Bu çalışma LB NIH R37 DK54824 ve R01 DK57284 hibe ile desteklenmiştir

Burada açıklanan tüm prosedürler Pittsburgh Üniversitesi IACUC komitesi tarafından onaylanmıştır. 1. Çözümler <ol><li> Reçeteye göre Krebs çözeltisi hazırlayın. NaCl 118, KCl 4.7, CaCl2 1.9, MgSO 4 1.2, NaHCO3 24.9, KH 2 PO 4 1.2, dekstroz 11.7: mM Kompozisyon. </li><li> % 95 O2,% 5 CO2 ile Krebs havalandırır ve deney boyunca kullanılmak üzere bir 37 ° C su banyosu içine koyun. Bir yana koyun, oda sıcaklığında gece havalandırılmış Krebs çözeltisi 200 ml doku diseksiyon için kullanılır. </li><li> Havalandırılmış Krebs pH (~ 7.4) ve ozmolariteyi (~ 300 mOsm) ölçün. </li></ol> 2. Deney Seti-up (şematik Şekil 1A) <ol><li> (% 95 O2,% 5 CO2) 10 ml Krebs ile gaz odaları doldurun. </li><li> 37 ° C&#39;ye kadar ısıtmak için odaları su sirkülasyon pompası başlanması; gerekli ekipman açın: amplifikatör (ler), uyarıcı (ler) ve kayıt yazılımı. </li><li> 1 g ağırlık çeviricilerine kalibre. </li></ol> 3. Doku (Şekil 1B) : Aşağıdaki adımları; (~ 10-12 haftalık 200-250 gr) bir yetişkin naif dişi Sprague Dawley sıçanın kesesi çıkarın <ol><li> Diseksiyon alanı ve gerekli araçları hazırlayın: elektrikli tıraş, diş forseps, neşter bıçak, kesme makasları, Microscissors, iki diseksiyon forseps, doku klipleri (veya ipek dikiş), Krebs ile Sylgard kaplı diseksiyon çanak (yazarlar Dumont forseps # 3 tercih) doku diseksiyonu pimleri. </li><li> Indüksiyon odasında izofluran inhalasyonu (O 2% 4) ile hayvan anestezisi. Anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözlerin veteriner merhem kullanın. Sürekli solunum hızını, dış uyaranlara yanıt, ve refleks çekilme arka uzuv kaybı gözlemleyerek anestezi düzeyini izlemek. </li><li> Hayvan tıraş alt karın bir anestezi zamanrea. Bir orta hat karın kesi yoluyla pelvik organların maruz. Mesane ve üretra tanımlayın. Proksimal üretraya yakın mesane boynu kesilerek kesesi çıkarın. Havalandırılmış Krebs çözeltisi ile doldurulmuş Sylgard kaplı çanak hemen doku yerleştirin. </li><li> Gerekirse, bu zamanda ek doku kaldırmak: üretra, gastrointestinal (Gl) sistemi ve / veya prostat parçaları, vs </li><li> IACUC onaylanmış yöntemler (örneğin, anestezik doz aşımı ya da bir ikincil yöntem izledi CO 2 boğulma) kullanarak hayvan kurban. </li><li> Daha fazla diseksiyon için doku stabilize, mesane kubbesi, boyun ve üreterler yoluyla doku kesme işaretçilerine yerleştirin. Doku germeyin. Yağ, bağ dokusu, proksimal üretra ve üreter varsa çıkarın. </li><li> Düz bir sayfası oluşturmak için kubbeye tabanından mesane açın, serozayı tarafı aşağı / lümen tarafı yukarı (Şekil 1B). Doku her köşesinde kesme işaretçilerine yerleştirin. Mesane dom KaldırE ve boyun doku. </li><li> Deneyin amacı mukozasında (ürotelyum ve lamina propria - diyagram Şekil 1C bakınız) katkısını belirlemek için ise düz kas kasılması için, ile ve ekli mukozasında olmadan detrüsör şeritler özelliklerini karşılaştırın. Bunun için, şeritler dokusunun kesilmesi öncesinde, dikkatli bir şekilde, iris bir tahlil mikroskobu altında makas ve ince forseps yay kullanarak mukoza tabakasının çıkarın. Deneyin sonunda, mukoza tamamen çıkarılmasını teyit etmek için H &amp; E boyaması için şeritler sabitleyin. Bu prosedür, fare mesane daha fare mesane daha kolay olduğuna dikkat edin. </li><li> ~ 2 x 8 mm (Şekil 1B) şeritler halinde kubbe tabandan boyuna doku kesilir. Kravat ya da her şeridin iki ucunda bir doku klip ekleyin. NOT: Bir fare mesane, genellikle 4 şeritler halinde kesilebilir, ancak dilimlerin sayısını artırabilir veya azaltmak hayvan / mesane boyutuna bağlı olarak değişir. </li><li> Exper şerit aktarmaimental odaları. Bir doku kasılmasını ölçen bir kuvvet transformatörüne, her bir şeridin ucunu, sabit bir cam / metal çubuğun diğer takın. Not: Doku odaları boyutu (20 mi ya da daha büyük 0.2 mi) değişir. Kemirgen mesanesi için tipik odaları şeritler tamamen solüsyona daldırılır edilmesi için yeterli bir yükseklik sağlamak 5-20 mi vardır. Bazı odaları yerleşik uyarım elektrotları, başkaları ile değil gelir. Bakım türlü elektriksel alan stimülasyonu güvenilir değildir, tüm elektrotların bağlantıları iyi durumda olmasını sağlamak için alınmalıdır. </li><li> Temel tansiyon, 1 g (~ 10 mi) içindeki ulaşıncaya kadar yavaşça doku germe her şerit kuvvet belirli bir miktarda uygulanır. Başlangıçta doku başlangıç ​​gerilmesinde bir azalma olarak kaydedildiği dinlenmek eğilimindedir. Yıkama doku yaklaşık ve sıcak gazlı Krebs kullanarak her 15 dk her yıkamadan sonra 1 g temel gerginliğini ayarlayın. (Temel tansiyon istikrarlı doku ~ için 1-2 saat kadar ya da gelmesini sağlayınyani başka doku gevşeme). </li><li> ~ 5 dakika için ya da bir plato yanıt kadar banyoya doğrudan KCI (80 mM) eklenerek test dokusu canlılığı ulaşılır. KCI yüksek konsantrasyonlarda yanıtlar da deney sırasında ya da deneyin sonunda tekrarlanır ve (veri analiz bölümü altında normalleştirme bakınız) şeritler diğer ilaçlara yanıtları arasında ya da normalize etmek için kullanılabilmektedir. </li><li> Sıcak gazlı Krebs ile yıkayın doku birden çok kez (3-5x) doku ön arıtma koşulları dönmek için izin vermek. </li></ol> 4. Stimülasyon Protokolleri <ol><li> SCI, Yİ, veya yenidoğanlarda gibi farklı hayvan modellerinde düz kas şeritleri kullanmak, spontan myojenik aktivite veya düz kas tonusu üzerinde patoloji etkilerini araştırmak. Şekil 2 gelişimi sırasında mesane spontan aktivite değişiklikleri araştırmak amacıyla bu yöntemin kullanımını göstermektedir ve SKY sonrası. Buna ek olarak, çeşitli ilaç sp modüle etmek için de kullanılabilirontaneous faaliyet. Şekil 3, spontan aktivite ve düz kas üzerindeki KCNQ kanal modülatörlerinin, flupirtinin ve XE991, etkisini göstermektedir. </li><li> Doğrudan belirlenen zaman aralıklarında banyosuna konsantre stok çözeltilerinden bileşiklerin ilave edilmesi ile, farmakolojik düz kas uyarımı konstrukt konsantrasyon yanıt eğrileri için. Araç ve zaman etkilerinin hesaba paralel şeritler halinde ilaç ve araç kullanın. <ol><li> 1000x son çalışma konsantrasyonu istenilen Test bileşiklerinin stok çözeltileri hazırlanır. 10 5 M, 3 x 10 5 M, 10 4 M, 3 x 10 4 M, 10 3 M, 3 x 10 3 M: karbakol (CCH), bir muskarinik reseptör agonisti, aşağıda stoklarını 10 -2 M. Banyosu içinde nihai konsantrasyonlar 10 -5 M (Şekil 4C, D) ile 10 M -8. 10 -8 M, 10 -7: neuromedin B (NMB&#39;de), bir bombesin reseptör alt 1 agonisti için aşağıdaki stokları hazırlamakM, 10 -6 M, 10 5 M, 10 4 M, 10 3 M ve banyo içinde nihai konsantrasyonlar olarak 10 -11 M&#39;ye 10 -6 M CCh ve NMB Hem doku kasılmasını artması beklenmektedir. </li><li> Bu cevap, bir plato (Şekil 4C, D) ulaşana kadar bir 10 ml doku banyosuna için, kısa sürede her CCh stok çözeltisinden 10 ul ekle. Paralel şeritler halinde, taşıyıcının (su) eşit bir şekilde artırmıştır. Benzer şekilde, her neuromedin B stok çözeltisi 10 ul her ~ 5 dakika ekleyin. NOT: Şekil 4 farklı türlerden şeritler halinde düz kas tonusu üzerinde NMB&#39;de ve CCH uyarıcı etkisini gözlemleyin. </li><li> Bir uyarıcı madde, genellikle CCH veya KCl ile ön-sözleşmeli dokuda düz kasların gevşemesi özelliklerini incelemek. </li><li> Bir agonist tepkisini bloke etmek için, stimülasyon Agonisti önce doku penetrasyonu izin vermek için antagonisti ile 10-20 dakika boyunca ön-işleme tabi doku. </li></ol></li><li> Sinir stimülasyonu içindüz kas simülasyonu olarak da adlandırılan elektrik alan uyarımı (EFS) 3.13 adım 1 ila takip ve aşağıda açıklandığı gibi devam edin. EFS, seçici olarak düz kas sinirlerinin karşı aktif hale getirmek için tasarlanmıştır. Uyarılması için parametrelerin dikkatle doğrudan düz kas uyarmayı önlemek üzere seçilmelidir. <ol><li> Stimülasyon parametreleri Kurmak: Aşağıdaki adımlarda açıklanan ve Şekil 5A, B de gösterildiği gibi uyarıcı (tek darbeler veya trenler), süresi (darbe süresi ve tren süresi), sıklığı ve şiddeti, tipi. <ol><li> Tek darbe uyarım, seti darbe süresi, inter-uyaran aralığı ve istenen uyaranların sayısı için. Her zamanki stimülasyon süre parametreleri istenilen aralıklarla (Şekil 5A) teslim 0.05-0.3 msn süresince tek sinyallerdir. Uyaran yoğunluğu için adımı 4.3.1.4 izleyin. </li><li> Tren uyarılması için, tren süresini ve inter tren aralığını ayarlayın. Mesane dokusu için tipik değerler 3-10 sn en az 1 m teslim edilirayrı olarak (Şekil 5B). Doku yorgunluk (yani EFS kasılmaları kontrol döneminde azalma) oluşursa, arası tren aralığını artırın. </li><li> Bir tren bakliyat tren uyaranlara sıklığını (dizi Kurmak - Şekil 5B). 0.5-50 Hz arasındaki bir frekans tepkisi eğrisi. Kesesi için tipik frekans ATP ve ACh ile aracılık tekrar üretilebilir ve kararlı kasılmalar elde 10-20 Hz bulunmaktadır. Bu yöntem, kolinerjik ve sinirsel purinerjik mekanizmaların katkısını araştırmak için nasıl kullanılabileceğini gösteren Şekil 5 fare mesane şeritler EFS uyarısına frekansa bağımlı tepkiler dikkate alınmalıdır. </li><li> Uyaranın şiddeti Kurmak: daralmanın genlik bir plato ulaşıncaya kadar (kullanarak trenler frekans sabit tutarsanız) sistematik uyaran yoğunluğunu (voltaj) artar. </li><li> Bağlı olarak uyaran yoğunluğunu ayarlayınDeney hedefliyoruz. Amaç, nöral-uyarılmış kasılma artırmak için ise, o zaman kasılma büyüklüğü ~ maksimum kontraksiyonun% 50 olacak şekilde, submaksimal yoğunluğu kullanılır. Amaç, nöral-uyarılmış kasılma azaltmak için ise, daha sonra ~ en yüksek amplitüdde% 80 doku yorgunluğu önlemek için yoğunluğunu ayarlamak için. </li></ol></li><li> Stimülasyon parametreleri (süresi, sıklığı ve yoğunluğu) oluşturulduktan sonra, EFS- için 20-30 dk uyuşturucu testi öncesinde stabilize kasılmaları uyarılmış ~ izin verir. NOT: (; 0.5-1 mcM TTX) sinir iletim, Na + kanal blokörü, tetrodotoksin&#39;in blok sinir iletimi için EFS seçiciliği doğrulamak için. TTX nispeten kolay yıkar gibi, deney başında bu adımı gerçekleştirin. Buna ek olarak, (aşama 4.3.5 bkz. Aşağıda), deneyin sonunda bu gerçekleştirin. </li><li> Son işleme konsantrasyonları için 1,000x de stok çözelti hazırlayın: alfa, beta-metilen ATP (ABMA, purinerjik alıcı aktivatörüve desensitize edici) -2 10 E, atropin (muskarinik alıcı antagonisti) 3 M 10 (Şekil 5C). Şekil 6&#39;da başka örnekler dikkate alınmalıdır. 5HT4 reseptör agonisti, sisaprid ile (3 x 10 -6 M, 10 -6 M, 3 x 10 5 M, 10 5 M, 3 x 10 4 M, 10 4 M, 3 x 10 -3 M, 10 -3 M), doku kasılma ve SB-203186 (3 x 10 -3 M), bir 5HT4 reseptör antagonisti artırır sisapridi etkilerini tersine çevirir. </li><li> EFS (Şekil 5C) üzerindeki etkilerini ABMA atropin ve test edilmesi için, iki kontrol frekans tepkisi eğrileri gerçekleştirin. 10 uM&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek üzere banyo 10 -2 M ABMA 10 ul. Bu durum düz kas purinerjik reseptörlerinin doğrudan uyarılması doku küçülecek. Başlangıca yanıt döndükten sonra, frekans tepkisi eğrileri tekrarlayın. Son bir concentrat için 10 -3 M atropin 10 ul ekle1 uM&#39;lik iyonu temsil etmektedir. (Muskarinik reseptörleri bloke atropin için gerekli) ~ 10 dakika, tekrar frekans tepkisi eğrileri sonra. Paralel şeritler halinde, her bir adımda, taşıyıcı olarak, su, 10 ul ekle. Not: Şekil 6 &#39;da, diğer örnekler için, tanımlı zaman aralıklarında (~ 15 dakikada; tartışmaya bakınız) her sisaprid stok çözeltisi 10 ul doğrudan banyoya SB-203186 stok solüsyonu, 10 ul ve ardından ve üzerindeki etkisini izlemek daralma EFS neden oldu. Paralel şeritler halinde, aracın, 10 ul DMSO ilave edin. Sisapridin etkilerini incelemek, Şekil 6 &#39;da insan mesane karaciğer, akciğer dokularında EFS uyarılmış kasılma bir 5HT4 reseptör agonisti,. İlave olarak, insan mesane ve ileum dokularda EFS uyarılmış kasılmaları üzerindeki etkisini DMSO, sisapridin için araç, gözlemlemek . </li><li> EFS protokol sonunda Na + kanal blokörü, tetrodotoksin&#39;in (TTx ile nöral iletimi bloke ederek EFS seçiciliğini doğrulamak; 0.5-1 &amp;181. M). TTX dirençli kasılmalar hala varsa, daha sonraki deneylerde uyaran süresini ve yoğunluğunu ayarlamak için tavsiye edilir. </li></ol></li><li> Öncesi veya post-sinaptik sitelerinde (Şekil 7A) ilaçların etkilerini belirlemek için 4.3.2 izleyin 1. Karbakole tekrarlanabilir yanıtları oluşturulması ve EFS, daha sonra uyuşturucu X eklemek </li><li> Deneyin sonunda, sökülüp takılmasını veya şeritler çöz ekstra sıvı ortadan kaldırmak ve bir denge kullanarak her bir şeridin ağırlığı ölçmek için ince kağıt parçası üzerine nazikçe bekletin. Ayrıca, enine kesit alanı belirlemek için bir kumpas kullanılarak doku uzunluğunu ölçer. Bu bilgiler veri normalizasyonu için kullanılır (bölüm 5.4). </li></ol> 5. Veri Analizi Yeterli yazılımını kullanarak verileri analiz (örneğin, Windaq, LabChart). <ol><li> Spontan aktivite için, önce ve ilaç kaynaklı yanıt ve beni zirvesine en az 30 saniye, bir pencere seçmekaşure genlik ve Miyojenik aktivite sıklığı (Şekil 3). <ol><li> Mesane farklı parçaları arasındaki farklar vardır yanıtları kasılma olup olmadığını katkıda frekansların spektrumunu belirlemek için hızlı Fourier dönüşüm analizi kullanın (örneğin, boyun vs kubbe) veya geliştirme, patoloji, ve uyuşturucu 8 ile. </li></ol></li><li> Düz kas üzerindeki etkiler için, önce ve ilaç uyarımlı tepkisinin zirvesine en az 10-30 saniyelik bir pencere seçmek ve büzülme genlik ölçmektedir. </li><li> Nöral ile uyarılan kasılmaları üzerindeki etkiler için, önce ve ilaca bağlı yanıtının tepe noktasında kasılmaları eğrisi (en az 3) altında genlik, süresi ve alanı ölçer. Not: Bu, purinerjik ve kolinerjik bileşenler farklı olan bir kinetiğe sahiptir, çünkü EFS uyarılan kasılmaların eğri altındaki alanı, hem de amplitüd ve ölçmek gereklidir. Purinerjik bileşen hızlı ve geçicidir (ATP purinergi aktivekalsiyum hızlı akışını izin veren bu P2X1 c iyonotropik kanallar, daha sonra bu şekilde, eğri altındaki alan en yüksek amplitüdü yanıt daha az katkıda) desensitize. Kolinerjik bileşeni (ACh sonuçta bir daralma ikna etmek düz kas depolarize iyon kanallarını aktive hücre içi yolları aktive daha fazla zamana ihtiyaç metabotropik muskarinik reseptörleri aktive) yavaş ve sürekli olduğunu. Dolayısıyla, muskarin ile ilgili bölümü eğri altındaki alanın ölçülmesi ve daha iyi yakalanır. </li><li> Şeritler ve farmakolojik tedavilerde sonuçlarını karşılaştırmak mümkün veri normalleştirmek. Normalleştirme için seçilen parametre patolojik durum, araştırma veya deney tasarımı, test bileşikleri ile etkilenmemelidir. Bu parametreler, kullanım şerit ağırlığına enine kesit alanı, KCI tepkisinin (Şekil 4B), bir kasılma ajana en yüksek tepkinin maksimum tepki (Şekil 7B) ve%% &#39;si arasında,(Örneğin, CCh) veya rahatlatıcı maddeler (örneğin, papaverin). </li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Bu yazıda mesane fizyolojisi ve patolojisi, yanı sıra mesane bozukluklarının tedavisinde yeni ilaçların keşfini yardım ile ilgili önemli bilimsel sorular çok sayıda adrese kullanılabilir vitro düz kas kasılması yönteminde basit bir tarif. Biz, mesane düz kas kasılmasının, gelişim, patolojik ve farmakolojik özellikler (Şekil 2-4), sinir iletimini modülasyonu (Şekil 5-7A), tür farkları (Şekil 4), organ farklılıkları değer...

Mesane düz kas idrar eleme ortaya çıkarmak için idrar depolamaya izin vermek için gevşer ve sözleşmeler. Gevşeme içsel düz kas özellikleri ile ve detrusor beta adrenerjik reseptörleri (β insan 3 AR) aktive sempatik sinirler norepinefrin (NE) tonik salınımı, aracılık eder. Işeme sempatik girişini engellemek ve ACh / ATP mesane düz kasını 1 sözleşme için serbest parasempatik sinirleri aktive ederek elde edilir. Beyin ve / veya omurilik yaralanması, nörodejeneratif hastalıklar, diyabet, mesane çıkım tıkanıklığı veya interstisyel sistit gibi çeşitli patolojik durumlar, derinden hayatın 2 hastanın kalitesi üzerinde ciddi etkileri olan, mesane fonksiyon değiştirebilir. Düz kas, afferent ve efferent sinirleri ve / veya: Bu koşullar, bir veya daha fazla bileşen mesane etkileyerek düz kasının kasılma kuvveti üzerinde etkisimukoza. In vivo ve mesane fonksiyonu çalışma için birkaç in vitro yöntemler geliştirilmiştir. In vivo sistometri mesane fonksiyon temel ölçüsüdür. Bu fizyolojik koşullara yakın altında bilgileri toplama sağlayan bir sağlam hazırlanması olsa da, yumuşak kas şeritlerin kullanımı tercih edildiği durumlar da vardır. Bu, cerrahi ve / veya farmakolojik manipülasyonlar hayatta kalmasını ve in vivo preparasyonun stabilitesini veya etkileyebilecek durumlara dahil çalışmalar, insan doku veya pahalı kimyasal maddelerin kullanılmasını gerektirir zaman. Bu yöntem, aynı zamanda, mesane her bir bileşeninin ilaçlar, yaş ve patoloji etkilerinin incelenmesini kolaylaştırmaktadır, düz kas, mukoza, afferent ve efferent sinirleri yani. Mesane şeritler bilimsel bir dizi soru cevap birçok grup tarafından yılda istihdam edilmiştir. Bunlar eva için kullanıldımiyojenik spontan aktivitede bir değişiklik ölçmek üze- re patoloji ile indüklenen. Bu aktivite aşırı aktif mesane (AAM), aciliyeti ve sıklığı, belirtilere katkıda bulunduğuna inanılan ve bu nedenle AAM 3-9 için geliştirilen ilaç için bir hedef olduğunu. Mesane şeritler de rahatlama ya da düz kas kasılmasını ya ikna etmek için hedef olabilir iyon kanalları ve / veya reseptörleri ve / veya hücre içi yollar keşfetme amacı ile düz kas tonusunu modüle myojenik ve nöronal faktörleri araştırmak için kullanıldı 3,10- 13. Diğer çalışmalar patoloji 14,15 tarafından uyarılan vericileri ve ilgili reseptörleri ve değişiklikler de dahil olmak nörotransmisyonun doğasına odaklanmıştır. Buna ek olarak, yöntem, organ 19-21 ve ilaç yapı-aktivite ilişkisinin değerlendirilmesi 22-24 arasında, farklı türlerdeki 16-18&#39;den dokular arasındaki karşılaştırmalar için kullanılmıştır. Bu yöntemin bir uzantısı MEASUR için kullanılmıştırefferent sinirler 25 yerden verici salınımı üzerindeki ilaçların etkisini e. Ayrıca, dokuların (mesane, üretra, gastrointestinal sistem, GI) (araştırma için onaylanmış ameliyatlar veya organ donör dokudan), insan veya hayvan hasat ve spinal kord yaralanması (SKY), mesane çıkım tıkanıklığı dahil olmak üzere hayvan modellerinde çeşitli çeşitli (BOO), veya interstisyel sistit (IC) bu tekniği kullanılarak incelenmiştir edilebilir. Bu yazıda yukarıda belirtilen çeşitli bilimsel soruları için gerekli deneysel protokolleri ile birlikte bu yöntemin kullanımı, göstermektedir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Tissue Bath System with Reservoir</td><td>Radnoti, LLC</td><td>159920</td><td>isolated tissue baths</td></tr><tr><td>Warm water recirculator pump</td><td>Kent Scientific Corporation&amp;nbsp;</td><td>TPZ-749</td><td>to keep tissue baths to 37 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>Computer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Data Acquisiton System</td><td>DataQ Instruments</td><td>DI-710-UH</td><td>To view, record and analyze data</td></tr><tr><td>Transbridge Transducer Amplifier</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-TBM4M</td><td>Transducer amplifier</td></tr><tr><td>Grass stimulator</td><td>Grass Technologies</td><td>Model S88</td><td>Stimulator</td></tr><tr><td>Anesthesia System</td><td>Kent Scientific Corporation&amp;nbsp;</td><td>ACV-1205S</td><td>To anesthetesize the animal</td></tr><tr><td>Anesthetizing Box</td><td>Harvard Apparatus</td><td>500116</td><td>To anesthetesize the animal</td></tr><tr><td>Anesthesia Masks</td><td>Kent Scientific Corporation&amp;nbsp;</td><td>AC-09508</td><td>To anesthetesize the animal</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Materials and Surgical Instruments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning Corp</td><td>184 SIL ELAST KIT</td><td>To pin, dissect, &amp;amp; cut tissue</td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Corning</td><td>3160-152</td><td>To dissect/cut tissue</td></tr><tr><td>Insect Pins</td><td>ENTOMORAVIA Austerlitz Insect Pins</td><td>Size 5</td><td>To pin tissue</td></tr><tr><td>Bench Pad</td><td>VWR International</td><td>56617-014</td><td>Absorbent bench underpads</td></tr><tr><td>Rat surgical Kit</td><td>Kent Scientific Corporation&amp;nbsp;</td><td>INSRATKIT</td><td>To remove and dissect tissue</td></tr><tr><td>2 Dumont #3 Forceps</td><td>Kent Scientific Corporation&amp;nbsp;</td><td>INS500064</td><td>To remove and dissect tissue</td></tr><tr><td>Tissue Forceps</td><td>Kent Scientific Corporation&amp;nbsp;</td><td>INS500092</td><td>To remove and dissect tissue</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Kent Scientific Corporation&amp;nbsp;</td><td>INS500236</td><td>To remove and dissect tissue</td></tr><tr><td>Scalpel blade</td><td>Kent Scientific Corporation&amp;nbsp;</td><td>INS500239</td><td>To remove and dissect tissue</td></tr><tr><td>Professional Clipper&amp;nbsp;</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>CLP-223&amp;nbsp;45</td><td>To remove fur</td></tr><tr><td>Suture Thread</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-50</td><td>Tie tissue</td></tr><tr><td>Tissue Clips</td><td>Radnoti, LLC</td><td>158802</td><td>Attach tissue to rod/transducer</td></tr><tr><td>1 g weight</td><td>&amp;nbsp;Mettler Toledo</td><td>11119525</td><td>For transducer calibration</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Krebs Solution:&lt;br /&gt;Sodium chloride&lt;br/&gt; Potassium chloride&lt;br/&gt; Monobasic potassium phosphate&lt;br/&gt; Magnesium sulfate&lt;br/&gt; Dextrose&lt;br/&gt; Sodium bicarbonate&lt;br/&gt; Calcium chloride&lt;br/&gt; Magnesium chloride</td><td>&amp;nbsp;&lt;br /&gt;Sigma&lt;br/&gt; Fisher&lt;br/&gt; Fisher&lt;br/&gt; Fisher&lt;br/&gt; Fisher&lt;br/&gt; Sigma&lt;br/&gt; EMD&lt;br/&gt; Baker</td><td>&amp;nbsp; &lt;br /&gt;S7653&lt;br/&gt; P217-500&lt;br/&gt; P285-3&lt;br/&gt; M65-500&lt;br/&gt; D16-500&lt;br/&gt; S5761&lt;br/&gt; CX0130-2&lt;br/&gt; 2444</td><td>To prepare Krebs solution</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein</td><td>029405</td><td>To anesthetesize the animal</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Oxygen tank</td><td>Matheson Tri Gas</td><td>ox251</td><td>To use with anesthesia system</td></tr><tr><td>Carbogen Tank (95% Oxygen; 5% Carbon Dioxide)&amp;nbsp;</td><td>Matheson Tri Gas</td><td>Moxn00hn36D</td><td>To aerate Krebs solutions</td></tr></tbody></table>

bladder smooth muscle strip contractility as a method to evaluate lower urinary tract pharmacology

Biz, bir in vitro mesane düz kas kasılmasını ölçmek için bir yöntem, ve fizyolojik ve farmakolojik düz kas özellikleri yanı sıra patoloji ile uyarılan değişiklikler araştırmak için kullanımını tarif eder. Bu yöntem, cerrahi ve farmakolojik preparatların istikrar ve sağkalımı etkilediği manipülasyonları, insan dokusunun kullanılması ve / veya pahalı kimyasalların kullanımı gibi in vivo deneylerde karşılaşılan başlıca metodolojik zorlukları, üstesinden gelirken, mesane fonksiyonlarının anlaşılmasına önemli bilgi sağlar. Aynı zamanda sağlıklı ve patolojik koşullarda her mesane bileşenin (yani düz kas, mukoza, sinirler) özelliklerini araştırmak için bir yol sağlar. Mesane, bir anestezi verilen hayvanın, Krebs çözeltisi içine yerleştirildi ve şeritler halinde kesilir kaldırılır. Şeritler Krebs çözeltisi ile sıcak doldurulmuş bir odacığm içine yerleştirilir. Bir ucu bir izometrik tensio bağlı olduğubüzülme kuvveti ölçmek için n, dönüştürücü, diğer uç, sabit bir çubuk takılır. Doku doğrudan banyosuna veya in vivo mesane kasılmaları tetikleyen benzer sinirleri aktive elektrik alan uyarımı elektrotlar tarafından bileşikler ekleyerek uyarılır. Bu yöntemin kullanılması, gelişme esnasında ve deneysel omurilik yaralanması sonrası kendiliğinden düz kas kontraktilitesini değerlendirmek göstermektedir, nörotransmisyon (ilgili vericileri ve alıcıları), yumuşak kas aktivitesinin modülasyonunda rol oynayan faktörler doğası, tek tek bileşenlerin mesane rolü, ve türleri ve farmakolojik maddelere yanıt organ farklılıklar. Buna ek olarak, verici serbest kalmasına ve / veya düz kas gevşemesi, ilaç yapı-aktivite ilişkileri ve değerlendirme dahil olan hücre içi yolları araştırmak için kullanılabilir. In vitro olarak, düz kaslar yöntemi yaygın olarak kullanılmaktadır fo50 yıldır r ve önemli ölçüde mesane fonksiyon anlayışımıza yanı sıra halen mesane yönetimi için klinik olarak kullanılan bileşiklerin ilaç gelişmesine katkıda veriler sağlamıştır.

Spontan andMyogenic Etkinlik Spontan Miyojenik etkinlik sonrası gelişim 6-9 ve patoloji (örneğin, SCI, Yİ) 3-5 ile değişikliğe uğrar önemli bir düz kas özelliğidir. Bu aktivite aşırı aktif mesane (AAM), 2 belirtilerine katkıda inanılmaktadır çünkü, onu modüle reseptörleri, hücre içi yollar ve farmakolojik ajanların bir değerlendirme, AAM ve diğer düz kas fonksiyon bozuklukları için etkili tedaviler gel...

Watch this Scientific Journal Video about Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology at JoVE.com

Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

Bu yazıda, farmakolojik ajanlar ve sinir uyarımına tepki olarak, düz kas kasılmalarını değerlendirilmesi için bir in vitro yöntem, bir basit, ancak güçlü sunar. Ana uygulamalar ilaç tarama ve anlayış doku fizyoloji, farmakoloji, patoloji ve vardır.

Alt Üriner Sistem Farmakoloji değerlendirin bir Yöntem olarak mesane düz kas Şerit Kasılabilme

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties ...

bladder-smooth-muscle-strip-contractility-as-method-to-evaluate-lower

Research

JoVE Journal

Medicine

26.2K Görüntüleme.  University of Pittsburgh School of Medicine.  Bu yazıda, farmakolojik ajanlar ve sinir uyarımına tepki olarak, düz kas kasılmalarını değerlendirilmesi için bir in vitro yöntem, bir basit, ancak güçlü sunar. Ana uygulamalar ilaç tarama ve anlayış doku fizyoloji, farmakoloji, patoloji ve vardır. 

Video: Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

Mouse Bladder Wall Injection

Mouse bladder wall injection is a useful technique to orthotopically study bladder phenomena, including stem cell, smooth muscle, and cancer biology. Before starting injections, the surgical area must be cleaned with soap and water and antiseptic solution. Surgical equipment must be sterilized before use and between each animal. Each mouse is placed under inhaled isoflurane anesthesia (2-5% for induction, 1-3% for maintenance) and its bladder exposed by making a midline abdominal incision with scissors. If the bladder is full, it is partially decompressed by gentle squeezing between two fingers. The cell suspension of interest is intramurally injected into the wall of the bladder dome using a 29 or 30 gauge needle and 1 cc or smaller syringe. The wound is then closed using wound clips and the mouse allowed to recover on a warming pad. Bladder wall injection is a delicate microsurgical technique that can be mastered with practice.

Mouse bladder wall injection is a useful approach to orthotopically study bladder stem cell and cancer biology. This delicate microsurgical method can be mastered with careful technique and practice.

Fare mesane Duvar Enjeksiyon

Mouse bladder wall injection is a useful technique to orthotopically study bladder phenomena, including stem cell, smooth muscle, and cancer biology. ...

Tıp

Evaluation of Biomaterials for Bladder Augmentation using Cystometric Analyses in Various Rodent Models

Renal function and continence of urine are critically dependent on the proper function of the urinary bladder, which stores urine at low pressure and expels it with a precisely orchestrated contraction. A number of congenital and acquired urological anomalies including posterior urethral valves, benign prostatic hyperplasia, and neurogenic bladder secondary to spina bifida/spinal cord injury can result in pathologic tissue remodeling leading to impaired compliance and reduced capacity1. Functional or anatomical obstruction of the urinary tract is frequently associated with these conditions, and can lead to urinary incontinence and kidney damage from increased storage and voiding pressures2. Surgical implantation of gastrointestinal segments to expand organ capacity and reduce intravesical pressures represents the primary surgical treatment option for these disorders when medical management fails3. However, this approach is hampered by the limitation of available donor tissue, and is associated with significant complications including chronic urinary tract infection, metabolic perturbation, urinary stone formation, and secondary malignancy4,5.
Current research in bladder tissue engineering is heavily focused on identifying biomaterial configurations which can support regeneration of tissues at defect sites. Conventional 3-D scaffolds derived from natural and synthetic polymers such as small intestinal submucosa and poly-glycolic acid have shown some short-term success in supporting urothelial and smooth muscle regeneration as well as facilitating increased organ storage capacity in both animal models and in the clinic6,7. However, deficiencies in scaffold mechanical integrity and biocompatibility often result in deleterious fibrosis8, graft contracture9, and calcification10, thus increasing the risk of implant failure and need for secondary surgical procedures. In addition, restoration of normal voiding characteristics utilizing standard biomaterial constructs for augmentation cystoplasty has yet to be achieved, and therefore research and development of novel matrices which can fulfill this role is needed.
In order to successfully develop and evaluate optimal biomaterials for clinical bladder augmentation, efficacy research must first be performed in standardized animal models using detailed surgical methods and functional outcome assessments. We have previously reported the use of a bladder augmentation model in mice to determine the potential of silk fibroin-based scaffolds to mediate tissue regeneration and functional voiding characteristics.11,12 Cystometric analyses of this model have shown that variations in structural and mechanical implant properties can influence the resulting urodynamic features of the tissue engineered bladders11,12. Positive correlations between the degree of matrix-mediated tissue regeneration determined histologically and functional compliance and capacity evaluated by cystometry were demonstrated in this model11,12. These results therefore suggest that functional evaluations of biomaterial configurations in rodent bladder augmentation systems may be a useful format for assessing scaffold properties and establishing in vivo feasibility prior to large animal studies and clinical deployment. In the current study, we will present various surgical stages of bladder augmentation in both mice and rats using silk scaffolds and demonstrate techniques for awake and anesthetized cystometry.

Surgical stages of bladder augmentation are described using 3-D scaffolds in murine and rat models. To test the efficacy of biomaterial configurations for use in bladder augmentation, techniques for both awake and anesthetized cystometry are presented.

Çeşitli Kemirgen Modeller sistometrik Analizleri kullanarak Mesane Büyütme için Biyomalzeme Değerlendirilmesi

Renal function and continence of urine are critically dependent on the proper function of the urinary bladder, which stores urine at low pressure and ...

Biyomühendislik

The Use of Cystometry in Small Rodents: A Study of Bladder Chemosensation

The lower urinary tract (LUT) functions as a dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a convenient time. While storing urine, however, the bladder is exposed for prolonged periods to waste products. By acting as a tight barrier, the epithelial lining of the LUT, the urothelium, avoids re-absorption of harmful substances. Moreover, noxious chemicals stimulate the bladder's nociceptive innervation and initiate voiding contractions that expel the bladder's contents. Interestingly, the bladder's sensitivity to noxious chemicals has been used successfully in clinical practice, by intravesically infusing the TRPV1 agonist capsaicin to treat neurogenic bladder overactivity1. This underscores the advantage of viewing the bladder as a chemosensory organ and prompts for further clinical research. However, ethical issues severely limit the possibilities to perform, in human subjects, the invasive measurements that are necessary to unravel the molecular bases of LUT clinical pharmacology. A way to overcome this limitation is the use of several animal models2. Here we describe the implementation of cystometry in mice and rats, a technique that allows measuring the intravesical pressure in conditions of controlled bladder perfusion.
	After laparotomy, a catheter is implanted in the bladder dome and tunneled subcutaneously to the interscapular region. Then the bladder can be filled at a controlled rate, while the urethra is left free for micturition. During the repetitive cycles of filling and voiding, intravesical pressure can be measured via the implanted catheter. As such, the pressure changes can be quantified and analyzed. Moreover, simultaneous measurement of the voided volume allows distinguishing voiding contractions from non-voiding contractions3.
	Importantly, due to the differences in micturition control between rodents and humans, cystometric measurements in these animals have only limited translational value4. Nevertheless, they are quite instrumental in the study of bladder pathophysiology and pharmacology in experimental pre-clinical settings. Recent research using this technique has revealed the key role of novel molecular players in the mechano- and chemo-sensory properties of the bladder.

Cystometry is an efficient technique to measure bladder function of small animals in vivo. The bladder is continuously infused at rates controlled through an intravesical catheter, whereas the urethra is left free for micturition. This allows for repetitive filling and emptying of the bladder, while intravesical pressure and voided volume are recorded.

Küçük Kemirgenler sistometri ve Kullanımı: Mesane Chemosensation Çalışması

	The lower urinary tract (LUT) functions as a  dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a  convenient time. While ...

Contractility Measurements of Human Uterine Smooth Muscle to Aid Drug Development

Discovery and characterization of novel pharmaceutical compounds or biochemical probes rely on robust and physiologically relevant assay systems. We describe methods to measure ex vivo myometrium contractility. This assay can be used to investigate factors and molecules involved in the modulation of myometrial contraction and to determine their excitatory or inhibitory actions, and hence their therapeutic potential in vivo. Biopsies are obtained from women undergoing cesarean section delivery with informed consent. Fine strips of myometrium are dissected, clipped and attached to a force transducer within 1 mL organ baths superfused with physiological saline solution at 37 &#176;C. Strips develop spontaneous contractions within 2&#8211;3 h under set tension and remain stable for many hours (&#62;6 h). Strips can also be stimulated to contract such as by the endogenous hormones, oxytocin and vasopressin, which cause concentration-dependent modulation of contraction frequency, force and duration, to more closely resemble contractions in labor. Hence, the effect of known and novel drug leads can be tested on spontaneous and agonist-induced contractions.
This protocol specifically details how this assay can be used to determine the potency of known and novel agents by measuring their effects on various parameters of human myometrial contraction. We use the oxytocin- and V1a receptor antagonists, atosiban and SR49059 as examples of known compounds which inhibit oxytocin- and vasopressin-induced contractions, and demonstrate how this method can be used to complement and validate pharmacological data obtained from cell-based assays to aid drug development. The effects of novel agonists in comparison to oxytocin and vasopressin can also be characterized. Whilst we use the example of the oxytocin/ vasopressin system, this method can also be used to study other receptors and ion channels that play a role in uterine contraction and relaxation to advance the understanding of human uterine physiology and pathophysiology.

This article describes experimental protocols to study ex vivo contractions of human myometrium and their application in drug discovery. This technique is used to improve the understanding of myometrial physiology and pathophysiology as well as to validate pharmacological data from novel research probes or drug leads.

İnsan rahim düz kas yardım ilaç geliştirme için contractility ölçümleri

Discovery and characterization of novel pharmaceutical compounds or biochemical probes rely on robust and physiologically relevant assay systems. We ...

Simplified, High-throughput Analysis of Single-cell Contractility using Micropatterned Elastomers

Cellular contractile force generation is a fundamental trait shared by virtually all cells. These contractile forces are crucial to proper development, function at both the cellular and tissue levels,and regulate the mechanical systems in the body. Numerous biological processes are force-dependent, including motility, adhesion, and division of single-cells, as well as contraction and relaxation of organs such as the heart, bladder, lungs, intestines, and uterus. Given its importance in maintaining proper physiological function, cellular contractility can also drive disease processes when exaggerated or disrupted. Asthma, hypertension, preterm labor, fibrotic scarring, and underactive bladder are all examples of mechanically driven disease processes that could potentially be alleviated with proper control of cellular contractile force. Here, we present a comprehensive protocol for utilizing a novel microplate-based contractility assay technology known as fluorescently labeled elastomeric contractible surfaces (FLECS), that provides simplified and intuitive analysis of single-cell contractility in a massively scaled manner. Herein, we provide a step-wise protocol for obtaining two six-point dose-response curves describing the effects of two contractile inhibitors on the contraction of primary human bladder smooth muscle cells in a simple procedure utilizing just a single FLECS assay microplate, to demonstrate proper technique to users of the method. Using FLECS Technology, all researchers with basic biological laboratories and fluorescent microscopy systems gain access to studying this fundamental but difficult-to-quantify functional cell phenotype, effectively lowering the entry barrier into the field of force biology and phenotypic screening of contractile cell force.

This work presents a flexible protocol for utilizing fluorescently labeled elastomeric contractible surfaces (FLECS) Technology in microwell format for simplified, hands-off quantification of single-cell contractile forces based on visualized displacements of fluorescent protein micropatterns.

Mikrodesenli Elastomerler Kullanarak Tek Hücreli Kasılmanın Basitleştirilmiş, Yüksek Verimli Analizi

Cellular contractile force generation is a fundamental trait shared by virtually all cells. These contractile forces are crucial to proper development, ...

Ultrasonography of the Adult Male Urinary Tract for Urinary Functional Testing

The incidence of clinical benign prostatic hyperplasia (BPH) and lower urinary tract symptoms (LUTS) is increasing due to the aging population, resulting in a significant economic and quality of life burden. Transgenic and other mouse models have been developed to recreate various aspects of this multifactorial disease; however, methods to accurately quantitate urinary dysfunction and the effectiveness of new therapeutic options are lacking. Here, we describe a method that can be used to measure bladder volume and detrusor wall thickness, urinary velocity, void volume and void duration, and urethral diameter. This would allow for the evaluation of disease progression and treatment efficacy over time. Mice were anesthetized with isoflurane, and the bladder was visualized by ultrasound. For non-contrast imaging, a 3D image was taken of the bladder to calculate volume and evaluate shape; the bladder wall thickness was measured from this image. For contrast-enhanced imaging, a catheter was placed through the dome of the bladder using a 27-gauge needle connected to a syringe by PE50 tubing. A bolus of 0.5 mL of contrast was infused into the bladder until a urination event occurred. Urethral diameter was determined at the point of the Doppler velocity sample window during the first voiding event. Velocity was measured for each subsequent event yielding a flow rate. In conclusion, high frequency ultrasound proved to be an effective method for assessing bladder and urethral measurements during urinary function in mice. This technique may be useful in the assessment of novel therapies for BPH/LUTS in an experimental setting.

We describe the use of high frequency ultrasound with contrast imaging as a method to measure bladder volume, bladder wall thickness, urine velocity, void volume, void duration, and urethral diameter. This strategy can be used to assess voiding dysfunction and treatment efficacy in various mouse models of lower urinary tract dysfunction (LUTD).

İdrar Fonksiyonel Testi için Erişkin Erkek İdrar Yolu Ultrasonografisi

The incidence of clinical benign prostatic hyperplasia (BPH) and lower urinary tract symptoms (LUTS) is increasing due to the aging population, resulting ...

A Decentralized (Ex Vivo) Murine Bladder Model with the Detrusor Muscle Removed for Direct Access to the Suburothelium during Bladder Filling

Previous studies have established the release of chemical substances from flat bladder mucosa sheets affixed in Ussing chambers and exposed to changes in hydrostatic pressure or mechanical stretch and from cultured urothelial cells upon hydrostatic pressure changes, stretch, cell swelling, or drag forces, and in bladder lumen at end of filling. Such findings led to the assumption that these mediators are also released in suburothelium (SubU)/lamina propria (LP) during bladder filling, where they affect cells deep in the bladder wall to ultimately regulate bladder excitability. There are at least two obvious limitations in such studies: 1) none of these approaches provide direct information about the presence of mediators in SubU/LP, and 2) the stimuli used are not physiological and do not recapitulate authentic filling of the bladder. Here, we discuss a procedure that enables direct access to the suburothelial surface of the bladder mucosa in the course of bladder filling. The murine detrusor-free preparation we created closely resembles filling of the intact bladder and allows pressure-volume studies to be performed on the bladder in the absence of confounding signaling from spinal reflexes and detrusor smooth muscle. Using the novel detrusor-free bladder model, we recently demonstrated that intravesical measurements of mediators cannot be used as a proxy to what has been released or present in the SubU/LP during bladder filling. The model enables examination of urothelium-derived signaling molecules that are released, generated by metabolism and/or transported into the SubU/LP during the course of bladder filling to transmit information to neurons and smooth muscle of the bladder and regulate its excitability during continence and micturition.

A Decentralized Ex Vivo Murine Bladder Model with the Detrusor Muscle Removed for Direct Access to the Suburothelium during Bladder Filling

The detrusor-free bladder model enables direct access to the suburothelium to study local mechanisms for regulation of biologically active mediator availability in suburothelium/lamina propria during storage and voiding of urine. The preparation closely resembles filling of an intact bladder and allows pressure-volume studies to be performed without systemic influences.

Mesane Dolgusu Sırasında Suburothelium Doğrudan Erişim için Kaldırılan Detrusor Kas ile Ademi Merkeziyet (Ex Vivo) Murine Mesane Modeli

Previous studies have established the release of chemical substances from flat bladder mucosa sheets affixed in Ussing chambers and exposed to changes in ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

Farmakoloji Araştırma İzole Doku Banyo-uygulamalarda Düz Kas Fonksiyon Ölçümü

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Biyoloji

In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents

ATP, released from the urothelium in response to bladder distension, is thought to play a significant sensory role in the control of micturition. Therefore, accurate measurement of urothelial ATP release in a physiological setting is an important first step in studying the mechanisms that control purinergic signaling in the urinary bladder. Existing techniques to study mechanically evoked urothelial ATP release utilize cultured cells plated on flexible supports or bladder tissue pinned into Ussing chambers; however, each of these techniques does not fully emulate conditions in the intact bladder. Therefore, an experimental setup was developed to directly measure ATP concentrations in the lumen of the rodent urinary bladder.
In this setup, the bladders of anesthetized rodents are perfused through catheters in both the dome of the bladder and via the external urethral orifice. Pressure in the bladder is increased by capping the urethral catheter while perfusing sterile fluid into the bladder through the dome. Measurement of intravesical pressure is achieved using a pressure transducer attached to the bladder dome catheter, akin to the setup used for cystometry. Once the desired pressure is reached, the urethral catheter's cap is removed, and fluid collected for ATP quantification by luciferin-luciferase assay. Through this experimental setup, the mechanisms controlling both mechanical and chemical stimulation of urothelial ATP release can be interrogated by including various agonists or antagonists into the perfusate or by comparing results between wildtype and genetically modified animals.

In Vivo Luminal Measurement of Distension-Evoked Urothelial ATP Release in Rodents

This protocol describes the procedure for measuring ATP concentrations in the lumen of the bladder in an anesthetized rodent.

İn Vivo Kemirgenlerde Distansiyon Uyarılmış Ürotelyal ATP Salınımının Luminal Ölçümü

ATP, released from the urothelium in response to bladder distension, is thought to play a significant sensory role in the control of micturition. ...

Preparation and Utilization of Freshly Isolated Human Detrusor Smooth Muscle Cells for Characterization of 9-Phenanthrol-Sensitive Cation Currents

Detrusor smooth muscle (DSM) cells present within the urinary bladder wall ultimately facilitate urine storage and voiding. Preparation of the viable, fresh, and isolated DSM cells presents an important technical challenge whose achievement provides optimal cells for subsequent functional and molecular studies. The method developed and elaborated herein, successfully used by our group for over a decade, describes dissection of human urinary bladder specimens obtained from open bladder surgeries followed by an enzymatic two-step treatment of DSM pieces and mechanical trituration to obtain freshly isolated DSM cells. The initial step involves dissection to separate the DSM layer (also known as muscularis propria) from mucosa (urothelium, lamina propria, and muscularis mucosa) and the adjacent connective, vascular, and adipose tissues present. The DSM is then cut into pieces (2-3 mm x 4-6 mm) in nominal Ca2+-containing dissection/digestion solution (DS). DSM pieces are next transferred to and sequentially treated separately with DS containing papain and collagenase at ~37 &#176;C for 30-45 min per step. Following washes with DS containing enzyme-free bovine serum and trituration with a fire-polished pipette, the pieces release single DSM cells. Freshly isolated DSM cells are ideally suited for patch-clamp electrophysiological and pharmacological characterizations of ion channels. Specifically, we show that the TRPM4 channel blocker 9-phenanthrol reduces voltage-step evoked cation currents recorded with the amphotericin-B perforated patch-clamp approach. DSM cells can also be studied by other techniques such as single cell RT-PCR, microarray analysis, immunocytochemistry, in situ proximity ligation assay, and Ca2+ imaging. The main advantage of utilizing single DSM cells is that the observations made relate directly to single cell characteristics revealed. Studies of freshly isolated human DSM cells have provided important insights characterizing the properties of various ion channels including cation-permeable in the urinary bladder and will continue as a gold standard in elucidating DSM cellular properties and regulatory mechanisms.

We describe a method for preparation of the single freshly isolated detrusor smooth muscle cells from human urinary bladder specimens employing a two-step enzymatic procedure. The obtained viable DSM cells can be studied by various single cell techniques including the described amphotericin-B patch-clamp electrophysiology to reveal physiological and pharmacological properties.

9-Fenanthrol Duyarlı Katyon Akımlarının Karakterizasyonu İçin Yeni İzole Edilmiş İnsan Detrusor Düz Kas Hücrelerinin Hazırlanması ve Kullanımı

Detrusor smooth muscle (DSM) cells present within the urinary bladder wall ultimately facilitate urine storage and voiding. Preparation of the viable, ...