Cheng laboratuvar Elektron mikroskobu çalışmaları kısmen NIH (1R01GM082893, 1R01GM098672, 1S10RR026814-01 ve P50GM082250 (A. Frankel)) ve Atılım Biyomedikal Araştırma, Fırsat Ödülü ve Yeni Teknoloji Ödülü, UCSF Programı hibe hibe destek.

1. EM ızgaraları karbon kaplama için hazırlanması <ol><li> Büyük bir cam beher distile su ile doldurun. </li><li> Kolloidon (~ 20μl, amil asetat% 2, Elektron Mikroskopi Bilimler, PA, USA) tek bir damla su yüzeyinde açılan bir cam pipet kullanın. Kolloidon su / hava yüzeyi ince bir plastik tabaka oluşturacak şekilde yayılır; Not: kolloidon ilk damla su yüzeyinde herhangi bir toz parçacıkları temizlemek için kullanılıyor olabilir. Filmin ilk damla çıkardıktan sonra, su yüzeyinde toz açıktır. </li><li> EM ızgaraları, su yüzeyinde yüzen plastik tabaka üzerine tek tek Ted Pella Inc (ABD) satın alınan 400 veya 200 örgü Gilder Cu ızgaraları yerleştirin; Biz genellikle 50 ~ 100 ile yakın bir ambalaj desen parlak ızgaraları, plastik katman (Şekil 1A) içine aşağı bakacak şekilde ızgara yan. Not: 400 örgü ızgaralar rutin negatif leke EM ızgaraları iyi 200 mesh ızgaraları ise eğim çifti görüntüleri toplamak için iyi. </li><li> Kes bir pastace, ızgaraları plastik tabaka üzerine yerleştirilen alanında biraz daha büyük boyutlara sahip kağıt. Izgara (Şekil 1B) üstüne kağıt dikkatlice yerleştirin ve kağıt (Şekil 1C) tamamen ıslak hale gelene kadar bekleyin. Not: Farklı kağıt türleri farklı su emme oranlarına sahip. Kağıt çok hızlı su emme olmadığı önemlidir. Örneğin, düzenli filtre kağıdı, su çok hızlı emer ve kırışıklıkların çok yapar, çünkü bu amaç için iyi değildir. Buruşmasını yapılan karbon film, böylece rasgele konik eğim 3D rekonstrüksiyon için eğim çifti görüntüleri toplamak için iyi değildir düz değildir ve. Bir uygun olanı bulmak için farklı kağıtları test etmek için vardır. Laboratuvarımızda, yerel bakkal satın bloknot kağıtları kullanarak var. Bazen gazete kağıdı da uygun bulunmuştur. Başka bir seçenek de Çince / Japonca hat için kullanılan göreli kalın pirinç kağıdı kullanmaktır. </li><li> Hızla etrafındaki plastik film kesiler yapmak ve yakınbatırılmış bir kağıt. Hemen sonra, kağıt, plastik film ve kağıt arasında sıkışmış ızgaraları ile pick up için forseps bir çift kullanın. Hava ile kurutma (Şekil 1D) yukarı bakacak şekilde ızgaraları ile petri kağıt yerleştirin; Not: Bu kağıt hava kuruması için önemlidir. Kuruma çok hızlı kağıt birçok kırışıklıkları oluşturur. </li></ol> 2. Karbon kaplama ızgaraları <ol><li> Laboratuvarımızda kullanılan karbon kaplama makinesi Cressington 208C Yüksek Vakum Turbo Karbon Kaplayıcı (Ted Pella). Sistemimiz, bir kuvars kristali salınım frekansı yatırılan filmin yüzeyinde bir kitle tarafından değiştirildi olduğunu ilkesine dayalı kaplı karbon film kalınlığını ölçen bir Cressington film kalınlığı monitör, ile donatılmıştır. Ancak, bu protokol, her laboratuar genellikle mevcut olmadığından, kalınlığı monitör gerektirmez Burada anlatılan. </li><li> Karbon kaplama m bir kalemtıraş (Ted Pella) ve yük karbon çubuklar kullanarak karbon çubuk Keskinleştirachine (Şekil 2A). Düz bir ucu keskin bir ucu ve diğer iki çubuklar, birbirlerine karşı yerleştirilir. </li><li> Buzlu bir cam slayt alanının yarısı vakum sürülmesi ve ızgaralar (Şekil 2B) yanına yerleştirin. Buzlu cam slayt alanının sadece yarısı vakum gres yağı ile kaplı olmalıdır. Not: vakum gres alan karbon kaplama sonra renk değişikliği olmaz. Vakum gres bitişik olan ve olmayan alanlar arasındaki kontrast kaplı karbon kalınlığı bir tahmin sağlar. </li><li> Karbon kaplama makinesi sahnede ızgaraları ile kağıt yerleştirin. Izgaraları (Şekil 2C) yanındaki cam slayt yerleştirin. Not: Bir de kaplama yapmadan önce bir bardak slayt plastik film ile kaplı ilk transferi ızgaraları durumunda birçok ızgaraları kağıt düşebilir. </li><li> Vakum odasında pompası ve vakum 10 -5 Torr bir seviyeye gelene kadar bekleyin. Not: kaplama genellikle düşük vakum ile çok büyük karbon parçacıkları sonuçlanan birçok kıvılcım üretirızgara. </li><li> Çok yavaş arttırın. Karbon çubuğun sivri uçlu ilk akım arttıkça beyaz, kırmızı ve daha sonra olacak. Yüksek parlaklık ucu doğrudan çıplak gözle izlemek etmeyin . Kaplama başladığında akımını artırarak durdurun. Cam slayt, beyaz, gri ve koyu gri ışık rengi değişecektir. Slaytların karanlık kaplı olan karbon film kalınlığı ilişkilidir. Istenilen kalınlıkta (Şekil 2B) elde edildiğinde kaplama durdurmak için geçerli kapatın. Not: 1) tekrarlanan karbon kaplama prosesleri, cam fanus içine kaplı karbon sonra rengini koyulaştırır. Bu kaplamalı karbon filmi aslında daha kalın görünmesine neden olur. 2) Bir bilenmiş karbon çubuk birkaç kaplama için kullanılabilir. Her kaplama sonra yavaş yavaş uç keskinliği azaltılır. Maksimum akım karbon çubuk netlik etkilenir. Küçük çaplı bir taze sivriltilmiş çubuk göre daha düşük gerektirirkarbon buharlaşması için mevcut. Daha sonra kaplama biraz daha yüksek akım gerekebilir. </li><li> Vakum odasında Vent ve daha sonra kullanmak üzere kaplı ızgaraları kaldırmak. Not 1 karbon kalınlığı kontrol daha doğru bir yöntem, bir film kalınlığı monitör kullanıyorsanız. Veya bir monitör ile ölçülen doğru kalınlığı niteliksel karşı rengi kalibre. Bu teknik için yararlı bir karbon kalınlığı 3 ila 7 nm. </li></ol> Bu büyük miktarda karbon kaplı ızgaralar hazırlamak için basit ve kolay bir yöntem, genellikle ortalama 100 ızgaraları hazırlık ~. Izgaraları, genellikle olumsuz lekeli görüntünün kalitesini etkilemez ince bir plastik tabaka içerir. Ancak, bu yöntem hazırlanan ızgaraları cryoEM için uygun değildir. Bu tabaka, plastik, birkaç saat için kloroform içine ızgaraları iliklerine silinebilir. 3. Uranil format solüsyonu (% 0.75) negatif hazırlama EM leke. Ayrıntılı bir protokol.daha önce 5 açıklanan <ol><li> Uranil format, 37.5 mg lık küçük bir behere tartılır; </li><li> 5 ml kaynar su ekleyin ve 5 dakika boyunca karanlıkta karıştırın; </li><li> 10μl 5M NaOH ekle, 5 dakika karıştırmaya devam edin; </li><li> Bir şırınga filtresi (Fisherbrand, 13mm şırınga filtresi, 0.2μm, Naylon non-steril, katalog numarası 09-720-5) kullanarak çözüm Filtre ve filtre edilmiş solüsyon alüminyum folyo ile kaplanmış bir 8 ml Falcon tüp içinde saklamak; Not uranil biçimleri toz Elektron Mikroskobu Bilimleri (Hatfield, PA), katalog numarası 22451 olarak satın alınabilir. Uranil format çözüm ışığa duyarlı ve Falcon tüp alüminyum folyo ile kaplayarak örneğin, doğrudan güneş ışığı uzak tutulmalıdır. Taze hazırlanmış bir çözüm açık sarı bir renk vardır (Şekil 3A). Leke çözüm presipite başlamadan önce 1-2 hafta boyunca tezgah üzerinde tutulmalıdır. Uranil format ~ 4 pH asittir. NaOH pH artar ekleme, ancak çok hızlı bir şekilde ekleyerekya da aşırı hızlanmasına neden leke neden olabilir. Uranil format, kontrast yanı sıra, aynı zamanda protein örneği giderir. Fiksasyon oranı çok hızlı olduğundan, genellikle düşük pH, toplam protein konformasyonlar veya protein kompleks oluşumu 7 etkiler değildir . </li></ol> 4. Negatif leke EM ızgara hazırlanması için protokol. Bu protokol daha önce 5 ayrıntılı olarak tarif edilmişti <ol><li> PELCO easiGlow GlowDischarge sistemi (Ted Pella Inc, USA) kullanılarak Kızdırma deşarj karbon kaplı ızgara,. Kullanılan akım 15 mA ve ızgaralar 30 sn. Taburcu parlaklık Glow-deşarj ızgaraları parlaklık boşaltma kısa bir süre sonra kullanılmalıdır. Biz genellikle kızdırma taburcu olduktan sonra en az 2 saat içinde ızgaraları kullanın. </li><li> Place distile su iki 20μl parafilm bir parça düşer ve uranil format çözüm iki 25μl damla (Şekil 3B). </li><li> Araba ile ters kuvvet anti-kapiller forseps kullanarak parlayan taburcu ızgara tutunbon-kaplı yüzü yukarı bakacak. Not: anti-kapiller forseps kullanmak gereklidir. Aksi takdirde, sıvı numune ızgaralardan forseps arasındaki kılcal kuvvet tarafından emilir olacak. </li><li> 2μl protein örneği parlayan taburcu ızgara uygulayın ve 30 saniye bekleyin. Not: bekleme süresi ve parlaklık deşarj süresini kılavuzunda adsorbe proteinlerin konsantrasyonu etkiler. Çok seyreltilmiş numune uzun adsorpsiyon kez gerektirir. Ancak, uzun süreli adsorpsiyon su buharları beri tampon konsantrasyonu değişebilir. Kılavuzunda uygun bir parçacık dağılımı elde etmek için biraz deneme yanılma yaklaşımı gerektirir. </li><li> Örnek filtre kağıdı kullanarak kurutun. </li><li> Bir su damlası ızgara yüzeyine dokunun ve sonra su filtre kağıdı ile kurulayın. 2. damla su ile tekrarlayın. </li><li> Leke kısaca ilk damlasına kadar ızgara yüzeyine dokunmayın. Filtre kağıdı ile leke çözüm kurutun. </li><li> 20 saniye boyunca leke ikinci damlasına kadar ızgara yüzeyine dokunmayın. Leke ofiltre kağıdı ile ff leke çözüm. </li><li> Izgara bir vakum kullanarak kurutun. Not: Bir bankta ya da kimyasal bir kaput hava kuru ızgaraları da bırakabilirsiniz. Kuru vakum yararına bir EM ızgaraları hemen izleyebilirsiniz. Hızlı kuruyan tarafından üretilen mümkün artifakı leke düzensiz. </li></ol> 5. Geçirimli elektron mikroskobu <ol><li> Bu gösteri kullanılan mikroskop Gatan 4K x 4K CCD kamera ile donatılmış bir Tecnai T12 (FEI Şirketi). </li><li> Kısaca örnek takmadan önce mikroskop hizalama kontrol edin; Not: Bu EM başına sadece bir kez oturum gereklidir. Yakın mükemmel bir uyum bir model mikroskop, daha önce kaydedilmiş olabilir. Böyle bir hizalama dosyasını yükleme mikroskop hizalama mükemmele yakın bir duruma geri yüklemeniz gerekir. </li><li> Tek bir eğim standart numune tutucu EM ızgara yükleyin. </li><li> Tutucu T12 CompuStage içine yerleştirin. Pompalama döngüsünü tamamlamak için bekleyin. </li><li> Sahibine sütuna yerleştirin. &lt;/ Li&gt; <li> Örnek Focus ve istenen bir bulanıklaştırma, genellikle-1.5um ayarlayabilirsiniz. Not: Odaklama minimum kontrast yöntemi kullanılarak elle odaklama veya canlı görüntüleri yakalama ve canlı Fourier güç spektrumu hesaplamak için CCD kamera kullanarak ya da elde edilebilir. </li><li> CCD kamera kullanarak bir görüntü kaydetme; </li><li> Lekeli proteinlerin olumsuz örneklerin görüntüleri, proteinler genellikle beyaz kontrast, yani koyu bir arka plana karşı beyaz yoğunluğu görülür. Not aynı grid farklı alanlarda protein konsantrasyonları genellikle oldukça benzer iken, aynı grid farklı alanlarda bir leke farklı düzeylerde gözlemleyebilirsiniz yaptığı. Bazen diğer bazı alanlarda ise mükemmel bir leke alanları, düzensiz boyama ya da pozitif boyanma (protein hafif bir arka plan üzerinde koyu görünüyor) olabilir. Genellikle, görüntüleme için iyi bir alan bulmak için kılavuz aramak için gerekli. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Olumsuz sta tipik iyi görüntü örnekleriincelendiği numuneler, at dalak ferritin (Şekil 4A), Fab (Şekil 4B), arke 20S proteazom (Şekil 4C) ve nucleosome (Şekil 4D), gösterilmiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig1.jpg" /> Şekil 1. EM ızgaraları kolloidon film yüzeyinde kapalı bir ambalaj desen tek-bir yerleştirme A) negatif karbon kaplı ızgaraları hazırlanması EM leke. B) ızgaraları alanında biraz daha büyük bir kağıt parçası yerleştirme. C) kağıt tamamen ıslanması kadar bekleyin. D) kurutmak için hava ızgaraları ile birlikte kağıt Pick up. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig2.jpg" /> Şekil 2. Bir nokta ucu sivriltilmiş bir çubuk (solda), kaplama aparat yer iki karbon çubuklar: karbon ile kaplanması EM ızgaraları A) karbon evaporatör Kur. Diğer çubuk (sağda), düz bir yüzeye sahiptir ve tam tersi bir noktaya ucu ile temaside. B) beslenen bir cam slayt bir tarafında küçük bir miktar vakum gres yağı koyun. Siyah çerçeve içinde vakum gres vardır. C) kaplama ızgaraları Kur. Cam slaytlar kağıdı konumda tutmak için kullanılır. Ok ucu vakum gres ile alan işaret ediyor. D) kaplama tamamlandıktan sonra, kapalı vakum gres ile slayt renk renk değiştirmez. Kontrast kaplı karbon kalınlığı gösterir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig3.jpg" /> Şekil 3. Negatif boyama prosedürü gösteren A) Taze hazırlanmış (sol) uranil format çözüm Çökelek işareti olmadan şeffaf. 1 ~ 2 hafta sonra, tüpün alt alt biriken çökeltiler. B) Yer distile su ve bir parça parafilm uranil format çözüm iki damla iki damla (~ 25μl). Karbon yüzü parlayan bir taburcu karbon kaplı EM ızgara tutmak için anti-kapiller forseps bir çift kullanınkadar. Bir damla örnek (~ 2μl) kılavuzunda yer almaktadır. C) 30 saniye bekledikten sonra, bir filtre kağıdı ile çözüm kurulayın. D) ilk damla su ile ızgara örnek tarafında dokunmatik ızgara çevirin. Boyanma işlemi tamamlamak için adım C ve D tekrarlayın. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3227/3227fig4.jpg" /> Şekil 4. Antijen bağlama (Fab), C olumsuz lekeli protein örnekleri EM görüntü örnekleri. A) At dalak ferritin, B) fragman) arke 20S proteazom ve D) nucleosome. Tüm görüntüler de aynı büyütme ile kaydedildi. Ölçekleme çubuğu 20nm.

<ol>
	<li>Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advent+of+near-atomic+resolution+in+single-particle+electron+microscopy.">The advent of near-atomic resolution in single-particle electron microscopy.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 723-742 (2009).</li><li>Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-atomic+resolution+reconstructions+of+icosahedral+viruses+from+electron+cryo-microscopy.">Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 21 (2), 265-273 (2011).</li><li>Zhou, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+resolution+cryo+electron+microscopy+of+macromolecular+complexes.">Atomic resolution cryo electron microscopy of macromolecular complexes.</a> Adv. Protein Chem. Struct. Biol. 82, 1-35 (2011).</li><li>Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+viruses.">Cryo-electron microscopy of viruses.</a> Nature. 308 (5954), 32-36 (1984).</li><li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Staining+and+Image+Classification+-+Powerful+Tools+in+Modern+Electron+Microscopy.">Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy.</a> Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).</li><li>Rabl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+gate+opening+in+the+20S+proteasome+by+the+proteasomal+ATPases.">Mechanism of gate opening in the 20S proteasome by the proteasomal ATPases.</a> Mol. Cell. 30 (3), 360-368 (2008).</li><li>Zhao, F. Q., Craig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+time-resolved+changes+in+molecular+structure+by+negative+staining.">Capturing time-resolved changes in molecular structure by negative staining.</a> J. Struct. Biol. 141 (1), 43-52 (2003).</li><li>Radermacher, M., Wagenknecht, T., Verschoor, A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+from+a+single-exposure,+random+conical+tilt+series+applied+to+the+50S+ribosomal+subunit+of+Escherichia+coli.">Three-dimensional reconstruction from a single-exposure, random conical tilt series applied to the 50S ribosomal subunit of Escherichia coli.</a> J. Microsc. 146 (Pt. 2), 113-136 (1987).</li><li>Zhao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+conditions+of+human+leukotriene+C4+synthase+requiring+adjustment+of+a+particularly+large+combination+of+specific+parameters.">Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring adjustment of a particularly large combination of specific parameters.</a> J. Struct. Biol. 169 (3), 450-454 (2010).</li><li>Nishida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+leukocyte+beta2+integrins+by+conversion+from+bent+to+extended+conformations.">Activation of leukocyte beta2 integrins by conversion from bent to extended conformations.</a> Immunity. 25 (4), 583-594 (2006).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Leke Negatif EM rastgele konik tenteli, aynı bölgede örnek bir 60 ° eğik ve bir görüntü bir çift toplama yöntemi, 8, saflaştırılmış protein örneklerinin 3D yapıları, çalışma için kullanılan güçlü bir araçtır ancak makromoleküler kompleksleri 3D rekonstrüksiyonlar hesaplamak için untilted. Buna ek olarak, negatif boyama EM, 10, ya da sadece homojenlik ve / veya bu nedenle saflaştırılmış proteinler örnek heterojenite görselleştirmek için farklı konformasyonlar protein kompleksleri görselleştirme zarı proteinleri 9, iki boyutlu (2D) kristaller için tarama gibi diğer birçok uygulama var. Protein saflaştırma yöntemleri geliştirmek için geri bildirimler sağlanması, vb biyokimyacılar için güçlü bir tahlil edilebilir. Bu makalede, biz karbon kaplı ızgaraları bir elektron mikroskop görüntüleri olumsuz lekeli protein örnekleri toplamaya hazırlanıyor kadar uzanan protokoller sundu. Burada gösterildiği gibi,prosedürü takip etmek oldukça basit ve kolay. Eğer rastgele konik eğim yöntemi tarafından gözlemlenen örnek 3D rekonstrüksiyonlar hesaplamak için çalışırken, tilt çifti görüntüleri elde etmek için gereklidir. Ancak, tek parçacık analizi yapmak amacı ise, birden fazla untilted görüntüler yeterli olacaktır. Her iki durumda da, daha fazla görüntü işleme gereklidir ve bu bu video makalenin kapsamı dışındadır. Herhangi bir yöntem olduğu gibi, protokoller çeşitleri vardır. Uranil format, çoğu durumda olumsuz bir leke reaktif olarak çok iyi çalışıyor. Uranil asetat yaygın olarak kullanılan başka bir olumsuz leke reaktif. Uranil format olarak çok benzer çalışır, ancak birçok durumda daha büyük bir tane boyutu ve uranil format daha düşük kontrast. Uranil asetat kullanmanın avantajı çözüm uranil format daha uzun sürer. Bir taze bir çözüm hazırlamak için her bir ya da iki hafta bir ihtiyacı yoktur. Uranil format ve asetat asidiktir. Bariz bir endişe olduğunudüşük pH, protein örnek çalışılan değişikliklere neden olabilir. Her iki leke çözümleri aynı zamanda protein fiksatif olarak işlev görür. Daha önceki bir çalışmada her ikisinin de düzeltme protein örneklerinin hızla 7 göstermiştir. Bu hızlı fiksasyonu düşük pH daha az önemli hale getirmektedir. Düşük pH herhangi bir değişiklik neden önce boyanma işlemi sırasında, sabit bir protein örnek olur. Bununla birlikte, amonyum molibdat ve fosfotungstik asit gibi diğer olumsuz leke reaktifler, düşük pH bir endişe 7 boyama örnekleri için daha iyi sonuçlar verebilir. Amonyum molibdat ve fosfotungstik asit yaklaşık nötr pH var, ama bu lekeleri tarafından oluşturulan protein örneklerinin kontrast genellikle uranil format aşağı.

<table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Kolodyum </td><td> Elektron Mikroskopi Bilimleri, PA, USA </td><td> 12620-30 </td><td> Amil asetat 30ml,% 2 </td></tr><tr><td> Gilder Cu ızgaraları </td><td> Ted Pella, Inc, USA </td><td> G400/G200 </td><td> 400/200 örgü </td></tr><tr><td> Cressington 208C Yüksek Vakum Turbo Karbon Kaplayıcı&#39;ya </td><td> Ted Pella, Inc, USA </td><td> 9260 </td><td></td></tr><tr><td> Çift Karbon çubuk işaret </td><td> Ted Pella, Inc, USA </td><td> 58 </td><td></td></tr><tr><td> Uranil format </td><td> Elektron Mikroskopi Bilimleri, PA, USA </td><td> 16984-59-1 </td><td> % 99.9 saflıkta </td></tr><tr><td> PELCO easiGlow GlowDischarge sistemi </td><td> Ted Pella, Inc, USA </td><td> 91000 </td><td> Yerel eczaneden satın alma </td></tr><tr><td> Whatman # 1 Filtre kağıdı </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-805E </td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain em: from grid preparation to image acquisition

Tek parçacık hem de negatif boyanmış veya dondurulmuş sulu biyolojik örnekler elektron mikroskobu (EM), yapısal biyoloji 1 çok yönlü bir araç haline gelmiştir. Son yıllarda bu yöntem, proteinler ve makromoleküler kompleksleri 2, 3 yapıları inceleyerek büyük bir başarı elde etti. Dondurulmuş sulu protein örneklerinin vitreus buz 4 ince bir tabaka içine gömülü olduğu elektron cryomicroscopy (cryoEM) ile karşılaştırıldığında, negatif boyama, protein örneklerinin artırmak için ince bir tabaka kuru ağır metal tuzu gömülü olduğu basit bir örnek hazırlama yöntemi örnek kontrast 5. Negatif leke gelişmiş kontrast EM nispeten küçük biyolojik örneklerin incelenmesi sağlar. Saflaştırılmış protein ya da protein kompleksleri 6 üç boyutlu (3D) yapısını belirlemenin yanı sıra, bu yöntem çok daha geniş amaçlar için kullanılabilir. Örneğin, negatif EM saflaştırılmış görselleştirmek için kolaylıkla kullanılabilir lekeprotein örneklerinin, bilgi edinme, örnek homojenlik / heterojenliği, protein kompleksleri veya büyük meclislerinin oluşumu, ya da sadece bir protein hazırlık kalitesini değerlendirmek için gibi. Bu video makalede, 120kV hızlandırma gerilimi işletilen bir elektron mikroskobu, olumsuz lekeli örnek görüntüleri alan EM leke negatif karbon kaplı ızgaraları hazırlanırken, olumsuz lekeli protein örneği gözlemlemek için bir EM kullanımı için eksiksiz bir protokol mevcut. Bu protokoller, laboratuvarda rutin olarak kullanılan ve acemi kullanıcılar tarafından kolayca takip edilebilir.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition at JoVE.com

Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Protein örneklerinin negatif leke elektron mikroskobu (EM) tarafından görselleştirme popüler bir yapısal analiz yöntemi haline gelmiştir. Ayrıca protein preparatları kalitesi kalitatif olarak incelenmesi için çalışılan moleküllerin 3 boyutlu rekonstrüksiyon hesaplanırken gibi, nicel yapısal analizi için yararlı olur ve. Biz bu makalede, EM ızgaraları hazırlanması, numune boyama ve örnek bir elektron mikroskobu görselleştirmek için ayrıntılı protokoller mevcut. Acemi kullanıcılar, kolayca bu protokolleri uygulayın ve protein örneklerinin değerlendirilmesi için olumsuz, diğer biyokimyasal testlerin yanı sıra, rutin bir tahlil olarak EM leke yararlanmak için.

Negatif Leke EM, Proteinler ve makromoleküler kompleksler görselleştirme: Izgara Hazırlık Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

visualizing-proteins-macromolecular-complexes-negative-stain-em-from

Research

JoVE Journal

Bioengineering

58.3K Görüntüleme.  University of California San Francisco. Protein örneklerinin negatif leke elektron mikroskobu (EM) tarafından görselleştirme popüler bir yapısal analiz yöntemi haline gelmiştir. Ayrıca protein preparatları kalitesi kalitatif olarak incelenmesi için çalışılan moleküllerin 3 boyutlu rekonstrüksiyon hesaplanırken gibi, nicel yapısal analizi için yararlı olur ve. Biz bu makalede, EM ızgaraları hazırlanması, numune boyama ve örnek bir elektron mikroskobu görselleştirmek için ayrıntılı...

Video: Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Sulu İki fazlı sistemler kullanma Hücre Co-kültür desenlendirme

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Biyomühendislik

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their extracellular matrix (ECM) environment. Eukaryotic cells constantly sense their local microenvironment through surface mechanosensors to transduce physical changes of ECM into biochemical signals, and integrate these signals to achieve specific changes in gene expression. Interestingly, physicochemical and mechanical parameters of the ECM can couple with each other to regulate cell fate. Therefore, a key to understanding mechanotransduction is to decouple the relative contribution of ECM cues on cellular functions.
Here we present a detailed experimental protocol to rapidly and easily generate biologically relevant hydrogels for the independent tuning of mechanotransduction cues in vitro. We chemically modified polyacrylamide hydrogels (PAAm) to surmount their intrinsically non-adhesive properties by incorporating hydroxyl-functionalized acrylamide monomers during the polymerization. We obtained a novel PAAm hydrogel, called hydroxy-PAAm, which permits immobilization of any desired nature of ECM proteins. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing allows to independently control the morphology of single-cells, the matrix stiffness, the nature and the density of ECM proteins. We provide a simple and rapid method that can be set up in every biology lab to study in vitro cell mechanotransduction processes. We validate this novel two-dimensional platform by conducting experiments on endothelial cells that demonstrate a mechanical coupling between ECM stiffness and the nucleus.

We present a new polyacrylamide hydrogel, called hydroxy-PAAm, that allows a direct binding of ECM proteins with minimal cost or expertise. The combination of hydroxy-PAAm hydrogels with microcontact printing facilitates independent control of many cues of the natural cell microenvironment for studying cellular mechanostransduction.

Mechanotransduction Cues Etkileri Ayırma için Hidroksi-PAAm Hidrojeller hazırlanması

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

Geliştirilmesi 2D ve 3D Cilt<em&gt; İn Vitro</emMakromoleküler Dışlamasını Kullanma&gt; Modeller

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach recently explored for the development of autologous replacements involves the differentiation of stem cells into chondrocytes. To initiate this chondrogenesis, a degree of compaction of the stem cells is required; hence, we demonstrated the feasibility of magnetically condensing cells, both within thick scaffolds and scaffold-free, using miniaturized magnetic field sources as cell attractors. This magnetic approach was also used to guide aggregate fusion and to build scaffold-free, organized, three-dimensional (3D) tissues several millimeters in size. In addition to having an enhanced size, the tissue formed by magnetic-driven fusion presented a significant increase in the expression of collagen II, and a similar trend was observed for aggrecan expression. As the native cartilage was subjected to forces that influenced its 3D structure, dynamic maturation was also performed. A bioreactor that provides mechanical stimuli was used to culture the magnetically seeded scaffolds over a 21-day period. Bioreactor maturation largely improved chondrogenesis into the cellularized scaffolds; the extracellular matrix obtained under these conditions was rich in collagen II and aggrecan. This work outlines the innovative potential of magnetic condensation of labeled stem cells and dynamic maturation in a bioreactor for improved chondrogenic differentiation, both scaffold-free and within polysaccharide scaffolds.

Chondrogenesis from stem cells requires fine tuning the culture conditions. Here, we present a magnetic approach for condensing cells, an essential step to initiate chondrogenesis. In addition, we show that dynamic maturation in a bioreactor applies mechanical stimulation to the cellular constructs and enhances cartilaginous extracellular matrix production.

Kıkırdak Yenileme için 3D Manyetik Kök Hücre Toplama ve Biyoreaktör Olgunlaşma

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Hücreleri tarafından seçilmiş adezyon oluşumunda görselleştirme gelişmiş Disk-toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Nano-formülasyonları endotoksin tespiti Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) deneyleri kullanarak

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Preparation and Characterization of Nanoliposomes for the Entrapment of Bioactive Hydrophilic Globular Proteins

Liposome nanocapsules have been applied for many purposes in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries. Attributes of liposomes include their biocompatibility, biodegradability, non-immunogenicity, non-toxicity, and ability to entrap both hydrophilic and hydrophobic compounds. The classical hydration of thin lipid films in an organic solvent is applied herein as a technique to encapsulate tarin, a plant lectin, in nanoliposomes. Nanoliposome size, stability, entrapment efficiency, and morphological characterization are described in detail. The nanoliposomes are prepared using 1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt; DSPE-MPEG 2000), and cholesterylhemisuccinate (CHEMS) as the main constituents. Lipids are first dissolved in chloroform to obtain a thin lipid film that is subsequently rehydrated in ammonium sulfate solution containing the protein to be entrapped and incubated overnight. Then, sonication and extrusion techniques are applied to generate nanosized unilamellar vesicles. The size and polydispersity index of the nanovesicles are determined by dynamic light scattering, while nanovesicle morphology is assessed by scanning electron microscopy. Entrapment efficiency is determined by the ratio of the amount of unencapsulated protein to original amount of initially loaded protein. Homogeneous liposomes are obtained with an average size of 155 nm and polydispersity index value of 0.168. A high entrapment efficiency of 83% is achieved.

This study describes classical hydration using the thin lipid film method for nanoliposome preparation followed by nanoparticle characterization. A 47 kDa-hydrophilic and globular protein, tarin, is successfully encapsulated as a strategy to improve stability, avoid fast clearance, and promote controlled release. The method can be adapted to hydrophobic molecules encapsulation.

Biyoaktif Hidrofilik Globüler Proteinlerin Tuzakları Için Nanoliposomes Hazırlanması ve Karakterizasyonu

Liposome nanocapsules have been applied for many purposes in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries. Attributes of liposomes include their ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol applies a macromolecular crowding (MMC) technique to mimic this physiological crowding through the addition of neutral polymers (crowders) to cell cultures in vitro. Previous studies using Ficoll or dextran as crowders demonstrate that the expression of collagen I and fibronectin in WI38 and WS-1 cell lines are significantly enhanced using the MMC technique. However, this technique has not been validated in primary hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts (hHSFs). As hypertrophic scarring arises from the excessive deposition of collagen, this protocol aims to construct a collagen-rich in vitro hypertrophic scar model by applying the MMC technique with hHSFs. This optimized MMC model has been shown to possess more similarities with in vivo scar tissue compared to traditional 2-dimensional (2-D) cell culture systems. In addition, it is cost-effective, time-efficient, and ethically desirable compared to animal models. Therefore, the optimized model reported here offers an advanced &#8220;in vivo-like&#8221; model for hypertrophic scar-related studies.

This protocol describes the use of macromolecular crowding to create an in vitro human hypertrophic scar tissue model that resembles in vivo conditions. When cultivated in a crowded macromolecular environment, human skin fibroblasts exhibit phenotypes, biochemistry, physiology, and functional characteristics resembling scar tissue.

Makromoleküler Kalabalık Kullanılarak İnsan Kutanöz Hipertrofik YaraNın In Vitro Modeli

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Using Magnetometry to Monitor Cellular Incorporation and Subsequent Biodegradation of Chemically Synthetized Iron Oxide Nanoparticles

Magnetic nanoparticles, made of iron oxide, present a peculiar interest for a wide range of biomedical applications for which they are often internalized in cells and then left within. One challenge is to assess their fate in the intracellular environment with reliable and precise methodologies. Herein, we introduce the use of the vibrating sample magnetometer (VSM) to precisely quantify the integrity of magnetic nanoparticles within cells by measuring their magnetic moment. Stem cells are first labeled with two types of magnetic nanoparticles; the nanoparticles have the same core produced via a fast and efficient microwave-based nonaqueous sol gel synthesis and differ in their coating: the commonly used citric acid molecule is compared to polyacrylic acid. The formation of 3D cell-spheroids is then achieved via centrifugation and the magnetic moment of these spheroids is measured at different times with the VSM. The obtained moment is a direct fingerprint of the nanoparticles&#8217; integrity, with decreasing values indicative of a nanoparticle degradation. For both nanoparticles, the magnetic moment decreases over culture time revealing their biodegradation. A protective effect of the polyacrylic acid coating is also shown, when compared to citric acid.

Iron oxide nanoparticles are synthesized via a nonaqueous sol gel procedure and coated with anionic short molecules or polymer. The use of magnetometry for monitoring the incorporation and biotransformations of magnetic nanoparticles inside human stem cells is demonstrated using a vibrating sample magnetometer (VSM).

Hücresel Kuruluş ve Daha Sonra Kimyasal Synthetized Demir Oksit Nanopartiküllerinin Biyobozunurluğunu İzlemek için ManyetometriNin Kullanılması

Magnetic nanoparticles, made of iron oxide, present a peculiar interest for a wide range of biomedical applications for which they are often internalized ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...