وأيد هذا العمل من R01 DK078161 NIDDK (LO) ، زمالات ما بعد الدكتوراه من جمعية القلب الاميركية (AB) ، وأسس Wenner - جرين السويد وKungliga Fysiografiska Sällskapet ، لوند ، السويد (UB). وقدم دعم إضافي من قبل مركز أبحاث مين المعدات الطبية الأساسية معهد التشريح ، وعلم تكنولوجيا المعلومات الحيوي FACS (بدعم من 06 - 2P20RR18789) ومرفق MMCRI الحيوان.

1. إعداد الكواشف لهضم الكلى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سوف 1.5 مل من كولاجيناز 0.25 ٪ ستكون هناك حاجة إلى (ث / ت) و 1 حل بنكرياتين هضم (ث / V) ٪ لاستخراج الخلايا الكلوية منطقة (NZCs) في الفترة من 8 E17.5 الكلى. بنكرياتين لأن يأخذ حوالي 2 ساعة ليحل في درجة حرارة الغرفة ، وهضم ما يكفي من حل لأكبر عدد من الكليتين الجنينية المتوقعة ينبغي أن تكون المقدمة قبل التجربة. إعداد خلاصة الحل بإضافة أول 25 ملغ من كولاجيناز ألف إلى 10 مل Dulbecco الفوسفات في التخزين المؤقت المالحة (DPBS) بشكل واضح 15 مل ، أنبوب الطرد المركزي العقيمة. فمن الأهمية بمكان أن DPBS لا تحتوي على الكالسيوم أو المغنيسيوم لأن هذا سوف تتداخل مع هضم الأنزيمية. مزيج حل على nutator لمدة 10 دقائق لإذابة كولاجيناز A. إضافة 100 ملغ من بنكرياتين كولاجيناز إلى حل أي حل وعلى مزيج nutator ما لا يقل عن 2 ساعة. بدلا من ذلك ، يمكن أن تكون مختلطة كولاجيناز A / حل هضم بنكرياتين على nutator بين عشية وضحاها في 4 ° C. ويوصى بأن عليك ارتداء قناع ، كما كولاجيناز ألف وبنكرياتين تفريق بسهولة في الجو خلال وزنها ويمكن أن تهيج الممرات الأنفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الجنين مصل الأبقار 5 ٪ (FBS) (V / V) في محلول هانك حل لتحلية التخزين المؤقت (HBSS). عكس إلى المزيج. وسوف 1 مل لكل أنبوب من 8 الكلى يكون ضروريا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير مستنبت من خلال استكمال خلية كيراتينية المتوسطة مجانا المصل مع الجلوتامين 1 ٪ (V / V) و 1 ٪ البنسلين ، الستربتوميسين (PenStrep) (V / V). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف العقيمة البوليسترين لوحات مسطحة القاع زراعة الأنسجة (96 ، 48 ، 24 أو 6 أيضا) مع الحل فبرونيكتين الإنسان بتركيز 5 ملغ لكل سم 2 من سطح النمو. هو معلق 5 ملغ من مسحوق فبرونيكتين في 5 مل من العقيمة O. 2 H هذا هو المخفف في 1:25 DPBS عقيمة بدون المغنيسيوم والكالسيوم أو 250 مل يضاف إلى كل بئر من 24 لوحة جيدا. والمحتضنة لوحات ثم بمحلول فبرونيكتين في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة يليها 1 ساعة بمعدل 4 درجة مئوية بدلا من ذلك ، يمكن المحتضنة لوحات بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية ثم يستنشق هو الحل في التدفق الصفحي هود قبل إضافة متوسطة / الخلايا. </li></ol> 2. تشريح الكلى وإزالة كبسولات (حرر في درجة حرارة الغرفة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في E17.5 والتضحية الأم باستخدام إجراء التي وافقت عليها رعاية الحيوان المؤسسية الخاص ولجنة استخدام وإزالة الرحم ، ووضعه في طبق بتري تحتوي DPBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم. تشريح تحت المجهر ، واستخدام الملقط الساعات &quot;لإزالة كل الجنين من الرحم وقطع رأس كل جنين. مرة واحدة في القمامة بالكامل خارج الرحم ونقل الأجنة إلى طبق بتري تحتوي DPBS نظيفة بما فيه الكفاية مع الكالسيوم والمغنيسيوم لتغطي كامل الأجنة تاركة وراءها الكثير من الدماء والأنسجة والحطام ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الملقط ، وجعل شق كفافي في جدار البطن للجنين على مستوى السرة. ثم ضع الجنين على ظهرها ، دبوس عليه في الكتفين مع مجموعة واحدة من الملقط ، وإزالة الأحشاء الداخلية من الرئتين الى المثانة باستخدام مجموعة أخرى من الملقط. يمكن مع الممارسة أن يتم ذلك في اقتراح واحد. يجب أن يرفق الكلى إلى الجزء الخلفي من كتلة الأجهزة. إذا لا تزال تعلق الكلى لأجهزة ينتزع منه ، ويمكن إزالتها بعناية من جدار الجسم الظهرية. يجب التخلص من الكلى التي تضررت خلال هذه العملية تشريح لأنها سوف يلوث ثقافة النهائي مع أنواع الخلايا غير لائقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ندف بلطف بعيدا الكلى من بقية الأجهزة ، مع الحرص على الحفاظ على الكلى متصلة مع بعضها البعض. عقد بين أنسجة الكلى مع مجموعة واحدة من الملقط وانتزاع الغدة الكظرية المرفقة إلى واحدة من الكليتين مع ملقط الأخرى. يجب أن يرفق الغدة الكظرية للكبسولة الكلى. بلطف قشر الغدة الكظرية ، وبعيدا عن كبسولة حول خارج الكلية ، على غرار تقشير الموز. الحرص على عدم تقسيم الكلى في النصف بينما تقشير ، وتأكد من عدم تلف نسيج الكلى تحت الكبسولة. إزالة بعناية أي كبسولة المتبقية وكذلك الحالب إذا لا تزال تعلق عليه. مع تكرار الكلى المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الماصة نقل قطع لوضع الكلى في أنبوب البوليسترين 5 مل من HBSS. كرر الخطوات من 2،2-2،4 لكل الجنين. ويمكن تجميع الكلى بنسبة 8 في الأنبوب. ومع إزالة الممارسة ، تشريح وكبسولة تأخذ 2-3 دقائق لكل الجنين. </li></ol> 3. الأنزيمية الهضم الكلى (جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ما لم يرد خلاف ذلك) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة حل HBSS من 5 مل تحتوي على أنابيب الكلى مع pipettor بعناية مع تجنب الاتصال مع الكليتين. إضافة 1.5 مل من الفور كولاجيناز A / حل هضم بنكرياتين إلى أنبوب 5 مل تحتوي على الكلى قبل ان ينتقل الى العينة المقبل. كرر لكل أنبوب من الكليتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب مكان مع انزيم / الكلى على هضم nutator في مرحلة ما قبل حرارة 37 درجة مئوية الحاضنة لمدة 15 دقيقة. 2 دقائق قبلالانتهاء من هضم ، إضافة 3 ميكرولتر من الدناز (1 يو / مل) إلى واحد الطازجة 5 مل أنبوب البوليسترين لكل هضم يتم تنفيذها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بسرعة هضم من الحاضنة ، إضافة 75 ميكرولتر من FBS وعكس 3 مرات لخلط. دعونا نقف على مقاعد البدلاء لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 1.4 مل من التعليق الخلية في أنبوب البوليسترين 5 مل تحتوي على الدناز (1 يو / مل) بينما يترك الخلايا المتبقية 0.2 مل تعليق والكلى وراءهم. غادر اضافية 0.2 مل من وراء حل وسوف تحتوي على شوائب مثل المصفوفة خارج الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج تعليق خلية / الدناز على nutator في مرحلة ما قبل 37 درجة مئوية درجة حرارة الحاضنة لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة تعليق بسرعة من خلية الحاضنة ونقلها إلى كل أنبوب 1.5 مل إيبندورف. تدور تعليق خلية في microfuge في 325 جرام لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاف من إزالة الخلايا وبيليه بيليه resuspend في 1 مل من 5 ٪ FBS / HBSS ، pipetting صعودا وهبوطا 5 إلى 6 مرات. سقف كل أنبوب قبل الانتقال إلى نموذج المقبل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور تعليق خلية في microcentrifuge في 325 جرام لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاف إزالة وإضافة 0.5 مل من مصل المتوسطة خلية كيراتينية مجانا (KSFM) مع الإضافات إلى كل أنبوب وأنبوب قبعة قبل الانتقال إلى نموذج المقبل. بعد تمت إضافة المتوسطة لجميع الأنابيب ، resuspend بلطف بيليه كل خلية pipetting صعودا وهبوطا 5 إلى 6 مرات مع micropipette 1ml. الجمع بين كل خلية في تعليق الطازجة 5 مل أنبوب البوليسترين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل 40 ميكرون الرطب two الخلية مصفاة القبعات وضعت على البوليسترين 5 مل أنبوب أسفل مستديرة مع KSFM لكل عينة. تمرير تعليق خلية خلية واحدة من خلال رسملة مصفاة من خلال نقل مع micropipette 1 مل. تجنب لمس تصفية مع طرف ماصة. التدفق من خلال جمع وتكرار الترشيح من خلال رسملة مصفاة ثانية. إزالة الغطاء مصفاة الخلية واستبدالها مع غطاء جديد من الطبيعي 5 مل أنبوب البوليسترين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدد الخلايا مع الخلايا الاخرى عدادة الكريات أو عد خلايا الجهاز ونقلها إلى آبار لوحة الثقافة المغلفة فبرونيكتين في كثافة 100،000-200،000 الخلايا لكل سم 2 ، كما هو مطلوب مع تمييع KSFM مع الإضافات. عموما ، فإننا استرداد حوالي 4.5x10 6 خلايا الجنين في القمامة 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا في الحاضنة 37 درجة مئوية مع مرطب 5 ٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسمح للخلايا لاسترداد وإرفاق لمدة 2-4 ساعات في المتوسط ​​قبل التحفيز مع الكواشف إضافية. تحفيز الخلايا مع مجمع الفائدة : 1 إلى 48 ساعة. تنقية الحمض النووي الريبي لتحليل PCR باستخدام RNeasy Qiagen مايكرو مجموعة باتباع إرشادات الشركة المصنعة أو اتبع التعليمات التالية لimmunostain fluorescently الخلايا. </li></ol> 4. إعداد الكواشف لتثبيت للخلايا وImmunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد PFA 4 ٪ : ذوب بارافورمالدهيد 4 ٪ في برنامج تلفزيوني (V / V) عند درجة حرارة 55 مئوية مع الانفعالات العادية. تبرد لدرجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. هذا الحل هو السامة ويجب التخلص من النفايات في حاويات المعينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل permeabilization بإضافة تريتون X - 100 لبرنامج تلفزيوني للحصول على حل 0.3 ٪ (V / V). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول 5 ٪ حظر في برنامج تلفزيوني مع المصل من الأنواع نفسها التي كانت تستخدم لرفع مستوى الأجسام المضادة الثانوية لاستخدامها. على سبيل المثال ، إذا كنت سوف الكشف عن الأجسام المضادة ضد المستضد الأرانب التي تستهدفها مع حمار المضادة للأرنب اليكسا فلور 568 ، يعد حل حظر تحتوي على 5 ٪ المصل حمار. المحل في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد الحل الأساسي الضد بإضافة تركيز مناسب من الأضداد إلى 5 ٪ حل حظر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الثانوية حل الضد مباشرة قبل الاستعمال. إضافة الضد fluorophore مترافق في تركيز الشركة المصنعة أوصت مع دابي ملون مباين النووية وغيرها من علامات عضية مثل phalloidin إلى محلول 5 ٪ حظر. إذا كان المطلوب التخزين ، والحفاظ على الحل في الظلام عند 4 درجات مئوية حتى استخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير الجلسرين 50 ٪ / حل PBS (V / V) لتخزين الخلايا immunostained. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام Vectashield. </li></ol> 5. تثبيت للخلايا وImmunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويهدف البروتوكول التالية لتثبيت وتلون NZCs في 24 لوحة جيدا. نظرا لأحجام وبئر واحدة. وينبغي الكواشف pipetted بلطف خلال جميع الخطوات لتجنب مفرزة من الخلايا ، وغير مستحسن لوحة التحريض في الخطوات الحضانة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بلطف المتوسطة مع micropipette 1 مل وإضافة 0.5 مل من 4 ٪ إلى PFA الخلايا المستزرعة المرفقة. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة دون عائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 4 ٪ PFA وإضافة 0.5 مل من محلول لكل بئر permeabilization. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة حل permeabilization والشطف بلطف مرتين مع 0.5 مل من برنامج تلفزيوني في الشطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5 مل من عرقلة الحل ، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحل إزالة الحجب وإضافة 0.225 مل حل الضد الابتدائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأجسام المضادة والحل الأساسي ري بلطفNSE مرتين مع 0.5 مل من برنامج تلفزيوني في الشطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.225 مل حل الضد الثانوية. احتضان لوحة في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأجسام المضادة الثانوية حل والشطف بلطف مرتين مع 0.5 مل من برنامج تلفزيوني في الشطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.3 مل من 50 ٪ الجلسرين / PBS الحل (V / V) أو Vectashield بما يكفي لتغطية الجزء السفلي من السطح جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا ملفوفة مع صورة المجهر epifluorescence أو تخزينها في احباط في 4 درجات مئوية. </li></ol> 6. ممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/2555/2555fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. وتنقيته من NZCs E17.5 الأجنة ، مطلي في الخلايا لكل 200000 سم 2 والمحتضنة في 37 درجة مئوية ليصبح المجموع 24 ساعة. وعلى النقيض من تصوير الخلايا المرحلة مع الاتحاد الدولي للرجبي لايكا المجهر المقلوب DM قبل تلوين مناعي. (أ) على النقيض من المرحلة 20X عرض NZCs بعد 24 ساعة في الثقافة. (ب) كانت ثابتة والملون باستخدام خلايا الأرنب مكافحة PAX2 الأجسام المضادة لخلايا محددة السلف نفرون (الحمراء) ، وثانوية اليكسا فلور 568 مترافق حمار المضادة أرنب. لاحظ نوى الزرقاء counterstained مع دابي. (C) على النقيض من المرحلة 40X عرض مجموعة من الأسلاف نفرون (متوسط) بعد 24 ساعة في الثقافة. (D) وأعرب عن صورة 40X من NZCs المعزولة من أجنة LacZ + من سلالة LacZ Foxd1 ، الذي يعبر عن β - غالاكتوزيداز تحت سيطرة المروج Foxd1. Foxd1 السكان في انسجة الخلايا داخل المنطقة كلوي في الكلى النامية. تم صبغ الخلايا التي تحتوي على علامة phalloidin F - الأكتين (أوريغون الخضراء الابتدائية المتقارن) ، وصمة عار دابي النووية (الأزرق) والمضادة للأرنب β - غالاكتوزيداز (الثانوي -- اليكسا فلور حمار المضادة للأرنب 568) للكشف عن خلايا انسجة Foxd1 + ( الحمراء).

<ol>
	<li>Blank, U., Brown, A., Adams, D. C., Karolak, M. J., Oxburgh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP7+promotes+proliferation+of+nephron+progenitor+cells+via+a+JNK-dependent+mechanism.">BMP7 promotes proliferation of nephron progenitor cells via a JNK-dependent mechanism.</a> Development. 136, 3557-3566 (2009).</li><li>Brunskill, E. W., Aronow, B. J., Georgas, K., Rumballe, B., Valerius, M. T., Aronow, J., Kaimal, V., Jegga, A. G., Grimmond, S., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+gene+expression+in+the+developing+kidney+at+microanatomic+resolution.">Atlas of gene expression in the developing kidney at microanatomic resolution.</a> Developmental Cell. 15, 781-791 (2008).</li><li>Godin, R. E., Takaesu, N. T., Robertson, E. J., Dudley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+BMP7+expression+during+kidney+development.">Regulation of BMP7 expression during kidney development.</a> Development. 125, 3473-3482 (1998).</li><li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inductive+epitheliomesenchymal+interaction+in+cultured+organ+rudiments+of+the+mouse.">Inductive epitheliomesenchymal interaction in cultured organ rudiments of the mouse.</a> Science. 118, 52-55 (1953).</li><li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenetic+interaction+between+embryonic+mouse+tissues+separated+by+a+membrane+filter.">Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter.</a> Nature. 172, 869-870 (1953).</li><li>Hatini, V., Huh, S. O., Herzlinger, D., Soares, V. C., Lai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+stromal+mesenchyme+in+kidney+morphogenesis+revealed+by+targeted+disruption+of+Winged+Helix+transcription+factor+BF-2.">Essential role of stromal mesenchyme in kidney morphogenesis revealed by targeted disruption of Winged Helix transcription factor BF-2.</a> Genes and Development. 10, 1467-1478 (1996).</li><li>Oxburgh, L., Chu, G. C., Michael, S. K., Robertson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFb+superfamily+signals+are+required+for+morphogenesis+of+the+kidney+mesenchyme+progenitor+population.">TGFb superfamily signals are required for morphogenesis of the kidney mesenchyme progenitor population.</a> Development. 131, 4593-4605 (2004).</li><li>Srinivas, S., Watanabe, T., Lin, C. S., William, C. M., Tanabe, Y., Jessell, T. M., Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1, 4-4 (2001).</li><li>Yu, J., Carroll, T. J., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+proliferation+and+differentiation+of+mesenchymal+cells+in+the+mouse+metanephric+kidney.">Sonic hedgehog regulates proliferation and differentiation of mesenchymal cells in the mouse metanephric kidney.</a> Development. 129, 5301-5312 (2002).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

في هذا البروتوكول وصفنا أسلوبا لعزل الخلايا والثقافة من منطقة كلوي في الكلى الجنينية. هو تطوير وسيلة نشر في البداية كجزء من دراسة لآثار العلاج على خلايا BMP7 المنطقة كلوي (فارغ وآخرون ، 2009). في الدراسة الأولية ، وأجريت سلسلة من التجارب لتحديد خصائص أنواع الخلايا مم...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Watchmaker&#x2019;s forceps #5</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-4905</td>
<td>2 pairs required</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagenase A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>10 103 578 001</td>
<td>Wear mask</td>
</tr>
<tr>
<td>Porcine Pancreatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P8096</td>
<td>Wear mask</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS w/ Ca, Mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-513F</td>
<td>With Mg &amp; Ca</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioWhittaker</td>
<td>14-901E</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14175</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KSFM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>10724-011</td>
<td>without added growth factors</td>
</tr>
<tr>
<td>L-Glutamine 200mM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7513</td>
<td>Use @ 1% v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4333</td>
<td>Use @ 1% v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Fibronectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>356008</td>
<td>Supplied as powder</td>
</tr>
<tr>
<td>24 well culture plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific </td>
<td>142485</td>
<td>Nunclon</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS w/o Mg &amp; Ca</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-512F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5mL polystyrene tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>352235</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNase (1 U/&mu;l)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18068-015</td>
<td>4 &mu;l per 1.5 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>40 micron cell-strainer </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>352235</td>
<td>w/cap and tube</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>Use @ 4 % w/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>VW3929-2</td>
<td>Use @ 0.3 % v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P3813</td>
<td>Supplied as powder</td>
</tr>
<tr>
<td>Donkey serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>017-000-121</td>
<td> Use @ 5 % v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Rabbit anti-PAX2 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>71-6000</td>
<td>Dilute 1:100</td>
</tr>
<tr>
<td>Rabbit anti-&beta;-gal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedicals</td>
<td>559762</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>Oregon Green 488 phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>O7466</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A10042</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>DAPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D1306</td>
<td>Dilute 1:5000</td>
</tr>
<tr>
<td>Vectashield</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>GX0185-6</td>
<td>Mix 50 % with H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>RNeasy Micro Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>74004</td>
<td>Use "DNase on column" protocol</td>
</tr>
<tr>
<td>Transfer pipettes, 3ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>357575</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and culture of cells from the nephrogenic zone of the embryonic mouse kidney

وقد تم التطور الجنيني في الكلى درس على نطاق واسع على حد سواء باعتبارها نموذجا للتفاعل الظهارية - الوسيطة في organogenesis واكتساب فهم أصول أمراض الكلى الخلقية. في الآونة الأخيرة ، وقد تم دراسة إمكانية توجيه الخلايا الجذعية الجنينية من السذاجة تجاه مصائر كلوي الناشئة في مجال الطب التجديدي. وقد حددت الدراسات الجينية في الماوس عدة مسارات اللازمة للتنمية في الكلى ، وفهرس عالمي للنسخ الجيني في الجهاز وقد تم مؤخرا إنشاء <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a> ، وتوفير العديد من المنظمين مرشح للوظائف التنموية الأساسية. يمكن دراستها Organogenesis في الكلى القوارض في الثقافة الجهاز ، والعديد من التقارير قد استخدمت هذا الأسلوب لتحليل نتائج تطبيق إما بروتينات مرشح أو اسقاط التعبير عن الجينات باستخدام مرشح أو morpholinos سيرنا. ومع ذلك ، يقتصر تطبيق ثقافة الجهاز لدراسة الإشارات التي تنظم الجذعية / تمايز الخلايا السلف مقابل التجديد في الكلى كما تحتوي على أجهزة مثقف ميثاقا نشر المصفوفة خارج الخلية التي تحد من الجزيئات والجسيمات الفيروس. لدراسة الخلية إشارات الأحداث التي تؤثر على الساق / السلف الخلية المتخصصة في الكلى وضعنا نظام الخلية الأساسية التي تحدد منطقة كلوي أو السلف المتخصصة خلية من خلايا الجسم الحي الكلى السابقين النامية بمعزل عن محفز الظهارية للتمايز. باستخدام الهضم الأنزيمي محدودة ، يمكن الخلايا الكلوية منطقة تتحرر بشكل انتقائي من البلدان النامية في الكلى E17.5. بعد الترشيح ، يمكن هذه الخلايا مثقف بوصفه أحادي الطبقة غير النظامية به الظروف الأمثل. علامة تحليل الجينات يدل على أن هذه الثقافات تحتوي على توزيع أنواع الخلايا المميزة للمنطقة كلوي في الجسم الحي ، وأنها تحافظ على التعبير الجيني علامة المناسبة خلال الفترة الثقافة. هذه الخلايا هي سهلة الوصول إلى جزيء صغير من البروتين والمؤتلف العلاج ، وأيضا الأهم لتنبيغ الفيروسية ، مما يسهل كثيرا من دراسة الجذعية / آثار السلف مرشح منظم الخلية. يمكن المعلمات الخلية الأساسية البيولوجية مثل الانتشار النووي وموت الخلية ، وكذلك التغيرات في التعبير عن علامات مميزة الجزيئية للخلايا الجذعية / السلف نفرون في الجسم الحي واستخدمت بنجاح النتائج التجريبية. العمل الجاري في مختبرنا باستخدام هذه الرواية تقنية الخلية الأولية تهدف إلى الكشف عن الآليات الأساسية التي تحكم تنظيم التجديد الذاتي مقابل التمايز في الخلايا الجذعية / نفرون السلف.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney at JoVE.com

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

نحن في هذا التقرير وصفا لطريقة لعزل وثقافة السلف المتخصصة الخلية من الكلى الماوس الجنينية التي يمكن استخدامها لدراسة مسارات الإشارات التي تنظم الجذعية / السلف خلايا الكلى النامية. هذه الخلايا المستزرعة متاحة للغاية لجزيء صغير من البروتين والمؤتلف العلاج ، وأيضا الأهم لتنبيغ الفيروسي ، والذي يسمح للتلاعب كفاءة الممرات مرشح.

العزلة والثقافة في خلايا كلوية المنشأ من منطقة من الفأر الجنينية الكلى

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

isolation-culture-cells-from-nephrogenic-zone-embryonic-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

17.9K Views.  Maine Medical Center Research Institute. نحن في هذا التقرير وصفا لطريقة لعزل وثقافة السلف المتخصصة الخلية من الكلى الماوس الجنينية التي يمكن استخدامها لدراسة مسارات الإشارات التي تنظم الجذعية / السلف خلايا الكلى النامية. هذه الخلايا المستزرعة متاحة للغاية لجزيء صغير من البروتين والمؤتلف العلاج ، وأي?...

Video: Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

العزلة واشتقاق خلايا الفأر الجنينية بيرشوت

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of endocardium surrounded by myocardium. The myocardium secretes cardiac jelly, a hyaluronan-rich gelatinous matrix, into the atrioventricular (AV) junction and outflow tract (OFT) lumen. At stage HH14 valvulogenesis begins when a subset of endocardial cells receive signals from the myocardium, undergo endocardial to mesenchymal transformation (EMT), and invade the cardiac jelly. At stage HH25 the valvular cushions are fully mesenchymalized, and it is this mesenchyme that eventually forms the valvular and septal apparatus of the heart. Understanding the mechanisms that initiate and modulate the process of EMT and cell differentiation are important because of their connection to serious congenital heart defects. In this study we present methods to isolate pre-EMT endocardial and post-EMT mesenchymal cells, which are the two different cell phenotypes of the prevalvular cushion. Pre-EMT endocardial cells can be cultured with or without the myocardium. Post-EMT AV cushion mesenchymal cells can be cultured inside mechanically constrained or stress-free collagen gels. These 3D in vitro models mimic key valvular morphogenic events and are useful for deconstructing the mechanisms of early and late stage valvulogenesis.

This article will provide a method for isolating and culturing quail or chicken HH14- valve endocardial cells and HH25 valve cushion mesenchymal cells.

العزلة وثقافة الطيور الجنينية الخلايا الاصلية صمامي

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

عزل الخلايا الجذعية من شبكية العين بالعين ماوس

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

جيل من الفئران المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

العزلة وثقافة الأسنان طلائي الخلايا الجذعية من الكبار ماوس القاطعة

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

عزل بروتين من الفأر الجنينية القلب صمام منطقة نامية

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

العزلة والثقافة الابتدائية من خلايا الفأر الأورطي غشائي

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

حقن الخلية الداخلية عبر كتلة من الخلايا الجذعية الجنينية يؤدي إلى ارتفاع في أسعار تشيميريسم

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

العزلة المتزامنة وثقافة Myocytes الأذينية، myocytes البطينية، وغير Myocytes من قلب فأرة البالغين

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of the cells. These adjustments are critical to eukaryotic cell survivability and &#39;damage control&#39; during fluctuating nutrient and salinity levels, temperature, and various chemical and radiation stresses. Due to the highly dynamic nature of the RNA-level responses, and the instability of many of the RNA:RNA and RNA:protein intermediates, obtaining a meaningful snapshot of the cytoplasmic RNA state is only possible with a limited number of methods. Transcriptome-wide, RNA-seq-based ribosome profiling-type experiments are among the most informative sources of data for the control of translation. However, absence of a uniform RNA and RNA:protein intermediate stabilization can lead to different biases, particularly in the fast-paced cellular response pathways. In this article, we provide a detailed protocol of rapid fixation applicable to eukaryotic cells of different permeability, to aid in RNA and RNA:protein intermediate stabilization. We further provide examples of isolation of the stabilized RNA:protein complexes based on their co-sedimentation with ribosomal and poly(ribo)somal fractions. The separated stabilized material can be subsequently used as part of ribosome profiling-type experiments, such as in Translation Complex Profile sequencing (TCP-seq) approach and its derivatives. Versatility of the TCP-seq-style methods has now been demonstrated by the applications in a variety of organisms and cell types. The stabilized complexes can also be additionally affinity-purified and imaged using electron microscopy, separated into different poly(ribo)somal fractions and subjected to RNA sequencing, owing to the ease of the crosslink reversal. Therefore, methods based on snap-chilling and formaldehyde fixation, followed by the sedimentation-based or other type of RNA:protein complex enrichment, can be of particular interest in investigating finer details of rapid RNA:protein complex dynamics in live cells.

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

We present a technique to rapidly stabilize translational (protein biosynthesis) complexes with formaldehyde crosslinking in live yeast and mammalian cells. The approach enables dissecting transient intermediates and dynamic RNA:protein interactions. The crosslinked complexes can be used in multiple downstream applications such as in deep sequencing-based profiling methods, microscopy, and mass-spectrometry.

تثبيت سريع في Vivo وعزل المجمعات الترجمية من الخلايا Eukaryotic

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...