Biz FACs analizi ile teknik yardım için Ohio State Üniversitesi Kapsamlı Kanser Merkezi Analitik Cytometry Çekirdek tesisi, özellikle Katrina Moore, teşekkür ederim. Ayrıca biz onların bilimsel anlayışlar için Dr William Pu ve onun grubunu tanır. Bu çalışma NIH HL091878 (JL) ve Nationwide Çocuk Hastanesi Kalp Merkezi tarafından desteklenmiştir.

Ekipman ve Çözümleri 1. Hazırlık <ol><li> Diseksiyon aletleri sterilize - otoklav ile kapalı bir alet tepsisine - kapak bölgenin diseksiyonu için yetişkin kalpleri ve 2 ince forseps ayıklamak için ince doku makas. % 70 etanol (EtOH) diseksiyon önce araçları ile birlikte püskürtün. </li><li> Hemen önce deney için her çözelti hazırlayın ve steril bir 0.2 um filtreden geçirilerek sterilize çözümler. Kullanılıncaya kadar buz üzerinde çözümler tutun. <ol><li> Steril Ayrılma Tampon (15 ml toplam / numune). 1.2 mi kollajenaz IV, 300 ul% 2.5 tripsin ve 150 ul serum civciv birleştirin. Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile 15 ml hacim getirin. </li><li> Steril Sıralama Tamponu (12 ml toplam) hazırlandı. 25 ul 0.5 M etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) ve 12 ul DNase I birleştirin (Rnase-serbest). HBSS ile 12 ml hacmi kadar getir. </li><li> VEC Kültür Medya. Mix endotel GroEBM2 ortam 500 ml kitinden parçalara ayrılır bileşenlerin eklenmesiyle, üreticinin talimatlarına (malzeme-tabloyu bakın) göre ortam wth. </li><li> GFP Negatif Kültür Medya (non-endotelyal hücre medya). Penisilin / streptomisin (pen / strep), 5 ml (% 1 son konsantrasyon) ve 50 mi FBS (% 10 nihai konsantrasyon) ile Medium 199 1x 445 ml karıştırın. </li></ol></li></ol> Yetişkin farelerde ve E14.5 embriyolar Kapak Bölge 2. Diseksiyon <ul><li> Tüm hayvan prosedürleri onaylanmış ve Nationwide Çocuk Hastanesi Araştırma Enstitüsü IACUC kurallarına uygun olarak yapıldı. </li><li> Tie2 GFP fareleri, Jackson Laboratories&#39;den (stok no 003658) 14 &#39;den satın alınmıştır ve FVB / N background homozigoz genotip olarak muhafaza edildi ve bu nedenle bu sağlanması Tie2 pozitif endotel hücreleri tüm dışı yay ifade GFP. </li><li> FACS sıralama için, bir yaş eşleştirilmiş negatif samp hazırlamakBöyle C57 / BL6 olarak GFP içermiyor le FACS sıralama için GFP kapısı parametrelerini ayarlamak için. NOT: Bu protokol ve temsili sonuçları üç, dört aylık yetişkin fareler veya embriyonik gün (E) 14.5 bir çöp kullanarak dayanmaktadır. </li></ul><ol><li> Yetişkin Fareler: CO 2 anoksi hemen aşağıdaki fedakarlık, hafifçe göğüs boşluğu açmak ve kalp ve akciğerler maruz diseksiyon makas kullanın. Büyük arterlerde, kavrama forseps ile kalp maruz kalan ve vücudun uzak çekin sonra. Bozulmamış ise akciğer dokusu çıkarın ve soğuk HBSS&#39;de yer kalpler durulayın. Ventrikül çıkarın ve bozulmamış atriyoventriküler kanal &#39;halka&#39; ve aort bölgeleri terk Atriumlarm uzak çekin. &#39;Halka&#39; açmak ve kapak yapıları ortaya çıkarmak için atriyoventriküler kanal tarafında aşağı bir kesi yapmak. Forseps ile yavaşça uzak alay tarafından miyokardiyumu ve proksimal aort bölgeleri çıkarın. Pembe miyokardiyumda üzerinde beyaz, yoğun doku gibi valf broşürler tanımlayın. Yavaşça detaatriyoventriküler valflerden korda tendinae ch ve mümkün olduğu kadar geriye kalan miyokardın kadar çıkarın. Çekin veya VECs yerinden olabilir beri bu işlem sırasında vana broşürler kazımak değil dikkatli olun. 1 ml HBSS içeren 1.5 ml Eppendorf tüpüne kesilmiş kapak bölgeleri koyun ve buz üzerinde tutmak. NOT: Dikkatli diseksiyon örneği kontamine olabilir non-valvüler endotel hücreleri ortadan kaldırmak için çok önemlidir. </li><li> Embriyolar: çiftleşme fiş görülmektedir 14.0 gün sonra dişi farelerin (çiftleşme fiş = 0.5 gün arasında sabah) Kurban. <ol><li> Hemen kurban takip, rahim (embriyoları içeren) incelemek ve soğuk HBSS&#39;de yıkayın. Rahim bireysel embriyolar parçalara ayır ve her embriyoyu çevreleyen embriyonik sarısı kesesi kaldırmak. Embriyoların her birinden kalpleri çıkarın ve 2.1 adım takip. (NOT: yavaşça kalp maruz ve çıkarma işlemini kolaylaştırmak için yardımcı olmalıdır, sadece üst uzantıların altında forseps ile embriyo sıkma.) </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. FACS Hücre Ayrılma ve Hazırlık <ol><li> Steril bir pipet uçları kullanılarak, kapak bölümleri ihtiva eden Eppendorf tüp HBSS çıkarın. </li><li> 1 ml ayrışma tamponu ve 4 ul DNase ile değiştirin </li><li> , 7 dakika boyunca 37 ° C&#39;de tüpler döndürün. </li><li> Pipet yukarı ve 3 kez aşağı ve sonra örnek 15 sn razı. 15 ml konik tüp içine (ayrışmış hücreleri içeren) süpernatant toplayın. </li><li> , Kollajenaz tepkimeyi durdurmak toplama tüpüne at serumu 125 ul ekleyin. Buz üzerinde toplama tüp tutun. </li><li> Tekrar ayrışma adım (3,2-3,5) dokuz kez yüzer dokuz fraksiyonlarını toplamak. </li><li> Artık ve yığınlarını kaldırarak tek bir hücre süspansiyonu sağlamak için yeni bir toplama tüpüne 70 mikron naylon filtre yolu ile fraksiyone toplama geçirin. </li><li> 5 dk hücrelerini pellet haline getirmek için 400 g süspansiyon Spin. </li><li> 1 mi Sıralama Tamponu içinde ve hücre pelletiniFACS kadar buz üzerinde tutmak. </li></ol> GFP pozitif VECs Sınıflandırma 4. FACS <ol><li> Enkaz dışlamak ve tek hücreleri yakalamak için ileri ve yan dağılım için kapıları ayarlamak; çiftli ayrımcılık kapılamayı kullanarak ikilileri hariç. Negatif kontrol örneği kaydedin ve Tıe2-GFP örnekteki GFP pozitif hücre nüfus karşılaştırmak ve doğru tanımlamak için kapı ayarları tanımlayın. </li><li> FACS üzerinden GFP pozitif hücrelerin analiz ve kapı ayarları rafine. </li><li> Sıralama Tie2 GFP numunesi ve hem de GFP-pozitif ve GFP-negatif hücreleri toplamak. Hücreler doğrudan sıralama Sıralama tamponuna RNA ekstraksiyonu için kullanılacak ise. FACS sonra kültür hücreleri, 1 ml FBS ile 1 ml VEC ortam ihtiva eden bir steril tüp içinde, GFP-pozitif hücrelerin toplanması, ve 1 ml FBS olmayan endotel 1 ml&#39;lik ortam GFP negatif hücreleri toplamak. Hücre canlılığı artırmak için bu% 50 medya / 50% serum kombinasyonunu kullanın. Sonrası FACS analizi kadar buz üzerinde tutun. </li></ol> 5. Mesaj FACS verenins <ol><li> RNA Ekstraksiyonu: <ol><li> Hemen 8 dakika boyunca 1.500 xg&#39;de FACS, santrifüj GFP pozitif ve negatif hücrelerin takip. </li><li> Dikkatlice süpernatant (sıralama tampon) pipet ve atın. </li><li> 200 ul TRIzol (pelet burada önerilen numune boyutları için görünür değildir) hücre pelletini. </li><li> -80 ° C&#39;de dondurmak ya da daha önce laboratuarımızda 15 tarafından tarif edildiği gibi, mRNA&#39;nın izole edilmesi için standart bir fenol-kloroform ekstraksiyonu başlar. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak kullanılarak, cDNA sentezi Mastermix için RNA 50-200 ng kullanın. </li><li> Fare endotel hücre belirteçleri (CD31, von Willebrand Faktör (vWF)), valf interstisyel hücre belirteçleri (α-düz kas aktin (α-SMA), periostin (POSTN)) karşı IDT Primetime QPCR sondaları kullanılarak kantitatif PCR amplifikasyonu, miyositlerdeki Konu cDNA belirleyicileri (Mhc6, Mhc7) ve GAPDH. </li></ol&gt; </li><li> Murin VEC Kültürleme: <ol><li> FACS sıralama ve hücre toplama (adım 4.3), 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj sonrasında, hücreler. </li><li> Dikkatlice süpernatant (sıralama tampon + medya) pipetle ve atın. </li><li> VEC ortam 1 ml GFP-pozitif hücre peleti 1 ml ve endotel dışı ortam GFP-negatif pelletini. </li><li> Plastik slaytı bir kuyuda her numune Plaka ve birleşene kadar büyür. GFP negatif hücre için yaklaşık 1 hafta boyunca kültür konfluent hale gelmeye ve GFP pozitif hücreler için 2 haftadan daha uzun (3 bir örnek, yetişkin farelerden) konfluent hale gelmeye. Her iki gün medya değiştirin. </li></ol></li><li> Immunofluorescent Boyama: <ol><li> Hücrelerden Ortamı çıkarın ve oda sıcaklığında 30 dakika süreyle% 4 paraformaldehid (PFA) sabitleyin. Fosfat Tamponlu Tuz çözeltisi içinde 5 dakika her biri (PBS) ile sabit hücreler üç kez yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 5 bovin serum albümini / 1x PBS içinde ileri-geri ve blok oda kuyu çıkarın. </li><li> Inkübe(: 1000 ya da α-düz kas aktin (α-SMA), 1: 100, CD31, 1) primer antikorlar ile 4 ° C&#39;de slaytlar göre O / N. PBS içinde 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın. </li><li> , 400 PBS slaytlara ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin: ikincil antikoru (Alexa Fluor 568 keçi anti-fare) 1. seyreltin. Durulama slaytlar PBS içinde 5 dakika boyunca 3 x. </li><li> Vectashield içeren DAPI&#39;nin Dağı ve önceki görüntüleme için 4 ° C&#39;de 1 saat inkübe. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Tao, G., Kotick, J. D., Lincoln, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+development,+maintenance,+and+disease:+the+role+of+endothelial+cells.">Heart valve development, maintenance, and disease: the role of endothelial cells.</a> Current topics in developmental biology. 100, 203-232 (2012).</li><li>Lincoln, J., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+developmental+mechanisms+of+congenital+heart+valve+disease.+Birth+defects+research.">Molecular and developmental mechanisms of congenital heart valve disease. Birth defects research.</a> Part A, Clinical and molecular teratology. 91, 526-534 (2011).</li><li>Tao, G., Levay, A. K., Gridley, T., Lincoln, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mmp15+is+a+direct+target+of+Snai1+during+endothelial+to+mesenchymal+transformation+and+endocardial+cushion+development.">Mmp15 is a direct target of Snai1 during endothelial to mesenchymal transformation and endocardial cushion development.</a> Developmental biology. 359, 209-221 (2011).</li><li>Weinberg, E. J., Mack, P. J., Schoen, F. J., Garcia-Cardena, G., Kaazempur Mofrad, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+environments+from+opposing+sides+of+human+aortic+valve+leaflets+evoke+distinct+endothelial+phenotypes+in+vitro.">Hemodynamic environments from opposing sides of human aortic valve leaflets evoke distinct endothelial phenotypes in vitro.</a> Cardiovasc Eng. 10, 5-11 (2010).</li><li>Hinton, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+remodeling+and+organization+in+developing+and+diseased+aortic+valves.">Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves.</a> Circulation research. 98, 1431-1438 (2006).</li><li>Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+and+cellular+response+feedback+in+calcific+aortic+valve+disease.">Hemodynamic and cellular response feedback in calcific aortic valve disease.</a> Circulation research. 113, 186-197 (2013).</li><li>Bosse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+nitric+oxide+signaling+regulates+Notch1+in+aortic+valve+disease.">Endothelial nitric oxide signaling regulates Notch1 in aortic valve disease.</a> Journal of molecular and cellular cardiology. 60, 27-35 (2013).</li><li>Laforest, B., Andelfinger, G., Nemer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Gata5+in+mice+leads+to+bicuspid+aortic+valve.">Loss of Gata5 in mice leads to bicuspid aortic valve.</a> The Journal of clinical investigation. 121, 2876-2887 (2011).</li><li>Hofmann, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+deletion+of+murine+Jag1+leads+to+valve+calcification+and+congenital+heart+defects+associated+with+Alagille+syndrome.">Endothelial deletion of murine Jag1 leads to valve calcification and congenital heart defects associated with Alagille syndrome.</a> Development. 139, 4449-4460 (2012).</li><li>Wylie-Sears, J., Aikawa, E., Levine, R. A., Yang, J. H., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitral+valve+endothelial+cells+with+osteogenic+differentiation+potential.">Mitral valve endothelial cells with osteogenic differentiation potential.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 31, 598-607 (2011).</li><li>Gould, R. A., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+valvular+endothelial+cells.">Isolation of valvular endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. , (2010).</li><li>Butcher, J. T., Penrod, A. M., Garcia, A. J., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+morphology+and+focal+adhesion+development+of+valvular+endothelial+cells+in+static+and+fluid+flow+environments.">Unique morphology and focal adhesion development of valvular endothelial cells in static and fluid flow environments.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 24, 1429-1434 (2004).</li><li>Cheung, W. Y., Young, E. W., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+isolating+and+purifying+porcine+aortic+valve+endothelial+cells.">Techniques for isolating and purifying porcine aortic valve endothelial cells.</a> The Journal of heart valve disease. 17, 674-681 (2008).</li><li>Motoike, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+GFP+reporter+for+the+study+of+vascular+development.">Universal GFP reporter for the study of vascular development.</a> Genesis. 28, 75-81 (2000).</li><li>Peacock, J. D., Lu, Y., Koch, M., Kadler, K. E., Lincoln, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+spatial+expression+of+collagens+during+murine+atrioventricular+heart+valve+development+and+maintenance.">Temporal and spatial expression of collagens during murine atrioventricular heart valve development and maintenance.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 3051-3058 (2008).</li><li>Levay, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scleraxis+is+required+for+cell+lineage+differentiation+and+extracellular+matrix+remodeling+during+murine+heart+valve+formation+in+vivo.">Scleraxis is required for cell lineage differentiation and extracellular matrix remodeling during murine heart valve formation in vivo.</a> Circulation research. 103, 948-956 (2008).</li><li>Lincoln, J., Alfieri, C. M., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP+and+FGF+regulatory+pathways+control+cell+lineage+diversification+of+heart+valve+precursor+cells.">BMP and FGF regulatory pathways control cell lineage diversification of heart valve precursor cells.</a> Developmental biology. 292, 292-302 (2006).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nfatc1+coordinates+valve+endocardial+cell+lineage+development+required+for+heart+valve+formation.">Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation.</a> Circulation research. 109, 183-192 (2011).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada ilk kez tarif Tie2-GFP farelerden elde edilen murin embriyonik ve yetişkin VECs izolasyonu için yeni bir yöntem. Bu fare hattı yaygın endotel hücre popülasyonlarının izolasyonu için kullanılmış olsa da, bu VECs seçici izolasyonu gösteren ilk rapordur. Nedeniyle VEC nüfusun kırılganlığı, embriyonik ve yetişkin farelerin kalp kapakçıkları olumlu GFP (ve GFP negatif) hücrelerin tek hücre izolasyonu sağlayan bir sıkı protokol geliştirdik. Tie2-GFP farelerden alınan bütün 14 embriyolar ya da organları kullanarak orijinal yayın karşılaştırıldığında, hücrelerin seçilmiş bir popülasyonu izole etmek üzere, bu kırılgan endotel hücre popülasyonunun düşük yoğunlukta göre kolajenaz ve kesilmesi adımlarını optimize ettik. VEC izolasyon önce sadece sınırlı bir genetik ve biyomoleküler araçları ile büyük hayvan modellerinde bildirilmiştir. Bu araçlar iyi, bu nedenle abi farelerde kurulmuş ve kendilerinesıçangil VECs izole edilmesi için vasıflı kapak araştırma için kullanılacak deney tasarımları genişletilmiş bir dizi sağlar. Bu nedenle, bu yaklaşımın önemli bir avantajı, VECs Vahşi tip farelerde ve kapak hastalığı ve yaralanma modellerinin geçici olarak izole edilebilir olmasıdır. İkinci bir avantaj VECs izole edilmiş ve daha kesin bir şekilde, in vivo durumu yansıtan ekspresyonu koruyarak, diseksiyon hemen sonra analiz edilebilmesidir. Bundan başka, bu yalıtım protokol numarası genişlemesi ve in vitro ortamda neden olduğu, bu nedenle potansiyel fenotipik değişikliklerin engellenmesi hücre kültürü ortadan kaldırmak için yeterlidir. Yenilikleri ve bu protokol deneysel yararlarına rağmen, biz sınırlamalar hala varolduğunu. İlk olarak, kemirgen vanalarındaki VEC nüfusun boyutu çok küçük ve bu nedenle birden fazla zamana embriyonik yavrular gen ekspresyon analizi için yeterli RNA&#39;yı üretmek için gerekli olmasıdır. Thi ikens Birden yetiştiricilerin kullanılarak aşılabilir, bazı post-izolasyon analiz araçları uygulama üzerinde bir etkisi olabilir. Bu sınırlama özellikle moleküler profil ve fonksiyonel analizleri dahil olmak VECT fenotipleri daha kapsamlı analizler gerçekleştirmek için GFP pozitif VECs kaynaşmaya kültürleri kurulması için bir meydan okuma olmuştur. Bu nedenle biz değil tüm zorluklar bizim yaklaşımla üstesinden edildiğini kabul ama bu üstesinden gelmek için çalışıyoruz ilgi alanıdır. Kapak bölgelerden VECs izole Bu yaklaşım ventriküler miyokard içinde endokarda, veya vasküler yapıların Tie-GFP -pozitif, non-valvüler endotel hücrelerinden kirlenme olasılığını tanıttı. Bugüne kadar, diğer kalp endotel hücre popülasyonlarından VECs moleküler fark tespit edilmemiştir. Ancak Nfatc1 geninin bir artırıcı bölge tanımlanmış ve spesifik olarak yok olduğunu VECs etiket gösterilmiştirkalp 18 içinde EMT ve başka bir endotel hücre popülasyonu tabi tutulur. Cre modeli (Nfatc1 encre) olarak mevcuttur, gelecekteki çalışmalar kontaminasyon riskleri en aza indirmek için bu hattın özgüllüğünü faydalanabilirler. Non-valvüler Tie2-GFP- pozitif hücrelerinin yanı sıra, kapakçıkların septal ve duvar miyokard duvarların dairesel bölgeye eklemek noktada miyositlerden kirlenme olasılığı her zaman vardır. Burada veriler gösterilmemiştir, başlangıçta, anti-GFP ve anti-CD31 antikoru ile kaplanmış konjuge edilmiş boncuklar kullanılarak kesilmiş kapak bölgelerden VECs izole etmek için çalışmalar başladı. Bu yaklaşım, endotel hücreleri izole etmek için başarılı iken, biz bitişik olmayan endotel hücre tiplerinden önemli hücre topaklanma deneyimli ve bu nedenle kurbanda ve miyokard hücreleri bizim deneysel örnek kirlenmiş. Bu parametreler sadece tek hücre süspansiyonu yalıtmak için ayarlanmış gibi FACS analizi kullanılarak kaçınılması olmuşturS ve PCR analizi, miyosit spesifik genlerin ekspresyonu, bu sınırlama (Şekil 3) için kontrol edilen şekilde tespit etmek. Bizim kontaminasyon minimum olarak kabul edilebilir olsa da, GFP ve endotel hücre-spesifik yüzey belirteçlerinin çift seçimi ile gelecekte önlenebilir potansiyel bir deneysel karmaşıklık kalır. Bu protokolü kullanarak, embriyonik ve yetişkin fareler ve bu yaklaşım RNA izolasyonu ve GFP ve GFP pozitif negatif hücre popülasyonlarının, hücre kültürü için kullanılabilir olduğuna ilişkin örneklerden başarılı bir şekilde izole VECs sahiptir. Bununla birlikte bu yaklaşım, bu uygulamalarla sınırlı değildir, ve hücresel ve moleküler fonksiyonel yaklaşımları bir bolluk için kullanılabilir. Ayrıca, Tie2-GFP arka plan, hastalık ve sağlıkta VECT nüfus karşılaştırmalı çalışmalar için izin verecektir genetik fare modelleri ile yetiştirilen olabilir. Bu yeni yöntemin geliştirilmesi, ilk kez, odaklanmış çalışmaları için sağlayacaktırvana geliştirme ve bakım VECs katkısını inceleyen ve endotel-bağımlı kapak hastalığı önceden hesaba katılmayan mekanizmalarını ortaya koyabilir.

Olgun kapak vana endotel hücrelerinin (VECs) 1, tek bir tabaka ile özel bir hücre dışı bir valf interstitial hücrelerin (kurban) serpiştirilmiş matriks (ECM) ile kapsüllenmiş üç katmanlı tabakadan oluşur. ECM rolü kalp döngüsü boyunca hemodinamik yürürlükteki sürekli değişir dayanmak için bütün gerekli biyomekanik özellikleri temin etmektir. Yetişkin vana supap ECM&#39;nin devir sıkıca büyük ölçüde hareketsiz ve hastalık yokluğunda fibroblast gibi kurban düzenlenir. VIC nüfus ek olarak, kalp kapakçığı endotel hücreleri (VECs) vana çizgilerinin 2&#39;nin yüzeyi üzerinde kesintisiz bir endotelyumu oluşturur. Kapak yapısı ve fonksiyonu için ECM ve kurban önemi bizim ve başkaları tarafından tarif edilmiş olmasına rağmen, VECs rolü daha az iyi bilinmektedir. Ancak bu nispeten küçük hücre popülasyonu embriyo kapak oluşumu için çok önemli olan ve valf içindeki işlevsel olarak tanımlanmaktadırhastalığı. Atriyoventriküler kanal ve çıkış yolu bölgeler içinde endotel hücrelerinin bir alt mezenkimal dönüşüm (EMT) ve endokardial minderler 1,3 şekli olarak bilinen şişlikler için endotelyal uğradıklannda embriyo kalp kapak oluşumu başlar. Bu yapıların içindeki yeni dönüştürülmüş mezenkimal hücreler, daha sonra kurbanlardan farklılaşmak ve olgun vanaları oluştururlar. EMT tamamlandıktan sonra, yastıklar çevreleyen endotel hücreleri, VECs olarak adlandırılan yaralanmalara karşı koruma valfını olgun kesintisiz bir endotel hücre tabakasını oluşturur. Buna ek olarak, VECs hemodinamik çevre anlamda ECM 1,3 homeostazı düzenlemek için altta yatan kurban ile iletişim kurmak için, moleküler gösterilmiştir. Hasta kapaklarda, VEC tek tabaka ECM organizasyon anormal değişiklikler ve değişmiş biyomekanikteki 4,5 ile birlikte bozulur. Buna ek olarak, fare modelinde yapılan çalışmalar, VEC disfonksiyon kapak d altta yatan nedeni olduğunu göstermektedirhastalığı bulunanlarda 1,6-9. VECs vana geliştirme, bakım, hastalık ve önemli bir rol oynadığı gibi, biz tamamen alanını ilerletmek ve hastalık mekanizmalarını anlamak için kendi zamansal fenotipleri tanımlamak önemlidir. Birkaç laboratuarları önceki çalışması başarıyla domuz ve koyun modelleri 10-12 VECs izole edilmiştir. Bu sebeplerden dolayı valf büyük boyutları nedeniyle, manyetik tane hücre ayrıştırma ve tek bir hücre klonal olarak saf popülasyonları 11-13 oluşturmak için etkili olmuştur izolasyon dahil olmak üzere farklı bir dizi yöntem ile, ardından, sürme ve / veya enzimatik sindirim yoluyla sağlayan tecritler uygulanmıştır. Ancak, bu modeller sayesinde yüksek maliyetlerine ek olarak moleküler araçlarının kullanılabilirliğini sınırlayan domuz ve koyun genomların eksik açıklama için kısıtlayıcı olabilir. Bu nedenle izolasyon sonra domuz ve küçükbaş VECs bir deney kısıtlayıcı olabilir. Fare modelleri nedeniyle genetik manipü için birçok olasılığa tercih ediliryon embriyonun ve yetişkin moleküler araçları, ancak bugüne kadar küçük hayvan modellerinde herhangi bir izolasyon VEC bildirilmiştir. Bu durum şu anda böylece antikor bazlı izolasyon yöntemleri önlenmesi, VEC-spesifik belirteçler benzersiz kimliğini yoksun bir azınlık hücre popülasyonu içeren küçük doku örnekleri ile çalışma zorluk muhtemeldir. Bu makalede, embriyonik ve yetişkin aşamalarında sıçangil VECs direkt izolasyonu için yeni bir yöntem sunulmaktadır. Bu protokol, her endotel hücre tiplerinde ekspres GFP ve kapsamlı bir endotel hücre popülasyonlarının 14 incelemek için kullanılmıştır Tie2-GFP farelerden, yararlanır. Bununla birlikte, bu çalışmada bir yenilik, ilk kez bu fareler, vanalardan endotel hücreleri izole etmek için kullanılmıştır olmasıdır. Kapak dokusu ve FACS ayıklama, ardından dokuz enzimatik sindirim, bir dizi dikkatli diseksiyon ile, VECs izole edilebilir ve çeşitli deneysel teknikler kullanılmaktadırdoğrudan sıralama aşağıdaki RNA ekstraksiyon ve kültürünü tutabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>		
<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:107px;">A-11077</td>
			<td style="width:148px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">70 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td style="width:107px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:107px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">2.5% Trypsin</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, Heat Shock Treated</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:107px;">BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">CD31 rat anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:107px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:107px;">553370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Chick Serum</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">16110-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">17104-019</td>
			<td>Prepared according to manufactuer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">DNase I, RNase free (10,000 Units)</td>
			<td style="width:107px;">Roche</td>
			<td style="width:107px;">4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">EBM-2</td>
			<td style="width:107px;">Lonza</td>
			<td style="width:107px;">CC3156</td>
			<td>For VEC media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">EDTA, 0.5M Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Hoefer</td>
			<td style="width:107px;">03-500-506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">EGM2 SingleQuot, Bulletkit</td>
			<td style="width:107px;">Lonza</td>
			<td style="width:107px;">CC-4176</td>
			<td>For VEC media</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated</td>
			<td style="width:107px;">Hyclone</td>
			<td style="width:107px;">SH3007103IH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:107px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Horse Serum</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">16050-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Hybridization Oven</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">230301V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Medium 199 1X</td>
			<td style="width:107px;">Corning Cell gro</td>
			<td style="width:107px;">10-060-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Paraformaldehyde 16% Solution EM grade</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:107px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Pen/Strep</td>
			<td style="width:107px;">MP-Biomed</td>
			<td style="width:107px;">ICN1670049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Permanox sterile chamber slide with cover</td>
			<td style="width:107px;">Thermo-Scientific</td>
			<td style="width:107px;">177429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Phosphate-Buffered Saline, 1X</td>
			<td style="width:107px;">Corning Cell gro</td>
			<td style="width:107px;">21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">PrimeTime Mini qPCR Assay</td>
			<td style="width:107px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:107px;">Acta2 (&#945;SMA), GAPDH, Myh6, Myh7, POSTN, CD31, vWF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:107px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:107px;">4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">SuperScript VILO Mastermix</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">11755050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Tie2-GFP mice</td>
			<td style="width:107px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:107px;">3658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Tissue forceps #5 11cm</td>
			<td style="width:107px;">Dumont</td>
			<td style="width:107px;">14096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Trizol</td>
			<td style="width:107px;">Ambion</td>
			<td style="width:107px;">15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">&#945;-SMA anti-mouse antibody&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">A2547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:115px;">VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:107px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:107px;">H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine valve endothelial cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

Tie2-GFP hücreler embriyonik ve yetişkin kalp kapakçıkları endotel hücre belirteçleri ile birlikte lokalize. Embriyonik ve yetişkin farelerden VECs olarak Tie2-GFP özgünlüğünü teyit etmek üzere, imüno-E14.5 ve 3 aylık yetişkin Tie2-GFP hazırlanabilir doku kesitlerinde in endotel hücre markeri ile birlikte-lokalizasyonunu, CD31 belirlemek için yapılmıştır yöntemleri kullanarak farenin önce laboratuarımızda 16 tarafından yayınlandı. Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, eş-ifade VECs GFP (Şekil 1 A, B, E, F) hem de yetişkin ve CD31 (C, D, E, F, Şekil 1) (Şekil 1 B, D, F) ve embriyonik ( Bu nedenle takip eden VEC izolasyonu için bir model doğrulama Şekil 1 A, C, E) aşamaları,. FACS analizi Tie2-GFP farelerden izole embriyonik ve yetişkin kalp kapakçıkları belirgin GFP pozitif ve GFP-negatif hücre popülasyonları tespit. Vahşi tile tipi C57 / BL6 farenin GFP parametrelerini ayarlamak için kullanılır ve Tie2 GFP farelerden tek kapılanmış hücrelerin yaklaşık olarak% 2 (Şekil 2), embriyonik ve yetişkin örneklerinde hem de FACS analizi ile, GFP-pozitif hücrelerindeki zenginleştirme göstermektedir. Şekil 1 &#39;de gösterilen ko-lokalizasyon çalışmaları dayalı olarak, bu hücreler, VECs olarak kabul edilir ve 61.800 toplam hücrelerin ortalama verim erişkin numuneler (n = 3) ve 8928 hücreleri (8,015- (Örnekler 39,000-77,000 hücre / örnek civarında olmak üzere) 11.000 hücreleri E14.5 embriyoların bir aileden gelen / çöp). PCR analizi, Tie2, GFP farelerden izole edilen GFP-negatif hücrelerinde GFP-pozitif hücrelerin ve valf interstisyel hücre markörleri endotel hücresi belirleyicilerinin zenginleştirme doğrulamaktadır. QPCR şu FACS GFP pozitif ve negatif hücre popülasyonlarının gen ekspresyon analizleri farklı moleküler profillerini göstermektedir. Tie2-GFP embriyolar ve Adul izole GFP negatif hücre popülasyonları ile karşılaştırıldığındats GFP pozitif hücreler, endotelyal hücre işaretleyicileri CD31 ve vWF, (Şekil 3) ifadesi için zenginleştirilmiştir. Bundan başka, bu hücre popülasyonunda miyosit belirteçleri (Myh6, MYH7) ekspresyonu olmayan endotel hücrelerinin az kirlenme gösteren, çok düşüktür. Buna karşılık olarak, yetişkin Tie2-GFP farelerden ve E14.5 embriyolardan izole GFP negatif hücrelerin valf interstisyel hücreli (VIC) &#39;belirteçleri, GFP&#39;ye α-sma ve periostin (POSTN) nispeten pozitif hücreler açısından zenginleştirilmiş olan. Bu işaretlerin zenginleştirilmesi bağlı olarak yetişkin kurban durgun fenotipi ve aktif belirteçler bu nedenle de düşük ekspresyonu için, yetişkinler ile karşılaştırıldığında E14.5 örneklerden izole GFP negatif hücrelerde daha yüksektir. Tie2 GFP erişkin farelerden izole edilen GFP-pozitif hücreler, in vitro kültür edilebilir. Anahtar örneklerinden izole kültür GFP pozitif ve GFP negatif hücrelerin yeteneği, taban incelendihücre morfolojisi ve immünohistokimyasal boyama üzerinde d. Daha önce GFP pozitif hücreler, iki hafta kültür içinde (Şekil 4C) sonra endotel hücre işaretleyici CD31 ile morfolojisi (Şekil 4A) olarak yuvarlak ve birlikte-ifade GFP ortaya çıktığı Şekil 4&#39;te gösterilir bize 17 tarafından tarif edilmiş protokolleri kullanılarak. Bunun aksine olmayan endotel hücreleri dokuz gün (Şekil 4D) sonra VIC işaretleyici α-SMA mezenkimal benzeri morfoloji gösterir (Şekil 4B) ve görüntülemek ifade GFP için negatiftir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig1highres.jpg" width="400" /> Şekil 1. Tie2-GFP pozitif hücreler, embriyonik ve yetişkin kalp kapakçıklarında CD31 ile ko-lokalize. Immünofloresan endotelyal hücre belirteci ile (Tie2-) GFP tanımının ilişki (A, B) göstermek üzere, CD31 (C, D) olarak larE14.5 (A, C, E) ve yetişkin de mitral kapak eptal bildiriler (B, D, F) aşamaları. Vana bölgesinde A vurgulanır, C, E. (E, F) Birleştirilmiş&#39;i görüntüleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51860/51860fig1highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig2highres.jpg" width="500" /> Şekil 2. Tie2-GFP pozitif VECs FACS ile tespit edilebilir. Yaşa göre eşleştirilmiş C57 / BL6 kontroller (A, C) ile karşılaştırıldığında, Tie2 GFP embriyolar (B) ve yetişkin (D) &#39;den izole edilen valfler içeren ayrı bir GFP Yeşil gösterildiği gibi pozitif bir hücre popülasyonu. Kırmızı gösterilen GFP-negatif olaylar, bir kontrol olarak toplanmıştır. (B) ve (D) &#39;de sayılar GFP p ortalama% göstermektedirFACS sıralama kriteri olayların toplam sayıdan ositive hücreleri (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51860/51860fig2highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig3highres.jpg" width="500" /> GFP-negatif hücreler valf interstitial hücrelerin ile ilişkide bulunan genleri ifade ise Şekil 3. GFP pozitif hücreler endotel hücre işaretleyicileri için zenginleştirilmiştir. Endotel hücre işaretleyicileri (CD31, Von Willebrand Faktörü (vWF) ile birleşmesi) ve yetişkin (Myh6) ve fetal Temsilcisi QPCR ( MYH7) E14.5 (A) ve yetişkin (B kapak bölgelerinden elde edilmiş olan GFP-pozitif hücrelerindeki miyosit işaretleri) Tie2-GFP uygulanan farelerden. Endotel hücre belirteçleri ve miyositlerdeki ilişkili genlerin çok düşük düzeylerde Not zenginleştirme. (C, D) cha Foldvana interstisyel hücre belirteçlerinin ifadesinde nges α-SMA E14.5 (C) ve yetişkin (D) Tıe2-GFP farelerden izole GFP-negatif hücrelerin ve POSTN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51860/51860fig3highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig4highres.jpg" width="500" /> Şekil 4. Tie2-GFP pozitif hücreler, in vitro endotel hücresi belirleyicilerinin sentezlemenin muhafaza edilmesi. Ardından FACS, GFP pozitif (A, C) ve negatif (B, D) görüntüleme kontrast faz akışa kadar kültürlendi ve Denekler, erişkin farelerden hücre popülasyonları (A, B) ve floresan immüno-(C, D). GFP-pozitif hücreler CD31 sonra (kırmızı) (C) ekspreseKültür 10 gün. Bunun tersine GFP ifade α-SMA, aktive kurban (D) bir marker için pozitif boyandı, negatif hücre popülasyonu, bulgulanmamıştır.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Valve Endothelial Cells at JoVE.com

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Murin Vana Endotel Hücreleri İzolasyon

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

isolation-of-murine-valve-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K Görüntüleme.  The Ohio State University. The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Video: Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

İnsan umbilikal ven endotel hücreleri İzolasyon (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Biyoloji

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

Kapak Endotel Hücreleri İzolasyon

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Yenidoğan Fareler Pulmoner Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

Embriyonik Ventriküler Endotel Hücre İzolasyonu

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

Fare Koroner Endotel Hücreleri İzolasyon

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) play an important role in the calcification process in aortic stenosis through the activation of their dedifferentiation program to osteoblast-like cells. Mouse VICs are a good in vitro tool for the elucidation of the signaling pathways driving the mineralization of the aortic valve cell. The method described herein, successfully used by these authors, explains how to obtain freshly isolated cells. A two-step collagenase procedure was performed with 1 mg/mL and 4.5 mg/mL. The first step is crucial to remove the endothelial cell layer and avoid any contamination. The second collagenase incubation is to facilitate the migration of VICs from the tissue to the plate. In addition, an immunofluorescence staining procedure for the phenotype characterization of the isolated mouse valve cells is discussed. Furthermore, the calcification assay was performed in vitro by using the calcium reagent measurement procedure and alizarin red staining. The use of mouse valve cell primary culture is essential for testing new pharmacological targets to inhibit cell mineralization in vitro.

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

This article describes the isolation of mouse aortic valve cells by a two-step collagenase procedure. Isolated mouse valve cells are important for performing different assays, such as this in vitro calcification assay, and for investigating the molecular pathways leading to aortic valve mineralization.

Aort Kapak In Vitro Kalsifikasyonu Çalışmak için Fare Interstisyel Kapak Hücrelerinin İzolasyonu

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...

Isolation of Human Primary Valve Cells for In vitro Disease Modeling

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve causes aortic stenosis and contributes to heart failure and stroke. Disease pathogenesis is multifactorial, and stresses such as inflammation, extracellular matrix remodeling, turbulent flow, and mechanical stress and strain contribute to the osteogenic differentiation of valve endothelial and valve interstitial cells. However, the precise initiating factors that drive the osteogenic transition of a healthy cell into a calcifying cell are not fully defined. Further, the only current therapy for CAVD-induced aortic stenosis is aortic valve replacement, whereby the native valve is removed (surgical aortic valve replacement, SAVR) or a fully collapsible replacement valve is inserted via a catheter (transcatheter aortic valve replacement, TAVR). These surgical procedures come at a high cost and with serious risks; thus, identifying novel therapeutic targets for drug discovery is imperative. To that end, the present study develops a workflow where surgically removed tissues from patients and donor cadaver tissues are used to create patient-specific primary lines of valvular cells for in vitro disease modeling. This protocol introduces the utilization of a cold storage solution, commonly utilized in organ transplant, to reduce the damage caused by the often-lengthy procurement time between tissue excision and laboratory processing with the benefit of greatly stabilizing cells of the excised tissue. The results of the present study demonstrate that isolated valve cells retain their proliferative capacity and endothelial and interstitial phenotypes in culture upwards of several days after valve removal from the donor. Using these materials allows for the collection of control and CAVD cells, from which both control and disease cell lines are established.

This protocol describes the collection of human aortic valves extracted during surgical aortic valve replacement procedures or from cadaveric tissue, and the subsequent isolation, expansion, and characterization of patient specific primary valve endothelial and interstitial cells. Included are important details regarding the processes needed to ensure cell viability and phenotype specificity.

In vitro Hastalık Modellemesi için İnsan Primer Kapak Hücrelerinin İzolasyonu

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

Fare primer karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Murin Dermal Lenfatik Kılcal Damarlardan Endotel Hücrelerinin İzole Edilmesi

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic endothelial cells is an important process for lymphatic research, as it allows the performance of in vitro and biochemical experiments on the isolated cells. Moreover, the development of Cre-lox technology has enabled the tissue-specific deficiency of genes that cannot be globally targeted, leading to the precise determination of their role in the studied tissues. The dissection of the role of certain genes in lymphatic physiology and pathophysiology requires the use of lymphatic-specific promoters, and thus, the experimental verification of the expression levels of the targeted genes.
Methods for efficient isolation of lymphatic endothelial cells from wild-type or transgenic mice enable the use of ex vivo and in vitro assays to study the mechanisms regulating the lymphatic functions and the identification of the expression levels of the studied proteins. We have developed, standardized and present a protocol for the efficient isolation of murine dermal lymphatic endothelial cells (DLECs) via magnetic bead purification based on LYVE-1 expression. The protocol outlined aims to equip researchers with a tool to further understand and elucidate important players of lymphatic endothelial cell functions, especially in facilities where fluorescence-activated cell sorting equipment is not available.

Yazar Spotlight: Murin Dermal Lenfatik Endotel Hücrelerinin Manyetik Boncuk Tabanlı İzolasyonu

This paper describes a method for magnetic bead-based isolation of murine endothelial cells from dermal lymphatic capillaries. The isolated lymphatic endothelial cells can be used for downstream in vitro experiments and protein expression analysis.

Murin Dermal Lenfatik Endotel Hücre İzolasyonu

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic ...