Tek parçacıklı kriyo-EM analizi, yapısal biyoloğun alet kutusunda membran proteinleri, amiloid fibriller, nükleik asit bağlayıcı proteinler ve virüsler dahil olmak üzere çok çeşitli örnekler için geçerli rutin bir teknik haline gelmiştir. Numune hazırlığı tamamlandıktan ve ızgaralar mikroskop içine yüklendikten sonra, Astbury Biyoyapı Laboratuvarı ve eBIC gibi birçok kriyo-EM tesisinde veri toplama uzaktan gerçekleştirilebilir. Başarılı yapı belirlemenin önündeki büyük engeller genellikle bu işlem boyunca bazen gerekli olan birden fazla yineleme ile numune hazırlama ve ızgara tarama aşamalarında yatmaktadır.
Burada, uzaktan ızgara tarama ve tek parçacıklı veri toplamayı göstereceğiz. Mikroskop kullanıcı arabiriminin otomatik yükleyici sekmesinde, oku kullanarak seçenekler iletişim kutusunu sekmeyin ve envanter düğmesine basın. Bu, bir kartuş olup olmadığını belirlemek için kasetteki her konumu sırayla kontrol eder.
Envanter her yuvada sırayla çalışacaktır. Tüm dolu yuvalar eşlendiğinde, envanter durur. Mikroskop sütununa aktarılacak ızgarayı vurgulayın ve yükle'yi tıklatın.
Yuva etiketi, ızgara sahne alanına başarıyla yüklendikten sonra maviden sarıya döner. Izgaraları taramak için EPU yazılımını açın. Hazırlık sayfasında, alım optiklerini ve ayarlarını seçin, ardından açılır menüden atlas hazır ayarını seçin.
Uygun ışın ayarı hazır ayarlarını seçin ve parametreleri mikroskopa itmek için sete basın. Kolon vanalarını açmak ve grip ekranını takmak için basın. Bir ışının görünür ve yeterince yayılmış ve dedektörü kaplayacak şekilde ortalanmış olup olmadığını kontrol edin.
Gerekirse, X ve Y'deki sahne hareketlerini kontrol etmek için joystick veya sanal el panellerini kullanarak ızgaranın daha ince bir bölgesine gidin.Grip ekranını kaldırın ve EPU'daki önizleme düğmesini kullanarak görüntü alın. EPU'da atlas sayfasına gidin ve yeni oturuma basın. MRC görüntü biçimini seçin ve tarama oturumunu kaydetmek için uygun bir klasör adı ve konumu girin, ardından Uygula'yı tıklatın.
Soldaki menüden taramayı seçin. Atlas montajının alınması için her ızgaranın yanındaki onay kutularını işaretleyin, ardından EPU'da tarama oturumunu başlatın. İşaretli her ızgara için bir atlas elde edilir ve tamamlandığında kullanılabilir ızgara kareleri listelenir.
Her atlas, tarama sayfasında vurgulanarak görüntülenebilir. İşiniz bittiğinde, toplanan atlasları gözden geçirin ve numune kalitesini daha yüksek büyütmelerde değerlendirmeye uygun ızgaraları tanımlayın. EPU tarama menüsünde seçilen ızgarayı vurgulayın ve yükleme örneğini tıklatın.
Atlas tarama menüsünden, şu anda yüklü olan ızgarayı seçin ve ızgara görüntüsünde istenen konumu sağ tıklatıp burada taşıma aşamasını seçerek sahneyi doldurulmuş delikleri içeren bir ızgara karesine taşıyın. EPU hazırlık sayfasına dönün ve ızgara kare hazır ayarını seçin. EPU otomatik işlevler sayfasını açın ve örneği ösantrik yüksekliğe taşımak için ızgara kare hazır ayarıyla sahne eğimine göre otomatik ötenek çalıştırın.
EPU hazırlığında, yeni bir ızgara kare önizleme görüntüsü alın. Farklı buz kalınlıklarını gösteren farklı deliklerdeki gri değerlere dikkat edin. Sağ tıklatıp buraya taşıyarak sahneyi bir deliğin üzerine taşıyın.
Delik veya ötenatrik yükseklik hazır ayarını seçin ve önizleme'yi tıklatın. Veri toplama hazır ayarını seçin ve parçacıkların kolayca tanımlanmasını sağlayan bir büyütme ayarlayın. Defokus uzaklığını negatif üç ila beş mikrometreye ayarlayın.
Izgara boyunca parçacık dağılımı, yönlendirme ve kirlenme için bir dizi buz kalınlığını yeniden değerlendirmek için adımlarla yineleyin. Mikroskop kullanılabilirliğine bağlı olarak, doğrudan veri toplamaya devam edin veya ızgaralar diğer siteler de dahil olmak üzere gelecekteki koleksiyon için mikroskoptan kaldırılabilir. Atlas ayarlarını ayarlayarak ve atlası almak için ızgarayı seçerek taramadan kullanılamayan bir atlas toplayın.
Atlası alın ve çıktıyı görmek için ızgara konumuna tıklayın. Atlas tamamlandıktan sonra, ışın ayarı ön ayarlarının her birini projenin deneysel ihtiyaçlarına göre tanımlayın. Görüntü kaydırma kalibrasyonları gerçekleştirin.
EPU sayfa oturumu kurulumunu seçip tercihlerden yeni oturum veya yeni oturum seçerek EPU oturumunu ayarlayın. Yeni oturumu seçtikten sonra, önceki ayarları kullanma seçeneği sunan bir açılır pencere görünecektir. Ayarlar öncekinden geçerli EPU oturumuna otomatik olarak yüklenir.
Alternatif olarak, tercihlerden yenisini seçin ve bu bilgileri geçerli EPU'ya önceden yüklemek için kaydedilmiş tercihlere sahip bir dosya seçin. Oturum adını bilgilendirici bir şeyle doldurun. Türde, el ile seçin.
Edinme modu için, sapmasız görüntü kaydırma koleksiyonu mevcutsa ve isteniyorsa doğru delik merkezileme veya daha hızlı edinme seçin. İstediğiniz görüntü biçimini seçin, sonra depolama klasörünü seçin ve EPU oturum adıyla bir dizin oluşturacaktır. Hangi ızgara deliği aralığının kullanıldığına göre uygun ızgarayı seçin ve uygula tuşuna basın.
İlk kılavuz karesini seçin ve bir edinme şablonu ayarlayın. Kare seçime gidin. Tüm kareler yeşilse, sol üstteki tümünün seçimini kaldır'ı tıklatın.
Kutucukları sağ tıklatıp açık kutucuğu seçerek açın. Seç'i tıklatıp, sonra sağ tıklatıp sahneyi kılavuz karesine taşı'yı seçerek kılavuz karesi ekleyin veya seçin. Delik seçimine gidin ve otomatik ötenaziye basın.
Izgara kare görüntüsü çekilene kadar bekleyin. Otomatik işlev başarısız olursa, bunun nedeni yüksekliğin önemli ölçüde kapalı olması olabilir. Izgara kare büyütmede grip ekranı kullanılarak manuel olarak ayarlanabilir.
Delik boyutunu ölçmek için sarı daireleri hareket ettirip doğru boyut ve aralıkla deliklerin üzerinde olacak şekilde ayarlayın. Delikleri bul tuşuna basın. Deliklerin doğru bulunarak bulunanın.
Değilse, delik boyutunu değiştirin ve delikleri tekrar bulun tuşuna basın. Bu işlem sürekli olarak başarısız olursa, ızgara kare büyütmede daha düşük bir sayıya veya daha parlak nokta boyutuna geçmeyi düşünün. Delik seçimini ayarlamak için sağdaki filtre buz kalitesi histogramını kullanın.
Bu, kalın buz ve ince buz içeren alanları dışlamak için yararlı olabilir. Bu, oturum sırasında seçilen gelecekteki ızgara kareleri için hatırlanır. Üstteki seçme menüsündeki araçlarla delik seçimini optimize edin.
Örneğin, kılavuz çubuğuna yakın delikleri kaldır'ı tıklatın. Şablon tanımına gidin ve acquire tuşuna basın. Bul'u tıklatın ve deliği ortala.
Sahne kaymasından sonraki gecikmeyi ve görüntü kaydırma sürelerinden sonra gecikmeyi bir ila beş saniyeye değiştirin, ardından varsa maksimum görüntü kaydırma değerinin istenildiği gibi olduğunu kontrol edin. Edinme alanı ekle'yi tıklatın ve görüntünün herhangi bir yerine tıklayın. Edinme alanını istediğiniz konuma taşıyın.
Sağ üstteki netleme aralığını ekleyin. Bir membran protein projesi için tipik bir defokus listesi negatif 0,8 ila negatif üç mikrometre defokus, daha sonra diğer alım alanlarını ekleyin, satın alma alanlarının ışınla iki kat açığa çıkmasın diye düzenleyin. Otomatik odaklama alanı ekle'yi tıklatın ve görüntünün herhangi bir yerine tıklayın.
Otomatik odaklama alanını bir deliği çevreleyen karbona taşıyın. Standart uygulama, AFIS kullanırken veya karedeki Z yüksekliği varyasyonuna bağlı olarak her beş ila 15 mikrometrede bir ortalamadan sonra otomatik odaklamaktır. Sürüklenme ölçüm alanı ekle'yi tıklatın.
Standart ayar olarak saniyede 0,05 nanometrelik bir eşik ile ızgara karesi başına bir kez drift ölçümü gerçekleştirilir. Sürüklenme ölçüm alanı doğrudan otomatik odaklama alanıyla çakıtabilir. Ne sürüklenme ne de otomatik odaklama alanının bir alım alanıyla çakışmadığından emin olun.
Kare seçime geri dönün ve ızgarada edinme için kareleri seçin. Kaç toplama alanı gerektiğini tahmin etmek için toplama alanlarının sayısını ve beklenen veri toplama oranını kullanın. İstenen tüm kareler seçildiğinde, tüm kareleri hazırla'ya basın.
Her kare toplandıktan sonra ızgara kareleri arasında gezinin ve seçim fırçasını kullanarak deliklere ince ayar yapın. Numunenin üzerinde bir sahne yerine geçin ve ötenatrik yüksekliği ayarlamak için otomatik işlevleri kullanın. Daha önce ve metinde açıklandığı gibi mikroskop yazılımını kullanarak mikroskop hizalamaları gerçekleştirin.
Objektif diyaframı yeniden takıp ortalamadan ve objektif lens astigmatizmasını EPU ile düzeltmeden önce otomatik işlevler içinde koma serbest hizalama gerçekleştirin. Her iki hizalamanın da uygun değerler üzerinde yakınsamasını sağlayın. Otomatik alım çalıştırmasına başlamadan önce, otomatik yükleyici turbo pompasının kapalı olduğundan ve gerekirse objektif diyaframın takıldığından emin olun.
Otomatik toplamada, otomatik veri alımını başlatmak için çalıştırmaya başlayın. Bu protokol kullanılarak, kırık veya kuru ızgaralar atlas aşamasında taranabilir ve atılabilir. Izgaraların çoğunda bir buz gradyanı görülür.
Tarama sırasında, ideal bir parçacık dağılımı, bir dizi parçacık yönelimi görülebilen monodispersed edilir. Buz çok inceyse, elektron ışını ile aydınlatıldığında eriyebilir ve mikrografide aşırı harekete neden olabilir. Bu en sık tamponda deterjan olduğunda görülür.
Buzun vitreus olması gerekiyor, bu yüzden görüntülerin çoğunun kristal buzun dışlandığı ızgara alanları. Mikrografi kalitesini değerlendirmek ve veri toplama değişikliklerinin gerekip gerek olmadığına karar vermek için verilerin grafiksel özeti dahil edildi. crYOLO gibi parçacık seçiciler, verilerin ilk geçişi için yeterince iyi çalışır ve 2D sınıf ortalamasına ilerlemeyi sağlar.
İkincil yapı detayını gösteren sınıflar 3D analiz için seçilmeli, önemsiz parçacıklar ise atılmalıdır. Parçacıkların bir alt kümesi, 3B sınıflandırma ve iyileştirme için bir başlangıç modeli oluşturmak için kullanılabilir. RagAB durumunda, veri kümesi 3D sınıflandırma sırasında ayrılabilen üç farklı konformatör içeriyordu.
Veri toplama ve sonraki görüntü analizi adımlarındaki başarının, tarama aşamasında iyi optimize edilmiş ızgaraların elde edilmesine ve tanımlanmasına bağlı olduğunu hatırlamak önemlidir. Bir 3D EM yoğunluk haritası elde edildikten sonra, bir protein modelinin takılması ve rafine edilmesi veya atomik bir model de novo inşa edilmesi yoluyla daha fazla yorumlanabilir. Cryo-EM tek parçacık analizi, daha önce mümkün olmayan birçok hedefin yapılandırılmış olarak belirlenmesini sağlar.
Özellikle, bu iş akışları son zamanlarda COVID-19 ile ilgili makromoleküllerin yapılarını çözmek için kullanılmıştır.
