grafts with a gene transfer vector that achieves durable transgene expression. The method allows the investigation of the biological roles of genes and their protein products in normal vein graft homeostasis. It also allows the testing of transgenes for the activities that could prevent vein graft failure, e.g., whether the expression of a transgene prevents the neointimal growth, reduces the vascular inflammation, or reduces atherosclerosis in rabbits fed with a high-fat diet. During an initial survival surgery, the segments of right and left external jugular vein are excised and placed bilaterally as reversed end-to-side common carotid artery interposition grafts. During a second survival surgery, performed 28 days later, each of the grafts is isolated from the circulation with vascular clips and the lumens are filled (via an arteriotomy) with a solution containing a helper-dependent adenoviral (HDAd) vector. After a 20-min incubation, the vector solution is aspirated, the arteriotomy is repaired, and flow is restored. The veins are harvested at time points dictated by individual experimental protocols. The 28-day delay between the graft placement and the transduction is necessary to ensure the adaptation of the vein graft to the arterial circulation. This adaptation avoids rapid loss of transgene expression that occurs in vein grafts transduced before or immediately after grafting. The method is unique in its ability to achieve durable, stable transgene expression in grafted veins. Compared to other large animal vein graft models, rabbits have advantages of low cost and easy handling. Compared to rodent vein graft models, rabbits have larger and easier-to-manipulate blood vessels that provide abundant tissue for analysis.

This method describes the placement of interposition vein grafts in rabbits, the transduction of the grafts, and the achievement of durable transgene expression. This allows the investigation of physiological and pathological roles of transgenes and their protein products in grafted veins, and testing of gene therapies for vein graft disease.

Tavşan manken dayanıklı Transgene ifade juguler ven ortak karotid arter interpozisyonu Greftler için

Vein graft bypass surgery is a common treatment for occlusive arterial disease; however, long-term success is limited by graft failure due to thrombosis, ...