Bu çalışma, NIDDK (LO), Amerikan Kalp Birliği (AB), İsveç ve Kungliga Fysiografiska Sällskapet, Lund, İsveç (UB) Wenner-Gren Vakıflar doktora sonrası burslar R01 DK078161 tarafından desteklenmiştir. Histopatoloji, Biyoinformatik ve FACS Maine Tıp Merkezi Araştırma Enstitüsü çekirdekli tesisleri (2P20RR18789-06 tarafından desteklenen) ve MMCRI Hayvan Tesis Ek destek sağlanmıştır.

1. Böbrek Sindirim hazırlanması için Reaktifler <ol><li> A (w / v) ve% 1 Pankreatin sindirmek (w / v) solüsyonu 1.5 ml% 0.25 kollajenaz 8 E17.5 böbrekler nefrojenik bölge hücreleri (NZCs) çıkarılması için gerekli olacaktır. Pankreatin oda sıcaklığında erimesi için yaklaşık 2 saat sürer, en büyük sayı önce deney yapılmalıdır beklenen embriyonik böbrekler için yeterli çözüm sindiremez. Ilk kez, 25 kollajenaz mg 10 ml Dulbecco&#39;nun Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) açık bir 15 ml, steril santrifüj tüpüne. Ekleyerek çözüm sindirimi hazırlayın Bu enzimatik sindirimi engel olacak şekilde, DPBS kalsiyum veya magnezyum içeren DEĞIL kritik öneme sahiptir. Kollajenaz A. çözünmüş kollajenaz bir nutator karışımı bir çözüm ve en az 2 saat süreyle 100 mg Pankreatin ekle çözmek için, 10 dakika boyunca bir nutator çözüm karıştırın. Alternatif olarak, kollajenaz A / Pankreatin sindirmek çözüm 4 gecede bir nutator karışık olabilir ° C kollajenaz A ve Pankreatin tartım sırasında atmosfere kolayca dağıtmak ve burun pasajda tahriş edebilir gibi bir maske takmaları tavsiye edilir. </li><li> Hank Tamponlu Salin solüsyonu (HBSS)% 5 fetal sığır serum (FBS) (v / v) çözeltisi hazırlayın. Karıştırmak için ters çevirin. 8 böbrekler her tüp için 1 ml gerekli olacaktır. </li><li> % 1 glutamin (v / v) ve% 1 Penisilin-Streptomisin (PenStrep) (v / v) ile keratinosit serum serbest orta tamamlayan kültür ortamı hazırlayın. </li><li> Kat insan fibronektin çözüm büyüme yüzey cm 2 başına 5 mg bir konsantrasyon ile steril düz dipli polistiren doku kültürü levhalar (96, 48, 24 veya iyi 6). Fibronektin tozu 5 mg 5 ml steril H 2 O. yeniden süspanse Bu, kalsiyum veya magnezyum olmadan steril DPBS 01:25 seyreltilir ve 250 ml, 24 plaka her kuyuya eklenir. Tabaklar, sonra oda sıcaklığında 1 saat için 1 saat 4 ° C Alternatif takip fibronektin çözüm inkübe, tabak 4 gece inkübe edilebilir ° C çözüm laminer akış kaputu sonra aspire edilir önce orta / ek hücreleri. </li></ol> 2. Diseksiyon Böbrekler ve çıkarma Kapsül (oda sıcaklığında Bitti) <ol><li> E17.5 anda, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış bir prosedür kullanılarak anne kurban rahim kaldırmak, ve kalsiyum ve magnezyum DPBS içeren bir Petri kabı yerleştirin. Diseksiyon mikroskobu altında, her embriyo rahim kaldırmak ve her embriyo başını kesmek için saatçiler &#39;forseps kullanabilir. Tüm çöp rahim sonra, embriyolar, kalsiyum ve magnezyum, mümkün olduğu kadar çok kan ve doku artıkları olarak geride bırakarak embriyolar tamamen karşılamak için yeterli DPBS içeren temiz bir Petri kabı aktarın. </li><li> Forseps kullanarak, embriyonun karın duvarındaki göbek düzeyinde dairesel bir kesi yapmak. Sonra sırtında embriyo forseps bir set ile omuzları aşağı pin ve akciğerlerden iç organları diğer forseps kullanarak mesane kaldırmak. Bu uygulama ile tek hareketle yapılabilir. Böbrekler, organların kütlesinin arkasına eklenmelidir. Parçalanmış organlar böbrekler bağlı kalır yoksa, onlar dorsal vücut duvarı dikkatlice çıkarılmalıdır. Bu diseksiyon işlemi sırasında zarar görmüş Böbrekler uygunsuz hücre tipleri ile nihai kültür kontamine olarak atılmalıdır. </li><li> Yavaşça birbirine bağlı böbrekler tutmaya özen böbrekler, organların geri kalanından uzakta alay. Böbrekler arasındaki doku forseps bir set tutun ve diğer forseps ile böbrekler birine bağlı adrenal bezin kapmak. Böbreküstü bezi, böbrek kapsül eklenmelidir. Böbreküstü bezi ve böbrek dışında, bir muz soyma benzer dört bir yanından gelen kapsül kabuğu hafifçe. Soyma ise böbrek yarısında split ve kapsül altında böbrek dokusuna zarar vermemek için emin olmak için özen gösterin. Kalan herhangi bir kapsül gibi hala bağlıysa üreter dikkatlice çıkarın. Kalan böbrek ile tekrarlayın. </li><li> Böbrekler HBSS 5 ml polistiren tüp içine yerleştirmek için bir kesim transfer pipetlemeyin kullanın. Her embriyo için 2.2-2.4 adımları tekrarlayın. Böbrekler, tüp başına 8 toplanmış olabilir. Uygulama, diseksiyon ve kapsül alınması ile embriyo ortalama 2-3 dakika sürecektir. </li></ol> 3. Böbrekler Enzimatik Sindirim (aksi belirtilmedikçe Oda Sıcaklığı Tüm Adımları At) <ol><li> Dikkatle böbrekler ile temas kaçınarak bir pipet ile böbreklerin içeren 5 ml tüpler HBSS çözüm çıkarın. Hemen kollajenaz sonraki örnek geçmeden önce böbrekleri içeren 5 ml tüp A / Pankreatin sindirmek çözümü 1,5 ml ekleyin. Böbreklerin her tüp için tekrarlayın. </li><li> Enzim / böbrek Yeri tüpler 15 dakika önceden ısıtılmış 37 ° C inkübatör nutator sindirir. 2 dakika öncesindirimi tamamlanması, bir taze yapılmaktadır her sindirimi için 5 ml polistiren tüp 3 ul DNaz (1 U / ml) ekleyin. </li><li> Hızla kaldırmak inkübatör ile sindirerek, FBS 75 ul eklemek ve karıştırmak için 3 kez ters. Bankta 2 dakika boyunca bekletin. </li><li> 5 ml polistiren tüp kalan 0.2 ml hücre süspansiyonu ve arkasında böbrekler bırakarak DNaz (1 U / ml) içeren 1.4 ml hücre süspansiyonu aktarın. Çözüm ekstra 0,2 ml ekstraselüler matriks gibi maddeler ihtiva arkasında bıraktı. </li><li> Önceden ısıtılmış bir 10 dakika boyunca 37 ° C inkübatör nutator Mix hücre süspansiyonu / DNaz. </li><li> Hızla inkübatör hücre süspansiyonları kaldırmak ve her 1.5 ml Eppendorf tüp transferi. 5 dakika boyunca 325 g mikrofuge&#39;ye hücre süspansiyonları Spin. </li><li> 5 ila 6 kat yukarı ve aşağı pipetleme hücre pelletini tekrar süspansiyon pelet, 1 ml% 5 FBS / HBSS süpernatantı. Sonraki numune geçmeden önce her tüp kap. </li><li> 5 dakika için 325 g mikrosantrifüj hücre süspansiyonları Spin. </li><li> Süpernatantı alın ve bir sonraki örnek geçmeden önce, her tüp ve kapak boru katkı keratinosit serum serbest orta (KSFM) 0,5 ml ekleyin. Orta tüm tüplere ilave edildikten sonra, yavaşça, her bir 1ml mikropipet 5 ila 6 kat yukarı ve aşağı pipetleme hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. 5 ml taze bir polistiren tüp tüm hücre süspansiyonları birleştirin. </li><li> Örnek başına KSFM ile 5 ml polistiren yuvarlak alt tüp yerleştirilir Pre-ıslak iki adet 40 mikron hücre-süzgeç kapaklar. 1 ml mikropipet ile aktararak bir hücre süzgecinden kapağı ile hücre süspansiyonları iletin. Pipet ile filtre dokunmaktan kaçının. Flow-through toplayın ve ikinci süzgeç kapağı ile filtrasyon tekrar. Hücre süzgeç kapağını çıkarın ve yeni bir kapak ile normal bir 5 ml polistiren tüp değiştirin. </li><li> Seyreltilmesi katkı maddeleri ile KSFM gerektiği gibi, bir hemasitometre veya cm 2 başına 100.000-200.000 hücre yoğunluğu fibronektin kaplı bir kültür plaka kuyu sayım cihazı ve transfer hücreleri diğer hücre ile hücre sayımı. Genellikle, 10 embriyo çöp başına yaklaşık 4.5x10 6 hücre almak. </li><li> 37 hücre inkübe ° C,% 5 CO 2 ile nemlendirilmiş inkübatör. </li><li> Hücreleri kurtarmak ve ek reaktifler ile önceden uyarımı için 2-4 saat orta eklemek için izin ver. 1 ila 48 saat boyunca ilgi bileşik hücreleri uyarmak. Üreticinin talimatları izleyerek Qiagen RNeasy Micro kiti kullanılarak PCR analizi için RNA Purify veya floresan hücreleri immunostain için aşağıdaki yönergeleri izleyin. </li></ol> 4. Hücre Sabitleme için Reaktifler hazırlanması ve immün <ol><li> % 4 PFA hazırlayın: 55 PBS (v / v)% 4 paraformaldehid çözülür ° C düzenli ajitasyon. Kullanmadan önce oda sıcaklığında soğutun. Bu çözüm, toksik ve belirlenen çöp konteynerleri atılmalıdır. </li><li> PBS için% 0.3 (v / v) bir çözüm elde etmek için Triton X-100 ekleyerek permeabilization çözüm hazırlayın. </li><li> Kullanılmak üzere ikincil antikor yükseltmek için kullanılabilir olduğu gibi aynı türün serum ile PBS içinde% 5 engelleme çözüm hazırlayın. Hedef antijene karşı anti-Rabbit Alexa Fluor 568 bir eşek ile bir tavşan antikor tespit Örneğin,% 5 eşek içeren serum engelleyici bir solüsyon hazırlanır. 4 ° C saklayınız </li><li> Primer antikor antikor% 5 engelleme çözümü için uygun konsantrasyon ekleyerek çözüm hazırlayın. </li><li> Sekonder antikoru solüsyonu kullanımdan hemen önce hazırlayın. Nükleer counterstain DAPI ve% 5 engelleme çözümü için Phalloidin gibi diğer organel belirteçler ile birlikte üretici firmanın önerdiği konsantrasyonda fluorofor konjuge antikor ekleyin. Depolama gerekiyorsa, karanlıkta, 4 çözüm tutmak ° C kullanana kadar. </li><li> % 50 gliserol / PBS solüsyonu (v / v) ile immunohistokimyasal hücrelerinin depolanması için hazırlayın. Alternatif olarak, Vectashield kullanılabilir. </li></ol> 5. Hücre Sabitleme ve immün <ol><li> Aşağıdaki protokol, 24 plaka NZCs fiksasyon ve boyama için tasarlanmıştır. Verilen Hacimler tek bir kuyu için. Reaktifler hücre dekolmanı önlemek için tüm adımları sırasında hafifçe pipetlenir olmalıdır ve plaka ajitasyon inkübasyon adımları tavsiye edilmez. </li><li> 1 ml mikropipet ile hafifçe orta kaldırmak ve 0.5 ml% 4 PFA bağlı kültür hücreleri ekleyin. , Oda sıcaklığında rahatsız 15 dakika inkübe edin. </li><li> % 4 PFA çıkarın ve her iyi permeabilization çözüm 0,5 ml ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. </li><li> Permeabilization çözüm kaldırın ve yavaşça durulama ortalama 0.5 ml PBS ile iki kez yıkayın. </li><li> Engelleme solüsyonu 0.5 ml ekleyin ve 60 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Engelleme çözüm çıkarın ve 0,225 ml primer antikor çözümü eklemek. </li><li> 2 saat veya gece boyunca oda sıcaklığında inkübe 4 ° C </li><li> Primer antikor çözüm çıkarın ve hafifçe rinse durulayın ortalama 0.5 ml PBS ile iki kez. </li><li> 0,225 ml ikincil antikor çözüm ekleyin. Plaka karanlıkta, oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edin. </li><li> Sekonder antikor çözüm kaldırın ve yavaşça durulama ortalama 0.5 ml PBS ile iki kez yıkayın. </li><li> % 50 gliserol / PBS solüsyonu (v / v) ya da iyi yüzey alt kapağı için yeterli Vectashield 0,3 ml ekleyin. </li><li> Epifloresans mikroskop veya mağaza ile Resim hücreleri 4 folyoya sarılı ° C </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2555/2555fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 NZCs E17.5 embriyolar cm 2 başına 200.000 hücre kaplanmış, saflaştırılmış ve 24 saat olmak üzere toplam 37 ° C&#39;de inkübe edildi. Hücreler immunofluorescent boyama öncesinde bir Leica DM IRB inverted mikroskop ile faz kontrast tarafından görüntülenmiştir. (A) 24 saat sonra kültür NZCs 20X faz kontrast görünümü. (B) Hücreler sabit nefron progenitör hücreler için spesifik bir tavşan anti-PAX2 antikor (kırmızı) ve ikincil Alexa Fluor 568 konjuge eşek anti-Tavşan ile boyandı. Not mavi çekirdekleri DAPI ile zıt. (C) 24 saat sonra kültür nefron atalarıdır bir küme 40X faz kontrast görünümü (merkezli). (D) LacZ + Foxd1 organizatörü kontrolü altında β-galaktosidaz ifade Foxd1 LacZ gerilme, embriyo Foxd1 izole NZCs 40X görüntü, gelişmekte olan böbrek nefrojenik bölge içinde stromal hücre popülasyonu ifade edilir. Hücreler, F-aktin işaretleyici Phalloidin (Oregon yeşil birincil konjuge), nükleer leke DAPI (Mavi) ve tavşan anti-β-galaktosidaz ile boyandı Foxd1, algılama için (ikincil Alexa Fluor eşek anti-Tavşan 568) + stromal hücreler ( kırmızı).

<ol>
	<li>Blank, U., Brown, A., Adams, D. C., Karolak, M. J., Oxburgh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP7+promotes+proliferation+of+nephron+progenitor+cells+via+a+JNK-dependent+mechanism.">BMP7 promotes proliferation of nephron progenitor cells via a JNK-dependent mechanism.</a> Development. 136, 3557-3566 (2009).</li><li>Brunskill, E. W., Aronow, B. J., Georgas, K., Rumballe, B., Valerius, M. T., Aronow, J., Kaimal, V., Jegga, A. G., Grimmond, S., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+gene+expression+in+the+developing+kidney+at+microanatomic+resolution.">Atlas of gene expression in the developing kidney at microanatomic resolution.</a> Developmental Cell. 15, 781-791 (2008).</li><li>Godin, R. E., Takaesu, N. T., Robertson, E. J., Dudley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+BMP7+expression+during+kidney+development.">Regulation of BMP7 expression during kidney development.</a> Development. 125, 3473-3482 (1998).</li><li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inductive+epitheliomesenchymal+interaction+in+cultured+organ+rudiments+of+the+mouse.">Inductive epitheliomesenchymal interaction in cultured organ rudiments of the mouse.</a> Science. 118, 52-55 (1953).</li><li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenetic+interaction+between+embryonic+mouse+tissues+separated+by+a+membrane+filter.">Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter.</a> Nature. 172, 869-870 (1953).</li><li>Hatini, V., Huh, S. O., Herzlinger, D., Soares, V. C., Lai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+stromal+mesenchyme+in+kidney+morphogenesis+revealed+by+targeted+disruption+of+Winged+Helix+transcription+factor+BF-2.">Essential role of stromal mesenchyme in kidney morphogenesis revealed by targeted disruption of Winged Helix transcription factor BF-2.</a> Genes and Development. 10, 1467-1478 (1996).</li><li>Oxburgh, L., Chu, G. C., Michael, S. K., Robertson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFb+superfamily+signals+are+required+for+morphogenesis+of+the+kidney+mesenchyme+progenitor+population.">TGFb superfamily signals are required for morphogenesis of the kidney mesenchyme progenitor population.</a> Development. 131, 4593-4605 (2004).</li><li>Srinivas, S., Watanabe, T., Lin, C. S., William, C. M., Tanabe, Y., Jessell, T. M., Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1, 4-4 (2001).</li><li>Yu, J., Carroll, T. J., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+proliferation+and+differentiation+of+mesenchymal+cells+in+the+mouse+metanephric+kidney.">Sonic hedgehog regulates proliferation and differentiation of mesenchymal cells in the mouse metanephric kidney.</a> Development. 129, 5301-5312 (2002).</li></ol>

Bu protokolde, embriyonik böbrek nefrojenik bölge hücreleri izole ve kültür bir yöntem açıklanmaktadır. Başlangıçta nefrojenik bölge (Boş ve ark, 2009) hücreleri BMP7 tedavi etkileri bir çalışmanın parçası olarak yayınlanan bir yöntem geliştirilmesi. İlk çalışmada, NZC nüfus içinde temsil edilen hücre tipleri karakterize etmek için bir dizi deney yapılmıştır. (Srinivas ve ark, 2001; Yu ve ark; Kısaca, kortikal stroma (Foxd1 + / lacZ) (. ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Watchmaker&#x2019;s forceps #5</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-4905</td>
<td>2 pairs required</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagenase A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>10 103 578 001</td>
<td>Wear mask</td>
</tr>
<tr>
<td>Porcine Pancreatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P8096</td>
<td>Wear mask</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS w/ Ca, Mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-513F</td>
<td>With Mg &amp; Ca</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioWhittaker</td>
<td>14-901E</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14175</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KSFM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>10724-011</td>
<td>without added growth factors</td>
</tr>
<tr>
<td>L-Glutamine 200mM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7513</td>
<td>Use @ 1% v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4333</td>
<td>Use @ 1% v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Fibronectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>356008</td>
<td>Supplied as powder</td>
</tr>
<tr>
<td>24 well culture plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific </td>
<td>142485</td>
<td>Nunclon</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS w/o Mg &amp; Ca</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-512F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5mL polystyrene tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>352235</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNase (1 U/&mu;l)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18068-015</td>
<td>4 &mu;l per 1.5 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>40 micron cell-strainer </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>352235</td>
<td>w/cap and tube</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>Use @ 4 % w/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>VW3929-2</td>
<td>Use @ 0.3 % v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P3813</td>
<td>Supplied as powder</td>
</tr>
<tr>
<td>Donkey serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>017-000-121</td>
<td> Use @ 5 % v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Rabbit anti-PAX2 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>71-6000</td>
<td>Dilute 1:100</td>
</tr>
<tr>
<td>Rabbit anti-&beta;-gal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedicals</td>
<td>559762</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>Oregon Green 488 phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>O7466</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A10042</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>DAPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D1306</td>
<td>Dilute 1:5000</td>
</tr>
<tr>
<td>Vectashield</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>GX0185-6</td>
<td>Mix 50 % with H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>RNeasy Micro Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>74004</td>
<td>Use "DNase on column" protocol</td>
</tr>
<tr>
<td>Transfer pipettes, 3ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>357575</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and culture of cells from the nephrogenic zone of the embryonic mouse kidney

Böbrek embriyonik gelişim yoğun organogenez epitel mezenkimal etkileşim için bir model olarak ve doğuştan böbrek hastalığı kökeni anlayış kazanmak için her iki çalışılmıştır. Daha yakın zamanlarda, nefrojenik kaderi karşı naif embriyonik kök hücreleri direksiyon olasılığı, rejeneratif tıp ortaya çıkan alanında incelenmiştir. Fareyi genetik çalışmalar böbrek gelişimi için gerekli olan çeşitli yollar belirledik ve organ gen transkripsiyon son zamanlarda küresel bir katalog <a href="http://www.gudmap.org/">oluşturuldu</a> http://www.gudmap.org/, temel gelişim fonksiyonlarının çok sayıda aday düzenleyiciler. Kemirgen böbrek Organogenez organ kültürü incelenecek ve birçok rapor, ya da aday proteinleri uygulayarak veya aday genler siRNA veya morpholinos kullanarak ifade aşağı vurma sonuçlarını analiz etmek için bu yaklaşım kullanılır. Kültürlü organları, makromoleküllerin ve virüs parçacıkları kompakt bir ekstrasellüler matriks sınırlayan difüzyon içeren Ancak, gelişmekte olan böbrek kök / progenitör hücre farklılaşması karşısında yenilenmesini düzenleyen sinyal çalışmaya organ kültürü uygulanabilirliği sınırlıdır. Hücre farklılaşma epitel indükleyicisi izolasyonu gelişmekte olan böbrek ex vivo nefrojenik bölge veya progenitör hücre niş oluşturan bir birincil hücre sistemi geliştirdik böbrek kök / progenitör hücre niş etkileyen olaylar sinyalizasyon incelenmesi. Sınırlı enzimatik sindirim E17.5 az gelişmekte olan böbrekler, nefrojenik bölge hücreleri seçici kurtarılmış olabilir. Işleminden sonra, bu hücreler optimize koşulları kullanarak düzensiz bir tek tabaka olarak yetiştirilebilir. Marker gen analizi, in vivo nefrojenik bölge karakteristik hücre tipleri bu kültürlerin bir dağıtım içerdiğini gösterir ve kültür döneminde uygun işaretleyici gen ekspresyonu korumak . Bu hücreler küçük molekül ve rekombinant protein tedavisi son derece erişilebilir ve daha önemlisi de aday kök / progenitör hücre düzenleyici etkileri çalışmanın büyük ölçüde kolaylaştırır viral iletimi,. Temel hücre çoğalması ve hücre ölümü gibi in vivo olarak nefron kök / progenitör hücrelerinin karakteristik moleküler belirteçler ifade değişiklikleri gibi biyolojik parametreler deneysel sonuçların başarılı olarak kullanılabilir. Bu romanda ana hücre tekniği kullanılarak laboratuarda devam eden çalışmaları nefron kök / progenitör hücrelerin kendini yenileme karşı farklılaşma yönetmelik düzenleyen temel mekanizmaları ortaya çıkarmak için amaçlamaktadır.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney at JoVE.com

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Bu yazıda, gelişmekte olan böbrek kök / progenitör hücreleri düzenleyen sinyalizasyon yolaklar çalışma için kullanılabilir embriyonik fare böbrek progenitör hücre niş izolasyonu ve kültürü için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu kültür hücreleri küçük molekül ve rekombinant protein tedavisi için son derece erişilebilir ve önemlisi de aday yollarının etkin bir şekilde müdahale etmenizi sağlar viral iletimi,.

Embriyonik Fare Böbrek Nefrojenik Zone Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

isolation-culture-cells-from-nephrogenic-zone-embryonic-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

17.9K Görüntüleme.  Maine Medical Center Research Institute. Bu yazıda, gelişmekte olan böbrek kök / progenitör hücreleri düzenleyen sinyalizasyon yolaklar çalışma için kullanılabilir embriyonik fare böbrek progenitör hücre niş izolasyonu ve kültürü için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu kültür hücreleri küçük molekül ve rekombinant protein tedavisi için son derece erişilebilir ve önemlisi de aday yollarının etkin bir şekilde müdahale etmenizi sağlar viral iletimi,.

Video: Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

Fare Embriyonik Germinal Hücreleri İzolasyon ve türetilmesi

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Biyoloji

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of endocardium surrounded by myocardium. The myocardium secretes cardiac jelly, a hyaluronan-rich gelatinous matrix, into the atrioventricular (AV) junction and outflow tract (OFT) lumen. At stage HH14 valvulogenesis begins when a subset of endocardial cells receive signals from the myocardium, undergo endocardial to mesenchymal transformation (EMT), and invade the cardiac jelly. At stage HH25 the valvular cushions are fully mesenchymalized, and it is this mesenchyme that eventually forms the valvular and septal apparatus of the heart. Understanding the mechanisms that initiate and modulate the process of EMT and cell differentiation are important because of their connection to serious congenital heart defects. In this study we present methods to isolate pre-EMT endocardial and post-EMT mesenchymal cells, which are the two different cell phenotypes of the prevalvular cushion. Pre-EMT endocardial cells can be cultured with or without the myocardium. Post-EMT AV cushion mesenchymal cells can be cultured inside mechanically constrained or stress-free collagen gels. These 3D in vitro models mimic key valvular morphogenic events and are useful for deconstructing the mechanisms of early and late stage valvulogenesis.

This article will provide a method for isolating and culturing quail or chicken HH14- valve endocardial cells and HH25 valve cushion mesenchymal cells.

Kuş Embriyonik Kapak Progenitör Hücreler izolasyonu ve Kültür

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

Fare Göz Retina Kök Hücre İzolasyonu

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Yetişkin Fare insizör Diş Epitel Kök Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

Gelişmekte Embriyonik Fare Kalp Vana Bölgesi&#39;nde Protein İzolasyonu

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

Trans-iç hücre embriyonik kök hücrelerin kitle enjeksiyon daha yüksek Chimerism oranları için yol açar.

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

Yetişkin Fare Kalbinden Atriyal Miyositler, Ventrikül Miyositleri ve Miyosit Olmayanların Eşzamanlı İzolasyonu ve Kültürü

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of the cells. These adjustments are critical to eukaryotic cell survivability and &#39;damage control&#39; during fluctuating nutrient and salinity levels, temperature, and various chemical and radiation stresses. Due to the highly dynamic nature of the RNA-level responses, and the instability of many of the RNA:RNA and RNA:protein intermediates, obtaining a meaningful snapshot of the cytoplasmic RNA state is only possible with a limited number of methods. Transcriptome-wide, RNA-seq-based ribosome profiling-type experiments are among the most informative sources of data for the control of translation. However, absence of a uniform RNA and RNA:protein intermediate stabilization can lead to different biases, particularly in the fast-paced cellular response pathways. In this article, we provide a detailed protocol of rapid fixation applicable to eukaryotic cells of different permeability, to aid in RNA and RNA:protein intermediate stabilization. We further provide examples of isolation of the stabilized RNA:protein complexes based on their co-sedimentation with ribosomal and poly(ribo)somal fractions. The separated stabilized material can be subsequently used as part of ribosome profiling-type experiments, such as in Translation Complex Profile sequencing (TCP-seq) approach and its derivatives. Versatility of the TCP-seq-style methods has now been demonstrated by the applications in a variety of organisms and cell types. The stabilized complexes can also be additionally affinity-purified and imaged using electron microscopy, separated into different poly(ribo)somal fractions and subjected to RNA sequencing, owing to the ease of the crosslink reversal. Therefore, methods based on snap-chilling and formaldehyde fixation, followed by the sedimentation-based or other type of RNA:protein complex enrichment, can be of particular interest in investigating finer details of rapid RNA:protein complex dynamics in live cells.

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

We present a technique to rapidly stabilize translational (protein biosynthesis) complexes with formaldehyde crosslinking in live yeast and mammalian cells. The approach enables dissecting transient intermediates and dynamic RNA:protein interactions. The crosslinked complexes can be used in multiple downstream applications such as in deep sequencing-based profiling methods, microscopy, and mass-spectrometry.

Ökaryotik Hücrelerden Çeviri Komplekslerinin Hızlı In Vivo Fiksasyonu ve İzolasyonu

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...