Bu teknik sadece lokalizasyona değil, bireysel oositve embriyolarda aday mRNA'ların sayısallaştırılmasına da olanak sağlar. PCR dahil olmak üzere diğer tahlillerle karşılaştırıldığında, tekniğin tamamlanması düşük varyasyonlu tekrarlanabilir verilerle sonuçlanır. Prosedürü gösteren Kelsey Timme, benim laboratuvarımda yüksek lisans öğrencisi olacak.
Metin protokolünde açıklandığı gibi, beş ila sekiz haftalık bir yaşta gerekli malzeme ve dişi farelerin hazırlanması ile bu prosedüre başlayın. Fareyi %70 etanol kullanarak temizleyin. Karın boşluğuortaya çıkarmak ve kadın üreme sistemi görselleştirmek.
Forceps ile yumurtalık tutun ve yumurtalık çevresinden rahim bağları ve aşırı yağ dokusu kaldırın. Oviduct'i rahimden kes. Daha sonra, 35 milimetrelik bir çanak sıcak tutma orta yumurtalık oviduct çifti yerleştirin.
Yumurtalık ve herhangi bir çevreleyen yağ dokusu çıkarın. Yarım inç 27 gauge iğne kullanarak oviduct şişmiş ampullae gözyaşı. Gözyaşı ve kümülüs hücre lisit komplekslerinin bulunduğu yere itin.
Yumurtalanmış yumurtaları hyaluronidase ile tutma ortamı içeren 100 mikrolitrelik damlaya aktarmak için bir ağız pipeti kullanarak. Kümülüs hücrelerini yerinden çıkarmak için, pipet, ağız pipeti ile tutma ortamı içeren hyaluronidase yukarı ve aşağı metafaz iki oosit kümülüs hücre kompleksleri. Kümülüs hücrelerinden yoksun kaldıktan sonra, her yumurtayı sadece tutma ortamı içeren bir yıkama damlasına aktarmak için ağız pipetini kullanın.
Her yıkama damlacık için bunu tekrarlayın. Parçalanmış veya saydam yumurtaları aktarmayın. SM-FISH boyama gerçekleştirmek için, ilk fiksasyon tampon 500 mikrolitre içeren altı kuyu plaka bireysel bir kuyuda oositler düzeltmek.
20 veya daha az yumurtayı kuyuya batırın. Yumurtaları oda sıcaklığında 20 dakika sabitleme tamponuna yatırın. Metin protokolünde açıklandığı gibi oositleri yıkadıktan sonra, oda sıcaklığında 30 dakika permeablizasyon tamponunda yumurta ları kuluçkaya yatırın.
Başka bir yıkamadan sonra, yumurtaları 80 mikrolitre önceden seyreltilmiş proteaz üç tampon oda sıcaklığında 30 dakika aktarın. Nanog, Pou5f1 ve DapB 1'den 50'ye kadar sonda seyreltme için ısıtılmış sonda setlerini seyreltin. 40 santigrat derecede iki saat boyunca transkript spesifik prob 80 mikrolitre içinde kuluçka oositler.
Yumurtalar sonda ve AMP tamponlar olduğunda, onlar yüzer eğilimindedir. Yumurtaları yavaşça arabelleğe iterek batırmanız esastır. Yumurtaları 500 mikrolitre yıkama tamponuna aktarın ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın.
Şimdi, yumurtaları amplifikasyon tamponlarında sırayla kuluçkaya yatırın. İlk olarak, 40 santigrat derecede 30 dakika boyunca 80 mikrolitre AMP1 yumurta kuluçka. Daha sonra yumurtaları oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 500 mikrolitre yıkama tamponuna aktarın.
Daha sonra, 80 mikrolitre AMP2'de 40 santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yat. Daha önce olduğu gibi yumurtaları yıkadıktan sonra, 40 santigrat derecede 30 dakika boyunca 80 mikrolitre AMP3'te yumurtaları kuluçkaya yatırın ve ardından son bir yıkama. Son olarak, 40 santigrat derecede 15 dakika boyunca 80 mikrolitre AMP4FL için oosit ekleyin.
Pipet 12 mikrolitre anti-fade montaj ortamı reaktifine kabarcıklar eklemeden bir slaytın ortasına. Yumurtaları mümkün olduğunca az yıkama tamponu yla montaj ortamına aktarın. Son olarak, bir kapak fişi uygulayın.
Z-adım konfokal mikroskopi kullanarak üç boyutlu oositleri görüntüleyin ve metin protokolünde açıklandığı gibi görüntüleri kaydedin. ND2 dosyalarını Fiji'ye sürükleyin ve Hyperstack'i seçin. ND2 dosyasının floresan kanallarını ayırmak için Resim sekmesini tıklatın, Renk'i seçin ve Kanalları Böl'ü tıklatın.
Her floresan kanaldaki yumurtaların her Z dilimi için tek tek TIFF dosyaları oluşturun. Bunu yapmak için Resim sekmesini tıklatın, Yığınlar'ı seçin ve Resimlere Yığın'ı tıklatın. Ardından, Resim sekmesini tıklatın, Türü seçin ve her Z dilimini tek bir RGB renkli görüntüye dönüştürmek için RGB Color'ı tıklatın.
Dönüştürülmüş her görüntüyü TIFF dosyası olarak kaydedin. Dikiş sırasında karışıklığı önlemek için görüntüleri her floresan kanal için tek bir oositi yeni bir klasöre yerleştirin. Metin protokolünde açıklandığı gibi dosyaları normalleştirdikten sonra Eklentiler sekmesini tıklatın, Dikiş'i seçin ve Grid Collection'ı tıklatın.
Açılan menüden Sıralı Görüntüler'i seçin ve Tamam'ı tıklatın. Dizine göz atın ve tek bir dalga boyunda tek bir oosit için Tüm Z dilimi görüntülerini içeren klasörü seçin. Tamam'ı tıklatın.
Dikişli görüntünün altındaki kaydırıcıyı kullanılan dalga boyu için uygun renk kanalına taşıyın. Resim'e tıklayarak, Tür'u seçerek ve RGB Color'ı tıklatarak son RGB dikişli görüntüyü oluşturun. Dikişli görüntüyü 32 bit maksimum yansıtılan resme dönüştürün.
Bunu yapmak için Resim'i tıklatın, Tür''u seçin ve 32 bit'i tıklatın. Bu görüntüyü yeni bir TIFF dosyası olarak kaydedin. 32 bit dikişli görüntüyü bir nokta bulma ve izleme programında açın.
Yerelleştir açılır dosyasını seçin ve resimde bulunan nokta sayısını hesaplayacak olan Yerelleştir'i tıklatın. Burada gösterilen nokta bulucu ve izleme kullanarak mRNA'ların nicelleştirilmesidir. Mavi ok, eşiğin üzerindeki pozitif sinyali işaret ediyor.
Beyaz ok, eşiğin altında floresan bir nokta gösterir ve bu nedenle sayılmaz. MRNA sayımları daha sonra standart bir veri analizi aracı kullanılarak analiz edildi. Orta Z serisi görüntü temsili görüntüler Pouf51 ve Nanog için gösterilir.
Metafaz iki iğde hizalanmış kromozomların DAPI boyama beyaz gösterilir. Bu protokolde toplanan veriler, metafaz iki oositte 775 Pouf51 transkript ve 113 Nanog transkripti gösterdi. Daha da önemlisi, negatif kontrol olarak görev yapan DapB sondası ile etiketlenmiş yumurtalarda herhangi bir nokta saptırılmadı.
Non-yapışık hücreleri kullanırken, ampirik SM-FISH kiti proteaz tampon en iyi seyreltme belirlemek önemlidir. mRNA tespiti 1xPBS'de seyreltilmemiş ve birkaç seyreltilmiş proteaz tampon konsantrasyonunun titrasyon eğrisi kullanılarak test edildi. Bu protokolde kullanılan proteaz seyreltme metafaz iki oositlerde Pouf51 mRNA ortalama floresan ekspresyonunda en düşük varyasyonu gösterdiği nden 1-8 arası dır.
Bir hedef proteinin eşzamanlı immün-floresansı, mRNA'yı RNA bağlayıcı proteinle birlikte lokalize etmek için yapılabilir. MRNA'ların RNA bağlayıcı proteinlerle birlikte lokalizasyonu, araştırmacıların bir yumurta veya embriyo içinde mRNA depolama, çeviri ve bozulmayı düzenleyen mekanizmaları belirlemelerine olanak tanır.
