Yazarlar doku sepet hazırlanmasında Dr Lan Yi, New Jersey Kanser Enstitüsü, teknik yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Ulusal Sağlık Hibeler DK083425 ve DK070219 Enstitüleri tarafından finanse edildi.

1. PCR oluşturuldu Şablon digoxigenin-11-UTP Etiketli Spastine Özgü Riboprop Sentezi <ol><li> Gen-spesifik bir Spastine Özgü Riboprop sentezlemek için, cDNA referans gen sekansı (RefSeq) elde etmek için Entrez Gen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) kullanın . CDNA dizisinin 3&#39;-bölge karşı gen-spesifik PCR primerleri tasarım Primer3 programı (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) 5 kullanın. PCR primer seçimi için önerilen parametreler (http://www.gudmap.org/Research/Protocols/Vezina/Riboprobe_Syn.html) başka bir yerde tanımlanmıştır. </li><li> MegaBLAST Programı (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=10090) 6 seçilen DNA dizisi özgüllüğü değerlendirmek için kullanın. 0.01 BEKLEYEBILIRIM eşik kullanarak, DNA sekans spesifik olarak kabul edilir, diğer dizileri RefSeq veritabanı ile uyumlu değildir. </li><li> PCR Spastine Özgü Riboprop şablonu yükseltmek. PCR reaksiyonu bileşenleri ve thermocycling koşulları her astar kümesi için optimize edilmelidir. Tipik bir 50 ul reaksiyon içerir: 1X tampon, 2mm MgCl 2, 0.2mm dNTP, 1X Q çözümü, 1μg cDNA, 2.5U Taq DNA polimeraz, 0.25μm primerler ve nükleaz içermeyen H 2 O. Tipik bir thermocycling protokolü bir ilk denatürasyon 94 ° 2dk 30sn 40 çevrimleri ile 94 ° C için C, 57 ° C, 30 saniye için 72 ° C 1dk ve 10 dakika süreyle 72 ° C&#39;de son bir uzantısı içerir. CDNA PCR reaksiyonlarında kullanılan fare ürogenital mRNA sentezlenir. </li><li> PCR ürünü agaroz jel elektroforezi ile ayırın, Jel Ekstraksiyon kiti kullanılarak arındırmak ve saflaştırılmış ürünler spektrofotometri ile ölçmek. Beklenen verimi 1.2 - 3.6μg. </li><li> Etiketli Spastine Özgü Riboprop içine PCR ürünü Transcribe. Transkripsiyon reaksiyonu (40 ul) içerir: 400ng saflaştırılmış PCR ürünü, 1X digoxigenin 11-UTP, 1X transkripsiyon tampon, 5U RNaz inhibitörü, 80U T7 RNA polimeraz ve nükleaz içermeyen H 2 O. içeren nükleotid etiketleme karışımı Inkübe 3-4saat, 37 ° C ve ajitasyon örnekleri her 30 dk. </li><li> Sütun DNaz sindirim RNA temizleme talimatları dayalı riboprobes arındırmak için Qiagen RNEASY Mini kiti kullanın. Spektrofotometri riboprobes Asitli. Beklenen verimi 4-20 mg. % 1.5 sigara denatüre agaroz jel elektroforezi ile bir kısım ayırarak prob kalitesini değerlendirmek. Yüksek kaliteli probları minimal bulaşması ile ayrı bantları olarak göç ederler. </li><li> Spastine Özgü Riboprop özellikle hedef tanır sağlamak için, ilk ISH deney için bir pozitif kontrol doku içerir. Bu pozitif kontrol dokusu Spastine Özgü Riboprop hedef mRNA desen bilinmesi gerekmektedir. </li></ol> 2. Titreşimli Mikrotom Blade Hazırlama (Önceden tanımlanan Protokolü dayanarak) 7 <ol><li> % 4 düşük erime agaroz çözüm hazırlayın fosfat tamponlu salin (PBS). Agaroz çözülür ve 62 çözüm korumak için Mikrodalga çözüm ° C </li><li> 12mm çapı Millicell kültür plakasına yerleştirin ve bir agaroz kalıp olarak kullanmak için polistiren halka korumak zarı çıkarmadan polistiren halka kalıp hazırlayın. Her kullanımdan önce RNaz inhibitörü çözümü geceleme halkaları bekletin. </li><li> Düzgün bir kesim yüzeyi sağlamak için,% 100 konsantrasyonda, aşağıdaki çözücüler ile durulama Wilkinson bıçak yüzeyi pas önleyici ve diğer katkı maddeleri kaldırın: petrol eteri, ksilen, kloroform, metanol ve MilliQ su. Iki tek bıçak içine uzunlamasına çift bıçak ayırın. </li><li> Wilkinson bıçakları Loctite yapıştırıcı ile bir mikrotom bıçak uyun. Mikrotom bıçak kesim için değil, Wilkinson bıçak sertliği ekleyen. Wilkinson, bıçağın kesme kenarından 4mm - mikrotom bıçağı, metal makas ve bir kez yapıştırılır kullanarak Wilkinson bıçak uzunluğu kesilmelidir, 3 mahsup edilmelidir. </li></ol> 3. Kesit Ürogenital Dokular Diseksiyon, Depolama ve Hazırlık <ol><li> PBSTw çözüm hazırlayın (PBS% 0.1 içeren Tween ™ 20 ve 0.2mm sodyum azid 0.22μm Stericup süzgecinden ® filtre ünitesi). Çözüm önceden hazırlanmış ve 25 ° C&#39;de saklanabilir </li><li> 4 geceleme taze disseke fare LUT (mesane, pelvik üretra ve ilişkili Wolf ve Mϋllerian kanalı kökenli yapılar) ° C PBS içinde% 4 paraformaldehid fiksatif içeren inkübe edin. </li><li> 25 10 dakika süreyle yıkanması ° C kademeli metanol / PBSTw (1:3, 1:1, 03:01 v / v) çözümleri bir dizi dokular dehydrate. Gecede en az% 100 metanol içinde -20 ° C saklayınız örnekleri. Arşivlenmiş dokulara en az 2yr tutulabilir. </li><li> Arşivlenen dokuların rehidrate kesit için dokular hazırlayın. 25 ° C, kademeli metanol / PBSTw bir dizi (3:1, 1:1, 01:03 v / v) çözümleri 10 dakika süreyle yıkayın. </li><li> Inceleyin ve üretra bağlı trigon bölgenin en bırakarak, mesane yaklaşık üçte ikisi iptal. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Agaroz ürogenital Doku gömme <ol><li> 25 ° C düz cam mikroskop lamı, aşağı polistiren halka kalıp, düz bir yüzeye yerleştirin. </li><li> 62 ° C agaroz çözeltisi ve 2 dakikada bir yaklaşık serin halka kalıp doldurun. </li><li> PBSTw LUT doku çıkarın ve silin emici bir kuru kurulayın. </li><li> Agaroz çözüm doku aktarın. </li><li> Yönlendirmek agaroz katılaşmış ° C kadar halka kalıp alt ve üst arasında yarım asma ve 4 doku inkübe böylece agaroz LUT doku forseps kullanın. </li><li> Doku agaroz katılaşma sürecinde tamamen lavabolar, agaroz ve yeniden gömülü eksize edilebilir. Yeniden gömme işlemi sırasında gerekli agaroz soğutma saati ayarlayın. </li></ol> 5. Titreşimli Mikrotom (Önceden tanımlanan Protokolü dayanarak) 7 ile Ürogenital Doku Kesit <ol><li> Titreşimli mikrotom Mount takviyeli Wilkinson bıçak ve bıçak açısı 35 ° &#39;ye ayarlayın. Deluxe örnek banyo PBS ve paket numune banyo etrafında ıslak buz ile doldurun. </li><li> Halka kalıp katılaşmış agaroz fişini çıkartın ve emici bir malzeme ile silin alt yüzeyi kurulayın. Doku doğru yönde olduğundan emin olun. Dokular oryantasyon agaroz fişi düz kenarı konik bir jilet kullanarak ayarlanabilir. </li><li> Şekil Loctite yapıştırıcı ile disk montaj titreşimli mikrotom numune üzerine agaroz fiş uyun. 1A. </li><li> Vibratome içine numune montaj disk yerleştirin. </li><li> 4 mikrotom kesit kalınlığı 50μm, 2 hız ve bıçak genlik ayarlayın ve doku kesitlerinde kesme başlar. </li><li> Künt forseps buz 0.5mL PBSTw içeren 24-iyi bir kültür plakasına her doku kesiti (Şekil 1B) aktarmak için kullanın. </li><li> In situ hibridizasyon, tüketim için her doku bölümü (kalan agaroz ISH prosedürü sırasında eriyecek) etrafında agaroz örnekleri hazırlamak ve ilgili tüm pislikleri temizleyin. 4 48hr Mağaza bölümleri ° C PBSTw içinde. </li></ol> 6. Situ Hibridizasyon için Örnek Sepeti Hazırlama <ol><li> 100μL işareti mikrosantrifüj tüp alt kesin. </li><li> Kadar plastik yumuşatılmış bir alev tüp kesme kenarı Isı mikrosantrifüj tüp, daha sonra merkezi bir 0.5in polyester mesh kare üzerine sıkıca basın. </li><li> Trim ve aşırı örgü sepet hazırlama (Şekil 1C) tamamlamak için her tüp kapağının içine delmek iki delik ısıtmalı 18 iğne kullanın. </li><li> 24 plaka kapağını çıkarın ve her aşkın merkezli bir 12mm delik. ISH protokol yıkar (Şekil 1D) arasında örnek sepetler aktarmak için kapağı kullanın. </li></ol> 7. Situ Hibridizasyon için Embriyo Toz Hazırlama (Önceden tanımlanan Protokolü) 8 <ol><li> Aynı doku bölümleri olarak değerlendirilmekte olup, sahne ve mağaza -80 ° C fareler fare embriyo doku toplamak Dondurulmuş doku, sıvı nitrojen içinde seramik harcı, batığın doku içine yerleştirin ve doku ince bir toz haline öğütmek için bir havaneli kullanabilirsiniz. </li><li> Aseton 4 cilt embriyo tozu birleştirin ve Dounce Homojenizatör birkaç vuruş ile homojenize. </li><li> 15 mL cam vida top flakon Homojenat transferi ve gece ekstresi, 4 ° C </li><li> 4 10 dakika süreyle santrifüj 5000rpm Pelet embriyo tozu ° C Lipit içeren süpernatant çıkarın ve atın. Taze aseton 4vol içinde doku pelletini tekrar ve 4 2saat için ayıklamak ° C </li><li> Pelet 4 5000rpm 10 dakika süreyle santrifüj embriyo toz ° C Süpernatantı çıkarın ve atın. </li><li> Hava # 2 Whatman filtre kağıdı pelet kurulayın. 4 sıkıca kapalı cam şişe içinde ince bir toz ve mağaza verim pelet Crush ° C Yaklaşık verimi 1 g embriyo ıslak ağırlık başına 50 mg toz. </li></ol> 8. Gün 1 Situ Hibridizasyon <ol><li> 60.5 için ısıtın prehybridization solüsyonu (% 50 formamid, 5x SSC,% 1 Engelleme reaktif, 10μg/mL maya tRNA, 10μg/mL heparin mağaza -20 ° C) ° C Bu çözüm, önceden hazırlanmış ve -20 ° C&#39;de saklanabilir </li><li> Musluk suyunun yaklaşık 0,5 ile küçük bir plastik saklama kabı doldurarak nemlendirilmiş bir melezleşme odası hazırlayın. 60.5 ° C&#39;ye kadar konteyner ve ön ısıtma Kapak </li><li> 24-iyi bir kültür plaka kuyulardan 2mL PBSTw ekleyin. Örnek sepet sepet (sepet başına 10 bölüm kullanılmıştır) içine 24 plaka kapağı ve transfer doku kesitlerinde deliklere yerleştirin. </li><li> 25 saat 30 dakika için doku bölümleri inkübe ° C% 6 H 2 O 2. Bu ve sonraki tüm inkubasyon aksi belirtilmedikçe, bir yörünge çalkalayıcı üzerinde yavaşça sallanarak ile yürütülen olmalıdır. Tüm inkubasyon bird yıkar 24-kuyucuğu yapılan ve 2mL/well toplam bir çözüm hacmi kullanın. </li><li> 25 ° C PBSTw doku kesitlerinde 4 x 5min yıkayın. </li><li> 25 12min için doku bölümleri inkübe ° C PBSTw içinde 5μg/mL proteinaz K içeren </li><li> 25 ° C PBSTw doku kesitlerinde 1 x 5min yıkayın. </li><li> 25 Post-fix 20dk için doku kesitlerinde ° C PBS içinde% 4 ve% 0.2 paraformaldehid glutaraldehid içeren. </li><li> Doku kesitlerinde 2 x 5min 25 ° C PBSTw içinde yıkayın. </li><li> Prewarmed prehybridization tampon 2mL/well ekleyin ve içindeki doku bölümleri 60.5 1hr en az nemlendirilmiş hibridizasyon odası ° C inkübe </li><li> 60.5 nemlendirilmiş hibridizasyon odasında bir gecede her iyi ve inkübe doku kesitlerinde prehybridization tampon 0.65μg etiketli Spastine Özgü Riboprop ekle ° C </li></ol> 9. 2 Situ Hibridizasyon Gün <ol><li> Post-hibridizasyon yıkama adımları için aşağıdaki çözümleri hazırlayın Çözüm 1 (% 50 formamid, 5x SSC,% 1 SDS), Çözüm 2 (10mM Tris-HCL pH 7.5, 0,5 M NaCl,% 0.1 Tween ™ 20, 0.2mm sodyum azid: ,) süzülmüş 0.22μm ve Çözüm 3 (2x SSC,% 50 formamid). Bu çözümler, önceden hazırlanmış olabilir. Çözüm 1 ve 3 -20 ° C ve Çözüm 2 saklanır 25 saklanır ° C Çözümleri depolama ömrü en az 3 ay. </li><li> 60.5 doku kesitlerinde 3 X 30 dakika yıkayın ° C önceden ısıtılmış Çözüm 1. Yıkama sırasında nemlendirilmiş odasına kullanın. </li><li> 60.5 doku bölümleri 1 X 10dk yıkayın ° C önceden ısıtılmış Çözüm 1/Solution 2 (1:1 v / v) solüsyonu ile. Yıkama sırasında nemlendirilmiş kamara kullanın. </li><li> Çözüm 2 ile 25 ° C sıcaklıkta doku kesitlerinde 4 X 10dk yıkayın. </li><li> 37 15dk için doku bölümleri inkübe ° C Çözüm 2 içeren 0.25μg/mL RNaz. </li><li> 25 doku bölümleri 1 X 10dk yıkayın ° C Çözüm 2 (RNaz olmadan). </li><li> 25 doku bölümleri 1 X 10dk yıkayın ° C, 3 Çözüm 2 X1hr Çözüm 3 ile 60.5 ° C &#39;de yıkar. 60.5 ° C yıkama sırasında nemlendirilmiş odasına kullanın. </li><li> DIG etiketli riboprobes immünohistokimyasal tespiti için aşağıdaki çözümleri hazırlayın: Doku Engelleme Tampon (TB 1X TBS,% 10 koyun serum,% 1 engelleme reaktif,% 1 BSA,% 0.1 Tween ™ 20, 0.22μm süzülmüş), Antikor Seyreltme Tampon (AD, 1xTBS,% 5 koyun serumu,% 1 engelleme reaktif,% 1 BSA,% 0.1 Tween ™ 20, 0.2mm sodyum azid, 0.22 ™ m süzülmüş) Antikor Absorbsiyon Buffer (AA 1xTBS,% 5 koyun serum, 1 % engelleme reaktif,% 1 BSA, 6mg/mL embriyo tozu) ve TBSTw (1xTBS,% 0.1 Tween ™ 20, 0.2mm sodyum azid, 0.22μm süzülmüş). Bu çözümler, önceden hazırlanmış olabilir. TBSTw 25 ° C&#39;de saklanır, diğer tüm çözümler -20 ° C&#39;de saklanır </li><li> 25 3 X 10 dak ° C TBSTw ile yıkayın. </li><li> En az 25 2saat ° C TB tampon doku bölümleri inkübe edin. </li><li> Dokularda TB tampon kuluçka iken, her bir kuyu için 200μL AA tampon başına 1.1μL anti-DIG antikor ekleyin. Inkübe AA tamponu + antikor en az 4 2saat ° C, daha sonra 1dk için 10.000 rpm&#39;de santrifüj. AA tampon süpernatantı ve AD tampon 2mL ekleyin. </li><li> TB tampon doku bölümleri çıkarın ve nemlendirilmiş bir odasında 4 gecede inkübe ° C antikor içeren AD tampon. </li></ol> 10 Situ Hibridizasyon Gün 3 <ol><li> Renk geliştirme çözümü NTMT (100 mM Tris-HCL pH 9.5, 100 mM NaCl, 50mm MgCl 2, 0.2mm sodyum azid, 0.22μm süzülmüş) hazırlayın. Bu çözüm, önceden hazırlanmış ve 25 ° C&#39;de saklanabilir Hemen önce, 2mm levamizol eklemek ve% 0.1 Tween ™ 20. </li><li> 4 kuyu ve mağaza çözüm ° C antikor çözeltisi (AD tampon + antikor) çıkarın Iki kez tekrar edilebilir. </li><li> Dokuların 8 X 10 dakika 25 ° C TBSTw ile 2mm levamizol içeren yıkayın. </li><li> TBSTw bulunduğu Petri kabı dikkatlice sepet dokuların aktarmak. Forseps görünür enkaz kaldırmak için kullanın. Dokuların temiz mikrosantrifüj tüpler içine aktarın. </li><li> Dokular 25 1 X 10 dak ° C 1mL NTMT ile yıkayın. </li><li> NTMT çıkarın ve hafif bir koruma kutusu ve inkübe 25% 50 NTMT (2mm levamizol içeren) ve% 50 BM Mor yer tüpleri içeren bir karışımı 1mL/tube ° C ekleyin Renk geliştirme süresini birkaç saat ile birkaç gün arasında değişmektedir. Renk geliştirmek için yavaş ise,% 100 BM Mor kullanılabilir. </li><li> Monitör renk gelişim ve değişim NTMT / BM Mor çözüm çöktürülmüş kristalleri birikir eğer veya sarı ve mor renk değişikliğine uğrar. Tam renkli kalkınma sonra (4-250 saat), yıkama dokuların 25 2 X 5min ° C ile 1mL/tube 2mm levamizol içeren NTMT. </li><li> 4 geceleme dokuların inkübe ° C PBS 1mL/tube% 4 paraformaldehid sonrası fiksatif içeren. </li><li> Çamaşır suyu için dokular, 30 dakika boyunca inkübe dokuların 25 ° C 1mL/tube PBSTw,% 3 H 2 O 2 içeren </sub&gt;. Sonra 25 dokuların 1 X 10dk yıkayın ° C ve 4 ° C PBS 1mL/tube sonrası fiksatif% 4 paraformaldehid içeren saklayın PBSTw, 1mL/tube. </li><li> Doku bölümleri, cam slaytlar monte dakika muamele ve bir bileşik mikroskobu ile görüntülenmiş. </li></ol> 11. Temsilcisi Sonuçlar: Uzamsal yönlendirme agaroz LUT doku doku kesitlerinde uçağın belirler. Sagital bölümler için, mesane en az üçte ikisinin eksize edilir ve kalan LUT doku üretral orta hat agaroz fişi (Şekil 1A) düz bir yüzeye paralel olduğunu agar gömülü. Agaroz fişi düz kenarına pah doku düzlemde küçük ayarlamalar yapılabilir. Bu düzlemde odaklı bir 17.5dpc erkek LUT doku bir temsilci sagital kesiti Şekil 1B gösterilmiştir. Örnek sepet kaybı ve çok günlük ISH işlemi sırasında biriken toz ve partiküler madde hassas doku bölümleri korur. Örnek sepet 1.5mL mikrofuge&#39;de tüp (Şekil 1C) kesim sonuna kadar polyester mesh eriterek hazırlanmıştır. Küçük bir delik, içine ve dışarı sepetler çözüm akışını kolaylaştırmak için her bir numune sepeti kapağının içine deldi. Örnek sepetleri 24 plaka kapakları (Şekil 1D) 12mm delik delinmiş koyarak ISH çözümler askıya alınır. Modifiye plaka kapakları çözüm değişiklikleri sırasında 24-kuyucuğu arasında transfer sepet destekler. Bu uzun inkübasyon dönemlerinde düşük bolluk mRNA&#39;ların tespiti için gerekli olan non-spesifik bir arka plan boyama sınırlamak zordur. 0.22μm filtreler aracılığıyla örnek tamponlar 0.2mm ve sodyum azid sonraki filtrasyon yanı sıra, arka plan boyama (Şekil 2) sınırlamak için ortaya çıktı. Burada açıklanan yöntemi kullanarak, örnekleri uzun bir süre bir süre için (Şekil 3), renk geliştirme çözümü inkübe zaman arka plan boyama görünür farklılıklar görünmüyor. <img src="/files/ftp_upload/2912/2912fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1 bir fare, alt ürogenital (LUT) yolu doku bölümünde ve mikrosantrifüj tüp ISH için bir sepet hazırlanması . Mesane, pelvik üretra ve ilişkili Wolf ve Mϋllerian kanalı kökenli yapısı) bir parçası içeren bir LUT% 4 düşük erime agaroz silindirik bir fiş yerleştirilmiştir. (A) fişi bir örnek montaj diske yapıştırılmış ve (B) titreşimli mikrotom 50μm bölümleri oyulmuş. (C) bir LUT bölümünde tüp kapağı ve eritme polyester mesh tüp kesme alt ucunda bir delik delme tarafından hazırlanan bir mikrosantrifüj tüp sepet içine transfer edilir. (D) mikrosantrifüj tüp doku bölümleri ISH protokol sırasında tampon çözelti askıya alınır, böylece, bir 24-plaka kapağının içine delinmiş 12mm deliklere eklenir. Arrowheads agaroz fiş LUT doku göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/2912/2912fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2 0.22μm süzülmüş çözümler 0.2mm sodyum azid Incorporation, doku kalitesini artırır ve arka plan boyama azaltır . 17.5dpc erkek fare, alt ürogenital yolları (LUT) sagital düzlemde 50μm kalınlığında kesitler alındı. Doku bölümler büküm homolog 1 yöneltilen bir prob kullanarak ISH tarafından boyandı. (A) ISH için kullanılan Tamponlar ya 0.22μm filtrelenmiş ve 0.2mm sodyum azid (Naaz) ile desteklenebilir veya (B) filtrelenmemiş ve Naaz ile desteklenebilir. Ok uçları arka plan boyama göstermektedir. Görüntüler de aynı büyütme düzeyinde ele geçirildi. Sonuçlar n = 3 çöp bağımsız fareler temsilcisi boyanma. <img src="/files/ftp_upload/2912/2912fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3. Arka plan boyama yoğunluğu, uzun süreli bir renk gelişimi ile artış görünmüyor. 17.5dpc erkek fare, alt ürogenital yolları (LUT) sagital düzlemde 50μm kalınlığında kesitler alındı. Bölüm (A) 9.5h (B) 43.5h orta bolluk tanıdığı bir prob kullanarak, yüksek bolluk transkript östrojen-reseptör gama (Esrrg) tanıdığı bir prob kullanarak kromajen boyama çözüm onları kuluçka ISH boyandı transkript bromodomain çinko parmak etki alanına bitişik, 2A (Baz2a), veya (C) düşük bolluk transkript kanatsız-tipi MMTV entegrasyon sitesi aile, üye 10a (Wnt10a) tanıdığı bir prob kullanarak 236h. Görüntüler de aynı büyütme düzeyinde ele geçirildi. Sonuçlar n = 3 çöp bağımsız fareler temsilcisi boyanma.

<ol>
	<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+possible+influence+of+temporal+factors+in+androgenic+responsiveness+of+urogenital+tissue+recombinants+from+wild-type+and+androgen-insensitive+(Tfm)+mice.">The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice.</a> Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).</li><li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal,+cellular,+and+molecular+regulation+of+normal+and+neoplastic+prostatic+development.">Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development.</a> Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).</li><li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+aspects+of+development+and+structure+in+the+prostate.">Comparative aspects of development and structure in the prostate.</a> National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).</li><li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+interactions--I.+Induction+of+prostatic+phenotype+in+urothelium+of+testicular+feminized+(Tfm/y)+mice.">Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice.</a> Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).</li><li>Rozen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer3+on+the+WWW+for+general+users+and+for+biologist+programmers.">Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.</a> Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).</li><li>Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+greedy+algorithm+for+aligning+DNA+sequences.">A greedy algorithm for aligning DNA sequences.</a> Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).</li><li>Vezina, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dioxin+causes+ventral+prostate+agenesis+by+disrupting+dorsoventral+patterning+in+developing+mouse+prostate.">Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate.</a> Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).</li><li>Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts.">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada anlatılan yöntemi kullanarak, tüm önemli hücre tipleri ve mezenkimal pedleri, ürotelium&#39;un, düz kas, prostat tomurcukları, ejakülasyon kanalı ve vajina da dahil olmak üzere fetal erkek ve dişi fare LUT doku bölmeleri mRNA&#39;ların tespit etmek mümkündür. Bu protokolde kullanılan 50μm bölümler, mimari dokusu (kan damarları gibi) çözmek için yeterli kalınlığa olmanın avantajı var ama yaygın tüm montaj ISH sırasında karşılaşılan metodolojik bir sorundur prob yakalama önlem...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> Anti-digoxigenin antikor, Fab parçaları </td><td> Roche Uygulamalı Bilimler </td><td> 11214667001 </td></tr><tr><td> Reaktif Engelleme </td><td> Roche Uygulamalı Bilimler </td><td> 11096176001 </td></tr><tr><td> BM Mor AP substrat, presipite </td><td> Roche Uygulamalı Bilimler </td><td> 11442074001 </td></tr><tr><td> Sığır Serum Albumin </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td></tr><tr><td> Hücre kültürü plaka iyi 24 </td><td> Corning </td><td> 3524 </td></tr><tr><td> Digoxigenin 11-UTP </td><td> Roche Uygulamalı Bilimler </td><td> 1277073910 </td></tr><tr><td> dNTP </td><td> Roche Uygulamalı Bilimler </td><td> 11969064001 </td></tr><tr><td> , Iki ucu keskin bir jilet bıçak </td><td> Wilkinson Sword </td><td> Klasik Model </td></tr><tr><td> Eliminase RNaz Remover </td><td> Decon Laboratuvarları </td><td> 1102 </td></tr><tr><td> Formamid </td><td> Sigma </td><td> F5786-1L </td></tr><tr><td> Jel ekstraksiyon kiti </td><td> Qiagen </td><td> 28704 </td></tr><tr><td> H 2 O Glutaraldehyde,% 25 çözüm </td><td> Sigma </td><td> G6257-100ML </td></tr><tr><td> Heparin, sodyum tuzu </td><td> Sigma </td><td> H3393 </td></tr><tr><td> H 2 O Hidrojen peroksit,% 30 çözüm </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2633-500 </td></tr><tr><td> Levamizol </td><td> Sigma </td><td> L9756 </td></tr><tr><td> Loctite 404 hızlı ayarı anlık yapıştırıcı </td><td> Henkel A.Ş. </td><td> 46551 </td></tr><tr><td> Magnezyum klorür </td><td> Fisher Scientific </td><td> M33-500 </td></tr><tr><td> Maleik asit </td><td> Sigma </td><td> M0375-500G </td></tr><tr><td> Mikrosantrifüj tüpler, 1.5mL </td><td> Biologix Araştırma Şirketi </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Millicell kültür plaka eklemek </td><td> Millipore </td><td> PICM01250 </td></tr><tr><td> Moleküler taşlama reçine </td><td> G-Biosciences </td><td> 786-138PR </td></tr><tr><td> Paraformaldehit,% 4 çözelti fosfat tamponlu salin </td><td> Affymetrix </td><td> 19943 </td></tr><tr><td> Fosfat Ca ve Mg olmadan tamponlu salin </td><td> MP Biyomedikal </td><td> ICN1760420 </td></tr><tr><td> Polyester örgü, 33 mikron, 12 &quot;x 24&quot; </td><td> Küçük Parça A.Ş. </td><td> CMY-0033-D </td></tr><tr><td> Proteinaz K çözümü, 20mg/ml </td><td> Amresco </td><td> E195-5ML </td></tr><tr><td> QIAshredder Sütunlar </td><td> Qiagen </td><td> 79654 </td></tr><tr><td> Q çözümü </td><td> Qiagen </td><td> Taq DNA polimeraz ile Sağlanan </td></tr><tr><td> RNaz </td><td> Sigma </td><td> R6513 </td></tr><tr><td> RNaz inhibitörü </td><td> Roche Uygulamalı Bilimler </td><td> 03335399001 </td></tr><tr><td> RNeasy minivan kiti </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> RNEASY minivan kiti </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> RQ1 RNaz-ücretsiz DNaz </td><td> Promega </td><td> M6101 </td></tr><tr><td> SeaPlaque düşük erime agaroz </td><td> Lonza </td><td> 50101 </td></tr><tr><td> Koyun serum </td><td> Sigma </td><td> S2263-500ml </td></tr><tr><td> Stericup filtre ünitesi, 0.22μm, polyethersulfone, 500ml </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td></tr><tr><td> Sodyum azid, taneli </td><td> Fisher Scientific </td><td> S227I-100 </td></tr><tr><td> Sodyum klorür </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP358-212 </td></tr><tr><td> Sodyum dodesil sülfat </td><td> Fisher Scientific </td><td> S529-500 </td></tr><tr><td> SSC, 20X çözüm </td><td> Araştırma Ürünler Uluslararası </td><td> S24022-4000.0 </td></tr><tr><td> Üst Simge III ilk iplikçik sentez sistemi </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-051 </td></tr><tr><td> T7 RNA polimeraz </td><td> Roche Uygulamalı Bilimler </td><td> 10881767001 </td></tr><tr><td> Taq DNA polimeraz </td><td> Qiagen </td><td> 201203 </td></tr><tr><td> Tris-HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP153-1 </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Deluxe örnek banyo mikrotom Titreşimli </td><td> Leica Microsystems </td><td> VT1000A </td></tr><tr><td> Maya tRNA </td><td> Roche Uygulamalı Bilimler </td><td> 109495 </td></tr></tbody></table>

a high throughput in situ hybridization method to characterize mrna expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract

Alt üriner sistem (LUT) geliştirilmesi, karmaşık bir süreçtir. Bu karmaşıklık, androjenik sinyalleri ve etkileşimleri 1,2 epitelyal-mezenkimal dayanmaktadır fetal erkek üretra, prostat oluşumu sırasında kanıtlanmıştır . Prostat gelişiminde sorumlu olan moleküler mekanizmaların anlaşılması uygunsuz prostat, benign prostat hiperplazisi ve prostat kanseri gibi hastalıklara yol açmaları daha sonra yaşamın yeniden canlanmasına sebep oldu büyüme mekanizmalarının ortaya çıkarabilir. Gelişmekte olan LUT anatomik olarak karmaşık. Tomurcuklanma zaman prostat 16.5 gün anlayışı (DPC) başlar, çok sayıda hücre tipleri mevcuttur. Damarları, sinirleri ve düz kas mezenkimal stroma 3 içinde bulunur. Bu çok katmanlı bir epitel stroma çevreleyen ve fetal androjen reseptör bağımlı parakrin sinyaller 4 ile prostata yol açmaktadır. Stromal androjen kimlik reseptör duyarlı prostat gelişiminde ve bu genlerin yanıt prostat duktal epitel formları tam olarak anlaşılmış değildir hangi mekanizma için gerekli olan genler. Yeteneği tam hücre tiplerinin tanımlanması ve bunların içindeki belirli faktörlerin ifade lokalize prostat gelişiminde daha fazla anlamak için şarttır. Situ hibridizasyon (ISH) bir doku içindeki mRNA&#39;ların lokalizasyonu için izin verir . Böylece, bu yöntem ve böylece potansiyel prostat gelişim düzenleyiciler nedenlerine açıklık, desen ve sinyal molekülleri ve bunların reseptörleri ifade zamanlaması tanımlamak için kullanılır. Burada, titreşimli mikrotom kesilmiş bölümler kullanarak fetal fare LUT mRNA desenleri tanımlamak için bir yüksek verim ISH tekniği açıklar. Bu yöntem diğer ISH protokolleri üzerinden birçok avantaj sunar. Bir slayt yapıştırılır ince bölümlerde ISH Sahne teknik olarak zor, hem cryosections ve parafin bölümleri genellikle zayıf sinyal çözünürlüğü neden cryosections sık sık kötü yapısal kalite var. Bütün montaj dokular üzerinde ISH Sahne prob yakalama neden olabilir. Buna karşın, yüksek kapasiteli tekniği ayrıntılı mimari dokusu ortaya kalın kesilmiş bölümler kullanır. Modifiye mikrofuge&#39;de tüpler ISH prosedürü sırasında bölümleri kolay kullanım sağlar. Ve böylece maliyet, maksimum verimlilik azaltarak, maksimum 4 mRNA transkript kadar tek bir çalışma tespit edilen 24 mRNA transkript ile tek bir 17.5dpc LUT gösterildi. Bu yöntem, birden fazla tedavi gruplarında böylece verileri yorumlamak için herhangi bir önyargı çıkarırken, aynı ve tek bir birim olarak işlenen sağlar. En pertinently prostat araştırmacılar için, bu yöntem, düşük ve yüksek bolluk mRNA transkript prostat duktal ağ sebebiyet veren fetal fare üretra mekansal ve zamansal bir konum sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract at JoVE.com

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Burada, biz verimli bir yüksek kapasiteli tarif<em&gt; In situ</em&gt; Fetal fare prostat doku bölümleri gelişmekte olan mRNA desenleri görselleştirmek için hibridizasyon (ISH) yöntemi. Bu yöntem diğer fare dokularda veya diğer türler dokularda mRNA ekspresyonu görselleştirmek için kolayca adapte olabilir.

Yüksek Verimli In situ</emFetal Fare Alt Ürogenital Yolu mRNA İfade Desenler Karakterize> Hibridizasyon Yöntemi

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male ...

a-high-throughput-situ-hybridization-method-to-characterize-mrna

Research

JoVE Journal

Biology

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

13.0K Görüntüleme.  University of Wisconsin-Madison. Burada, biz verimli bir yüksek kapasiteli tarif In situ Fetal fare prostat doku bölümleri gelişmekte olan mRNA desenleri görselleştirmek için hibridizasyon (ISH) yöntemi. Bu yöntem diğer fare dokularda veya diğer türler dokularda mRNA ekspresyonu görselleştirmek için kolayca adapte olabilir.

Video: A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

S. cerevisiae &quot;adlı organel morfolojisi küresel çalışma yüksek verimli bir yöntem

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Biyoloji

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebra balığı Tüm Dağı Yüksek Çözünürlüklü Çift Floresan Yerinde Hibridizasyon

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

İnsan pre-mRNA üzerinde Haritalama Ribonucleoproteins Hızlı Yüksek verim için Yöntemi (RNPs)

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Hi-C: genomların Üç boyutlu Mimari Eğitim Bir Yöntem.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

Tüm Dağı<em&gt; In situ</emE11.5 fare embriyolarına E8.5 ve&gt; Hibridizasyon

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. Each of these features can be accomplished with in situ hybridization to mRNAs within cells. Here we present a radioactive in situ hybridization method modified from Clayton et al. (1988)1 that has been working successfully in our lab for many years, especially for adult vertebrate brains2-5. The long complementary RNA (cRNA) probes to the target sequence allows for detection of low abundance transcripts6,7. Incorporation of radioactive nucleotides into the cRNA probes allows for further detection sensitivity of low abundance transcripts and quantitative analyses, either by light sensitive x-ray film or emulsion coated over the tissue. These detection methods provide a long-term record of target gene expression. Compared with non-radioactive probe methods, such as DIG-labeling, the radioactive probe hybridization method does not require multiple amplification steps using HRP-antibodies and/or TSA kit to detect low abundance transcripts. Therefore, this method provides a linear relation between signal intensity and targeted mRNA amounts for quantitative analysis. It allows processing 100-200 slides simultaneously. It works well for different developmental stages of embryos. Most developmental studies of gene expression use whole embryos and non-radioactive approaches8,9, in part because embryonic tissue is more fragile than adult tissue, with less cohesion between cells, making it difficult to see boundaries between cell populations with tissue sections. In contrast, our radioactive approach, due to the larger range of sensitivity, is able to obtain higher contrast in resolution of gene expression between tissue regions, making it easier to see boundaries between populations. Using this method, researchers could reveal the possible significance of a newly identified gene, and further predict the function of the gene of interest.

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

This protocol is successfully used to quantitatively detect levels and spatial patterns of mRNA expression in multiple tissue types across vertebrate species. The method can detect low abundance transcripts and allows processing of hundreds of slides simultaneously. We present this protocol using expression profiling of avian embryonic brain formation as an example.

Radyoaktif In situ</emDoku Çeşitli Gen Patterns Saptayan> Hibridizasyon

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

Otomatik kullanarak Kromozomlar Yüksek throughput Fiziksel Haritalama<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Ribozom Bağlı Doğan Polipeptitler İzolasyonu<em&gt; In vitro</em&gt; MRNA boyunca Translasyonel Duraklat Siteleri Belirleme

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Yüksek Verimli In situ Hibridizasyon Yöntemi