Bu çalışma, İskoç Finansman Konseyi (Hibe Numarası HR07005 tarafından kısmen <a href="http://www.sfc.ac.uk/">desteklenen</a> http://www.sfc.ac.uk/, Tıbbi Araştırma İskoçya ( <a href="http://www.medicalresearchscotland.org.uk/">)</a> http://www.medicalresearchscotland.org.uk/), Kanser Research UK Deneysel Tıp Kanser Merkezi ( <a href="http://www.cancerresearchuk.org/">http://www.cancerresearchuk.org/</a> ) ve Atılım Meme Kanseri ( <a href="http://breakthrough.org.uk/">http://breakthrough.org.uk/</a> ).

1. Doku hazırlanması <ol class="lalpha"><li> Microtomy <ol class="lroman"><li> Bölüm formalin sabit parafin döner mikrotom kullanarak 4 mikron kalınlığında tümör bloklar gömülü. </li><li> Pozitif yüklü mikroskobik Slaytlarınıza bölümleri yerleştirin. </li><li> 37 ° C fırında gecede slaytlar inkübe edin. </li></ol></li><li> Depolama <ol><li> Mağaza bölümlerinde -18 ° C -25 ° C derin dondurucu, antijenik kaybını önlemek için. </li></ol></li></ol> 2. Doku kesitlerinde immünofloresan <ol class="lalpha"><li> Dewaxing ve rehidrasyon <ol class="lroman"><li> Mumunu gidermek için iki kez 5 dakika ksilen slaytlar. </li><li> % 99,% 99,% 80,% 50 etanol ve musluk suyu için her 2 dakika süreyle çalışan slaytlar rehidrate. </li></ol></li><li> Antijen Alma <ol class="lroman"><li> 0.15 mM sodyum sitrat, pH 6.0 tamponu mi 5 dakika için bir düdüklü tencere kullanarak, ısıya bağlı antijen alımı gerçekleştirincrowave. </li><li> 20 dakika için slaytlar serinleyin. </li><li> Rocker 5 dakika için% 0.05 PBST slaytlar durulayın. </li></ol></li><li> Prosedürü Engelleme <ol class="lroman"><li> 10 dakika için% 3 hidrojen peroksit bölümleri davranın. </li><li> Rocker 5 dakika için% 0.05 PBST slaytlar durulayın. </li><li> Sequenza immün rafa bölümleri ekleyin. </li><li> 10 dakika süreyle serum protein blok bölümler davranın. </li></ol></li><li> Primer antikor inkübasyon <ol class="lroman"><li> Oda sıcaklığında 1 saat inkübe İlköğretim antikor Dako antikor seyreltici optimum seyreltme seyreltilir. </li><li> 5 dakika her biri için üç kez PBST% 0.05 durulayın. </li></ol></li><li> Epitel maskesi (sitokeratin) inkübasyon <ol class="lroman"><li> 4 geceleme Dako antikor seyreltici ile 1:50 seyreltilmiş inkübe fare anti-pan sitokeratin ° C. </li></ol></li><li> Epitel maske gösterimi <ol class="lroman"><li> Keçi anti-fare Alexa555 s 1:25 seyreltme hazırlayınön seyreltilmiş econdary antikor keçi tavşan HRP antikor çözüm imgeleyin. Oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca karanlıkta inkübe slaytlar. </li><li> 5min her üç kez PBST% 0.05 durulayın. </li></ol></li><li> Hedef görselleştirme <ol class="lroman"><li> Sequenza nem odasına slaytlar aktarın. </li><li> 01:50 konsantrasyon Hedef sinyal amplifikasyon seyreltici (HistoRx küvet E) ve Cy5 Tyramide (HistoRx tüp F) birleştirin. Vorteks iyice karıştırın. Slaytları oda sıcaklığında 10 dakika süreyle karanlıkta inkübe edin. </li><li> 5 dakika her biri için üç kez PBST% 0.05 durulayın. </li><li> 1 dakika boyunca% 80 etanol slaytlar dehydrate. </li><li> Hava karanlık, kuru kayar. </li></ol></li><li> Counterstaining ve coverslipping <ol class="lroman"><li> DAPI montaj orta lamelleri uygulayın ve doku bölümleri üzerinde lamelleri. </li><li> Karanlık bir gecede Kuru slaytlar. </li><li> Slaytlar oje ile en güvenli, kuruduktan sonraemin uzun vadede korunması ve 4 ° C&#39;de buzdolabında tutun. </li></ol></li></ol> 3. Tüm bölümü tarama kullanarak görüntü yakalama <ol class="lalpha"><li> Aperio ScanScope FL slayt tarayıcı slayt kaset beş slayt yükleyin. </li><li> Her slayt için, görüntü ScanScope Konsol arabirimini kullanarak genel bölgenizi seçin. Ne olursa olsun tüm doku, desen veya diğer gözlemlenebilir yönlerini örnek boyama, slayt kapsayacak şekilde bölgeyi seçin. </li><li> (DAPI Cy3 ve Cy5) her kanal aşağıdaki gibi bir optimum pozlama belirlemek için ScanScope Konsolu&#39;nu kullanarak: <ol class="lroman"><li> Doku sorgulamak için bir bölge seçin - bu alanda, en iyisi, en iyi temsilini sağlamak için doku tümör bölgede olmalıdır. </li><li> ScanScope Console otomatik diyafram özelliğini kullanarak görüntü odaklanma ile birlikte, her bir kanal için önerilen maruz kalma süresi değerlendirmek. </li><li> Işbirliği için her numunenin 3-5 bölgelere kadar üzerinde tekrarlayın.değeri istikrar nfirm. </li></ol></li><li> Her filtre için düz alan düzeltme görüntüleri elde edilecek bir arka plan alanını tanımlamak için, hala slayt dakika muamele bölge içinde henüz uzak doku (ScanScope konsol görüntü üzerinde mavi bir elmas tarafından gösterildiği gibi), ek bir bölge seçin. </li><li> Görüntü elde etme önce bu görüntüleri inceleyin. Görüntüleri, yüksek arka plan veya diğer görüntü eserler görünüyorsa, görüntü bölgeye taşınmış ve yeni görüntüleri elde edilmelidir. </li><li> Elde edilen dijital slayt görüntüleri Aperio Spectrum veritabanına otomatik olarak yüklenir. </li></ol> 4. AQUA otomatik görüntü analizi <ol class="lalpha"><li> Spectrum veritabanı görüntüleme ve dijital tüm slayt görüntüleri, tüm doku ve boyanma paterni (lar) bağlamında tümör ilgi alanlarına açıklama. </li><li> Başparmak çift tıklayarak Spectrum veritabanında dijital slayt listeden AQUAnalysis kullanarak analiz etmek için slaytı seçin.tırnak resim (alternatif olarak, resmin yanındaki onay kutusunu seçin ve ardından seçmek listenin en üstündeki menüden &#39;Görüntüleri&#39;). Bu ImageScope yazılım ve doku örneği renk birleştirilen görüntü otomatik olarak açılır. </li><li> Sunulan araçları kullanarak görüntüyü gitmek için bu yazılımı kullanın. </li><li> Eşlik eden H &amp; E (fiziksel slayt veya açıklamalı bir görüntü ya) kullanarak, floresan görüntü faiz bölgede açıklama. Ilgi birden fazla bölgede, bireysel daire alanlar, tek bir örnek üzerinde seçilebilir. Seçilen bir bölgenin içindeki alanlarda (yani hasarlı doku alanları, fakir histoloji, tümör olmayan alanlarda, moloz vb.) Dışlamak için kullanılan bir &#39;negatif&#39; aracını da vardır. </li><li> Resmin üzerine açıklama katmanındaki (ler) kaydedin. </li><li> Spektrum ana menüye geri dönün ve sadece açıklamalı resmin yanındaki onay kutusunu işaretleyin. Listenin üst kısmında menü şerit &#39;analiz&#39; seçin. </li><li> Analiz penceresinde, sele gelecekct açılan menüden &quot;HistoRx AQUA Analizi&quot;. </li><li> Açıklamaların çoklu katmanlar varsa, analiz için uygun bir katman (lar) seçmek için onay kutularını kullanabilirsiniz. </li><li> &#39;Analiz&#39; düğmesine başlamaya hazır tuşuna basın. </li><li> Bu noktada, Windows görev çubuğunda küçültülmüş bir konsol penceresi görünecektir. Bu görüntü transferi Spectrum veritabanından yerel PC (&#39;çekme&#39; operasyonu) ilerleme gösterecektir. </li><li> Veri transferinden sonra, AQUAnalysis başlatacak. Kullanıcı daha sonra görüntü, gezinmek ve analiz etmek için yazılımın tüm iç fonksiyonları kullanabilirsiniz. </li><li> Spectrum veritabanı görüntü açıklamalı bölge, 512x512 piksel görüntü karoları ayrılır, tek tek atılır, her biri. </li><li> Bu çalışma için, veri kümeleme dayalı bir denetimsiz AQUA puanlama algoritması, 8 kullanılmıştır. Bu algoritma, AQUA puanları aşağıdaki gibi oluşturulur: <ol class="lroman"><li> Pan-sitokeratin görüntü signal arka plan üzerinde eşiklenir ve bu piksel daha sonraki hesaplamalar için kullanılan bir &#39;maske&#39; tümörü tanımlamak için kullanılır. Yüksek ifade pan-sitokeratin piksel tümör hücrelerinin sitoplazmik / nükleer olmayan bölgelerde de tanımlar. </li><li> Nükleer tümör maske içinde DAPI kanal yüksek sinyal Piksel olarak tanımlanır. </li><li> Kümeleme algoritması da DAPI boyama veya sitokeratin ekspresyonu ve nükleer veya sitoplazmik bölmeleri, ya da arka plan kısmen ya da bunları atfetmek girişimleri için düşük yoğunluklu piksel inceler. </li><li> Bir zamanlar tüm pikselleri bir tümör bölme ya da arka plan, hedef protein (ER veya HER2) sinyal yoğunluğu atanır böylece AQUA puanları üreten, her bölmeleri ve bölmelerin boyutunu normalize içinde hesaplanır. </li><li> Yeterli tümör temsil yoktu Görüntüler (le birlikte olanlar tarafından tanımlandığı gibi gol değildiss% 5&#39;inden tümör temsil piksel). Bu bölgeler de &#39;başarısız&#39; olarak adlandırılan bir &#39;Final Sonucu&#39; değer üretmek ve böylece sonraki istatistiksel analizler silinebilir. </li><li> Ayrıca, gözden geçirildikten sonra, bir operatör, örnek veya görüntüleme eserler (örneğin katlanmış doku, enkaz) nedeniyle puanlama için uygun olmayan alanlar tespit, bu alanlardaki puanlama redacted ve &quot;Final Sonucu &#39;&#39; Başarısız &#39;denilen üretti. </li></ol></li><li> AQUA puanlama sonuçları, ilgi, bir bütün doku bölümde örnek içinde bölgede her 512x512 piksel çini ile ilişkili puan tabloları. Bu dosyalar, CSV formatında, daha sonra sonraki istatistiksel analiz için kullanılan olabilir. </li></ol> 5. İstatistiksel Analiz: Tüm istatistiksel analizler SPSS (IBM) <ol><li> Mümkün olan yerlerde, büyük işlemler için, veri manipülasyonlar ve analiz adımları gerçekleştirmek için SPSS sözdizimi kod dosyaları (sps) oluşturmak. Örnek sözdizimi kodu ek dosyaları olarak sağlanır. </li><li&gt; SPSS veri dosyalarını okuyun. Ham veri (örneğin araç belirli parametreler, kullanılan bölmeleri olmayan AQUA skorları) kullanılmayan değişkenler çıkarın. </li><li> Bölgelerde &#39;başarısız&#39; bir &#39;Nihai Sonucu &quot;(yukarıya bakınız) varsa, sayısal analizler onları kaldırır SYSMIS olarak bu değerleri işaretleyin. </li><li> Agrega tüm slaytlar için tüm verileri SPSS formatında tek bir ana veri her bir marker (ER veya HER2). Sonraki tüm hesaplamalar için bu ana dosyasını kullanın. </li><li> ER veya HER2 (bkz. ek sözdizimi dosyaları) veri daha da doğrulanmış ve çeşitliliğin Simpson Endeksleri aşağıdaki gibi hesaplanır: bir SPSS sözdizimi dosya (her bir belirteç için kullanılması <ol class="lroman"><li> Daha önce oluşturulan ayarlamak ana verilerin düzenlenmesini engellemek için, ana analitik bir dosya oluşturun. </li><li> Üretilen ham veri ve görüntü karşı ana verileri doğrulamak. </li><li> AQUA puanları (alanların sayısı, her bir örnek için özet istatistikleri üretmek ortalama puanı, ortalama puanı, Minimum skoru, maksimum puan ve puan örnek için standart sapma). </li><li> Rastgele bir örnek orijinal ham veri çıktı dosyaları karşı sonuçlar ve puan ham görüntü verileri karşı kontrol edin. </li></ol></li><li> Isı haritası görüntüleri (Şekil 2 ve 3 de gösterildiği gibi) oluşturmak için: <ol class="lroman"><li> &#39;Bin&#39; sekiz ayrı seviyeleri AQUA skor verilerini (SPSS &#39;Görsel binning&#39; işlevini kullanarak). ER, nükleer puanları HER2, sitoplazmik puanları kullanılmıştır. </li><li> Her bin edinilebilir durumlarda veri kümesinin tamamını eşit oranda temsil ettiği gibi kutuları türet. </li><li> Sonraki tüm çıkış, &#39;başına bir slayt / örnek&#39; düzeyde olacağını, böylece SPSS &#39;Split File&#39; fonksiyonunu kullanın. </li><li> Tahsis edildi bin içine karşılık gelen bir değere sahip x, y koordinatlarını ve renk (bkz. Şekil 2 ve 3) (512x512 kiremit karşılık gelen) tarafından her bölge çizilir. </li></ol></li><li> Heterojenite puanları üretmek için, kodu bir Simpson oluşturmak için yazılmıştırAQUA puanları kullanarak çeşitliliği indeksi. <ol class="lroman"><li> Burada kullanılan Simpson çeşitlilik indeksi, olarak tanımlanır: <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/3334/3334eq1.jpg" /> N, verilen bir örnek için kullanılan ve n belirli bir grup standardize edilmiş skorlar (aşağıda açıklandığı gibi üretilen) puanları / alanların sayısı puanları / alanların toplam sayıdır. </li></ol></li><li> Ana analitik dosya veri kaynağı için yukarıda açıklanan kullanın. Gösterilen örnekler, tüm ER hesaplamaları, nükleer AQUA puan ve sitoplazmik AQUA skoru kullanılan HER2 hesaplamalar kullanılmıştır. , Her bir örnek / slayt için aşağıdaki hesaplamaları gerçekleştirin. </li><li> Floresans verileri varyans istikrarsızlık tabi olduğundan, bu hata büyüklüğü yoğunluğu ile yayar, tüm AQUA puanları logaritmik (2 tabanında) normalleştirme geçerlidir. </li><li> Ayrıca normalize (log dönüştürülmüş) verileri z (standart) puanları dönüşmek. <ol class="lroman"><li> Z-skoru dönüşüm hesaplanır.s aşağıdaki gibidir: Z = (AQUA puan - bir örnek için tüm puan ortalaması) / standart sapma örnek için puan. Bu sapmaların bir dağıtım merkezi sıfır sapma değeri etrafında puan dağılımı çevirir. </li></ol></li><li> Bin bu Z-skoru değerleri altı grup (-2, -2 - -1, -1 - 0, 0 - 1, 1 - 2&gt; 2). </li><li> Her bin için her bin ve toplam ayrıldı değerlerin sayısını hesaplayın. Her bir dizin için kullanılan altı kutuları değerini hesaplamak için, alanların toplam sayısı ile birlikte, bu değeri kullanın. </li><li> Bu değerlerin toplamı ve çeşitlilik endeksi üretmek için bir çıkarma. </li><li> Çeşitlilik endeksi, belirli bir örnek için ortalama etrafında puan yayılmasının bir göstergesi sağlar. Böylece, daha yüksek endeksleri puan daha geniş yayılması, ya da ifade artış heterojenite göstermektedir. Tersine, alt endeksleri, ifade ölçümü daha az varyasyon ve örnek homojen ifade gösterir. Bu Figür gösterilmiştir.2 ve 3 ler. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: Hedefe yönelik tedavi, tamoksifen ve trastuzumab gibi nispeten düşük toksisite ajanlar, yumurtalık kanseri hastaları için bakım standart değildir. Platin taksan ilk basamak kemoterapi, yumurtalık kanseri 9-13 diğer kemoterapi rejimlerinin daha üstün olduğunu ve başlangıçta hastaların% 70-80 cevap en nüks edecektir ve onların hastalık nedeniyle ölmektedir ise iyi bir kanıt yoktur . Alternatif tedavilere yanıt tahmin olabilir biyobelirteçleri ölçümü, her hasta için bireyselleştirilmiş tedavi seçiminde faydalı olacağını ve hayatta kalan tümör hücrelerinin bir tümörün kemoterapi uygular seçim baskısı bu yana, farklı özelliklere sahip ve tedavi öncesi tümörün ICSI&#39;nin temsil, bu niceleme değişim bu nedenle yararlı olabilir. Biz orde, kemoterapi öncesi ve sonrası yumurtalık kanseri örneklerinde ER ve HER2 ifade heterojenite haritalama yaklaşımı uygulamıştırr nicel ifade değişiklikleri ölçmek ve tedavi öncesi ve sonrası biyomarker ifade arasındaki ilişkiyi nasıl değerlendiriyorsunuz. ER ve HER2 Her ikisi de bireysel tümörler içinde işaretlenmiş heterojenite gösteren ve bazı tümörlerde, tedavi sonrası düşük heterojenite nispeten yüksek heterojenite Simpson indeksi değişiklikleri, azalan Simpson endeks puanları (bkz. Şekil 2 ve 3) tarafından temsil edilen. Bu klonal seçim sitotoksik kemoterapi yanıt oluşur fikrini destekler; daha da önemlisi, bu kanser hastaları için daha iyi tedavi kişiselleştirmek için, kalan nüfusa karşı hedeflenen tedavi kullanılarak istismar olabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig1.jpg" /> Şekil 1 farklı alanlarında aynı yumurtalık kanseri değişken morfolojisi gösteren Hematoksilen ve eozin lekeli fotomikrografı. (A) x40 yüzey elde morfolojisi değişen tümör iki bitişik olan alanlarda gösterir. Yüksek güç manzarası (x20Doku (C) alt kısmında daha homojen eozinofilik sitoplazma ve papiller büyüme deseni 0) iken, hücreleri sitoplazmik takas ve tümör (B) üst kısmında sağlam bir büyüme modeli ile ortaya koymaktadır. Ancak, bu tümör, daha fazla yönetim amaçlı seröz papiller histolojik alt tip olarak sınıflandırılır. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig2.jpg" /> Şekil 2 ER protein ifadesi, sitokeratin pozitif yumurtalık kanseri dokusu heterojenite heatmaps önce (üst panel) ve tedavi sonrası (alt panel). <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig3.jpg" /> Şekil 3 HER2 proteini sitokeratin pozitif yumurtalık kanseri dokusu ifade, önce (üst panel) ve sonrası (alt panel) tedavisi heterojenite heatmaps.

<ol>
	<li>Gutierrez, M. L., Sayagues, J. M., Del Mar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytogenetic+heterogeneity+of+pancreatic+ductal+adenocarcinomas:+identification+of+intratumoral+pathways+of+clonal+evolution.">Cytogenetic heterogeneity of pancreatic ductal adenocarcinomas: identification of intratumoral pathways of clonal evolution.</a> Histopathology. 58, 486-497 (2011).</li><li>Yachida, S., Jones, S., Bozic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer.">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467, 1114-1117 (2010).</li><li>Gutierrez, M. L., Sayagues, J. M., Del Mar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytogenetic+heterogeneity+of+pancreatic+ductal+adenocarcinomas:+identification+of+intratumoral+pathways+of+clonal+evolution.">Cytogenetic heterogeneity of pancreatic ductal adenocarcinomas: identification of intratumoral pathways of clonal evolution.</a> Histopathology. 58, 486-497 (2011).</li><li>Yachida, S., Jones, S., Bozic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer.">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467, 1114-1117 (2010).</li><li>Liu, J., Lau, S. K., Varma, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mapping+of+tumor+heterogeneity+on+clinical+tissue+specimens+with+multiplexed+quantum+dots.">Molecular mapping of tumor heterogeneity on clinical tissue specimens with multiplexed quantum dots.</a> ACS Nano. 4, 2755-2765 (2010).</li><li>Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+subcellular+localization+and+quantification+of+protein+expression+in+tissue+microarrays.">Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays.</a> Nat. Med. 8, 1323-1327 (2002).</li><li>Simpson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+biodiversity.">Measurement of biodiversity.</a> Nature. 163, 688-68 (1949).</li><li>Gustavson, M. D., Bourke-Martin, B., Reilly, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+unsupervised+pixel-based+clustering+algorithm+for+compartmentalization+of+immunohistochemical+expression+using+Automated+Quantitative+Analysis.">Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using Automated Quantitative Analysis.</a> Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 17, 329-337 (2009).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paclitaxel+plus+carboplatin+versus+standard+chemotherapy+with+either+single-agent+carboplatin+or+cyclophosphamide,+doxorubicin,+and+cisplatin+in+women+with+ovarian+cancer:+the+ICON3+randomised+trial.">Paclitaxel plus carboplatin versus standard chemotherapy with either single-agent carboplatin or cyclophosphamide, doxorubicin, and cisplatin in women with ovarian cancer: the ICON3 randomised trial.</a> Lancet. 360, 505-515 (2002).</li><li>McGuire, W. P., Hoskins, W. J., Brady, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophosphamide+and+cisplatin+compared+with+paclitaxel+and+cisplatin+in+patients+with+stage+III+and+stage+IV+ovarian+cancer.">Cyclophosphamide and cisplatin compared with paclitaxel and cisplatin in patients with stage III and stage IV ovarian cancer.</a> N. Engl. J. Med. 334, 1-6 (1996).</li><li>Muggia, F. M., Braly, P. S., Brady, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+III+randomized+study+of+cisplatin+versus+paclitaxel+versus+cisplatin+and+paclitaxel+in+patients+with+suboptimal+stage+III+or+IV+ovarian+cancer:+a+gynecologic+oncology+group+study.">Phase III randomized study of cisplatin versus paclitaxel versus cisplatin and paclitaxel in patients with suboptimal stage III or IV ovarian cancer: a gynecologic oncology group study.</a> J. Clin. Oncol. 18, 106-115 (2000).</li><li>Piccart, M. J., Bertelsen, K., James, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+intergroup+trial+of+cisplatin-paclitaxel+versus+cisplatin-cyclophosphamide+in+women+with+advanced+epithelial+ovarian+cancer:+three-year+results.">Randomized intergroup trial of cisplatin-paclitaxel versus cisplatin-cyclophosphamide in women with advanced epithelial ovarian cancer: three-year results.</a> J. Natl. Cancer. Inst. 92, 699-708 (2000).</li><li>Cannistra, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+of+the+ovary.">Cancer of the ovary.</a> N. Engl. J. Med. 351, 2519-2529 (2004).</li><li>Baker, A. F., Dragovich, T., Ihle, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+phosphoprotein+as+a+biological+marker+of+tumor+signaling.">Stability of phosphoprotein as a biological marker of tumor signaling.</a> Clin. Cancer. Res. 11, 4338-4340 (2005).</li><li>Espina, V., Edmiston, K. H., Heiby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+portrait+of+tissue+phosphoprotein+stability+in+the+clinical+tissue+procurement+process.">A portrait of tissue phosphoprotein stability in the clinical tissue procurement process.</a> Mol. Cell. Proteomics. 7, 1998-2018 (2008).</li><li>Klymkowsky, M. W., Savagner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transition:+a+cancer+researcher's+conceptual+friend+and+foe.">Epithelial-mesenchymal transition: a cancer researcher's conceptual friend and foe.</a> Am. J. Pathol. 174, 1588-1593 (2009).</li><li>Kurrey, N. K., Jalgaonkar, S. P., Joglekar, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snail+and+slug+mediate+radioresistance+and+chemoresistance+by+antagonizing+p53-mediated+apoptosis+and+acquiring+a+stem-like+phenotype+in+ovarian+cancer+cells.">Snail and slug mediate radioresistance and chemoresistance by antagonizing p53-mediated apoptosis and acquiring a stem-like phenotype in ovarian cancer cells.</a> Stem. Cells. 27, 2059-2068 (2009).</li><li>Creighton, C. J., Li, X., Landis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+breast+cancers+after+conventional+therapy+display+mesenchymal+as+well+as+tumor-initiating+features.">Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 13820-13825 (2009).</li><li>Aitken, S. J., Thomas, J. S., Langdon, S. P., Harrison, D. J., Faratian, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+changes+in+ER,+PR+and+HER2+expression+in+primary+breast+cancer+and+paired+nodal+metastases.">Quantitative analysis of changes in ER, PR and HER2 expression in primary breast cancer and paired nodal metastases.</a> Ann. Oncol. 21, 1254-1261 (2010).</li><li>Sayagues, J. M., Abad, M. M., Melchor, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoural+cytogenetic+heterogeneity+of+sporadic+colorectal+carcinomas+suggests+several+pathways+to+liver+metastasis.">Intratumoural cytogenetic heterogeneity of sporadic colorectal carcinomas suggests several pathways to liver metastasis.</a> J. Pathol. 221, 308-319 (2010).</li></ol>

JC, MG, CJ, ve CS HistoRx, Inc. &#39;Çalışanları

Bu yöntem, tümörün malzemenin standart formalin ile fikse, parafine gömülü histolojik kesitler moleküler heterojenite izin kantifikasyon burada nitelendirdi. Yöntemi, bu biyomarker geliştirme ve analiz bir değişken olarak dikkate alınması olabilir, böylece bir doku bölümünde heterojenlik derecesi atanacak bir değer izin verir. Genel olarak doku biyobelirteçleri tahlil örnekleme hatası veya yanlılık daha az duyarlıdır, böylece ifade bakımından homojen olması tercih edilir olsa da, bazı koşullar altında, bir parametre olarak heterojenite ölçmek için yararlı olabilir. Örneğin, ER ve HER2 için örnek gösterildiği gibi, ortak biyobelirteçleri ifade hatırı sayılır bir heterojenlik göstermek ve bunun klinik sonuç veya tedaviye yanıt açısından, bağımsız bir prognostik veya akıllı faktör sırasıyla temsil edip etmediği henüz bilinmiyor. Aynı şekilde, gösterildiği gibi, tedavinin kendisi dinamik olarak değiştirebilirhedef zenginleşme oluşturan hücre popülasyonları ve bu nedenle ölçüm tedavi kararları rehberlik yararlı olabilir. Ancak, bu teknik, geleneksel histopatolojik veya biyomarker (immünohistokimyasal olarak) analizleri sınırı aynı faktörler ile sınırlıdır. Sonuç türü, boyutu, ve analiz edilen doku kalitesi ve bu nedenle tek bir doku bölümünde bağlıdır tümörün tamamını yansıtmıyor olabilir. Gerçekten de, Simpson indeksi aşırı derecede doku boyutu (AQUA puanları ölçülen ve yakalanan kare sayısı) önyargılı olabilir. Ölçülen epitoplar immünojenite artifactually doku bölümü (soğuk iskemi zamanı, fiksasyon uzunluğu ve kenar artifakı gibi) arasında kendi ifadesini değiştirmek kontrol edilemeyen pre-analitik faktörler tabi olabilir. Bu, özellikle herkesin bildiği gibi labil 14, 15 fosfor epitopu bir sorundur . Bu nedenle bu tekniğin daha uygun olabilirrezeksiyon örneklerinde ziyade küçük biyopsiler, ve sadece bir yerine birden çok bölüm yapılan. Sonuç olarak, 3D görüntüleme teknikleri Bu parametre daha iyi ölçmek için bir fırsat sunabilir. Olarak sunulan teknik sitokeratin maskeleme epitop ifade değişkenlik gibi biyolojik faktörler, aynı zamanda sınırlı olabilir. Bu, yumurtalık ve meme kanseri, epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) geçmesi veya non-epitelyal bileşenleri veya kök hücreler 16 zenginleştirilmiş dahil olmak üzere, bu kanserlerin özellikle endişe gibi son zamanlarda meydana geldiği görülmüştür olabilir kemoterapi- in vitro 17, yumurtalık kanseri ve tedavisi 18 yanıt meme kanserli hastalarda tedavi edildi. Bu sınırlama, sitokeratin artı vimentin, EMT 16 upregüle gibi alternatif maskeleme antikorları (antikorlar kokteyller) kullanarak üstesinden olabilir . Buna ek olarak, doku diğer bileşenleri (mikrofon bu yanaroenvironment), fibroblastlar ve vasküler endotelyal hücreler gibi, biyolojik tedaviler de giderek tarafından hedef alınıyor, teknik vasküler endotelyal hücreler için leke gibi PECAM / CD31 gibi ilgi bölmeleri, özel maskeler kullanarak, bu bileşenleri puan için genişletilmiş olabilir . Simpson indeksi adaptasyon sadeliği nedeniyle mevcut protokol heterojenlik bir ölçüsü olarak kullanılıyor olmasına rağmen, diğer önlemler heterojenlik (ortalama, varyans, medyan, vb) gibi merkezi eğilim basit ölçümler, kullanılan olabilir. Ayrıca, Simpson endeksi hesaplamalarında, belirli bir test nüfusun daha iyi uyacak şekilde değiştirilmiş olabilir. Z-skoru dönüşümleri heterojenite bir veri kümesi için ortalama etrafında sapma dayalı olduğu puanlama birden fazla belirteçler için daha geçerli olmak üzere izin verir. Ancak, genel olarak çeşitli puanlama dönüşüm bu tip sınırlı olabilir. Bazı tasarımlar daha uygun olabilirsadece belirli bir marker kümesinin tüm örnekler için gerçek AQUA puanları bin. Kutuları ve kesilecek sayısının seçimi de neden olabilir değerler aralığında bir sınırlama ve alternatif deneysel tasarımlar için optimize edilmiş olabilir. Biz zaten klinikte kullanılan bu yana, ER ve HER2 aday biyobelirteçleri olarak bu çalışmada kullanılan hedeflenmiş tedavilerin etkinliği saygı ile ilgili klinik soruları yanıtlamaya yardımcı ve hatırı sayılır bir heterojenlik ve değişim göstermez bilinen birincil ve uzak 19 hastalıktır. Ancak, heterojenlik optimal marker tespit edilmesi kalır. Diğer olasılıklar klonalite sitogenetik belirteçler, interfaz FISH çalışmaları 20, daha önce kullanılan bu gibi içerebilir. Bu yaklaşım, daha fazla kanser biyolojisi bu parametre alaka kurmak için büyük, iyi açıklamalı klinik kohortlarında veya klinik araştırmalardan daha fazla doğrulama gerektirir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> ScanScope FL </td><td> Aperio </td><td> ScanScope FL </td><td> Eskisi gibi satıcıdan donatılmıştır </td></tr><tr><td> Spektrum </td><td> Aperio </td><td> Spektrum </td><td> Yapılandırma ve katalog numaraları yerel kurumların kendi veritabanı ve IT yapısının nasıl ayarladığınıza değişecektir. </td></tr><tr><td> AQUAjustment ile birlikte AQUAnalysis, </td><td> HistoRx </td><td> V2.3 </td><td> AQUAjustment paketi AQUAnalysis Spectrum saklanan görüntüleri kullanmanıza olanak sağlar. </td></tr><tr><td> HER2 </td><td> Dako </td><td> A0485 </td><td> 400 seyreltme 1 </td></tr><tr><td> fare anti-pan sitokeratin </td><td> Dako </td><td> M3515 </td><td> 50 dilüsyon 1 </td></tr><tr><td> Antikor seyreltici </td><td> Dako </td&gt; <td> S0809 </td><td></td></tr><tr><td> Keçi-tavşan HRP imgeleyin </td><td> Dako </td><td> K4003 </td><td></td></tr><tr><td> Protein blok </td><td> Dako </td><td> X0909 </td><td></td></tr><tr><td> Keçi anti-fare Alexa555 </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI montaj orta </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td> Cy5 Tyramide </td><td> HistoRx </td><td> AQ-EMR1-00001 </td><td></td></tr><tr><td> Sequenza immün Merkezi </td><td> Thermo Scientific Shandon </td><td> 73300001 </td><td> Burada kullanılan tezgah üstü immünofloresan boyama </td></tr></tbody></table>

heterogeneity mapping of protein expression in tumors using quantitative immunofluorescence

Morfolojik heterojenlik içinde bireysel bir tümör cerrahi pratikte histopathologists tarafından iyi bilinmektedir. Bu genellikle tanınan histolojik alt tiplere belirgin farklılaşma alanları şeklinde, ya da farklı patolojik notu alırken, çoğu zaman doğru sınıflandırma (Şekil 1) meydan fenotip daha ince farklar vardır. Sonuç olarak, altta yatan moleküler fenotip morfolojisini tarafından dikte olduğundan, gözle görünür farklılıklar olduğu bölgelerde hücre fonksiyonu ve davranışı orkestra proteinlerin ifade farklılıkları, ve bu nedenle, görünüm eşlik etmesi muhtemeldir. Prognoz için görünen ve görünmeyen (moleküler) heterojenliğin önemi bilinmemektedir, ancak en azından genetik düzeyde, heterojenlik primer tümörün 1,2 var ve bu alt-klonlar bazı metastatik doğuran, son kanıtlar göstermektedir ( ve bu nedenle öldürücü) hastalığı. Ayrıca, bazı proteinlertedavi hedefleri (örneğin tamoksifen ve trastuzumab (Herceptin) ER ve HER2 sırasıyla) çünkü biyobelirteçleri olarak ölçülür. Bu proteinlerin bir tümör içinde değişken ifade Eğer tedavi yanıtları da değişken olabilir. Immünohistokimya için yaygın olarak kullanılan histopatolojik skorlama düzenleri ya göz ardı veya protein ekspresyonu miktarının sayısal olarak homojenize. Benzer şekilde, tümör örnekleri homojenize edilir (örneğin, gen ekspresyonu gibi) yıkıcı teknikleri, nicel bilgi açıklanamamıştır, ancak mekansal bilgi kaybı olmaz. Pankreas kanseri genetik heterojenite haritalama yaklaşımları tek bir hücre süspansiyonu 3 nesil ya güvendi, veya macrodissection 4 vardır. Son zamanlarda yapılan bir çalışmada, prostat kanseri dokusunun 5 morfolojik ve moleküler heterojenite harita için morfolojisi ve moleküler haritalama mümkün olduğunu ispat ilke, kuantum noktaları, ama düşüyorheterojenite nicel hort. Immünohistokimya olduğundan, en azından, sadece yarı-kantitatif ve intra-ve inter-gözlemci önyargı, daha duyarlı ve kantitatif metodolojileri tabi doğru in situ doku heterojenite harita ve ölçmek için gereklidir. Biz sistematik Otomatik Kantitatif Analiz (AQUA) sistemi 6 dayalı tüm tümör dokusu bölümlerde protein ekspresyonu, heterojenite ölçmek amacıyla geliştirilen ve uygulanan deneysel ve istatistiksel metodoloji var. Doku bölümler fluorofor etiketli sekonder antikor cytokeratins ve ilgi hedeflere karşı spesifik antikorlar ile etiketlenmiş. Slaytlar bütün bir slayt floresans tarayıcı kullanarak görüntülü. Görüntüler yüzlerce binlerce çini bölünmüştür ve her bir çini sonra epitel doku (tümör) bileşeni içinde protein konsantrasyonunun bir ölçüsüdür AQUA puan atanır. Heatmaps Simpson biyolojik çeşitlilik indeksi 7 dayalı orijinal ekoloji heterojenite kullanılan istatistiki bir ölçüttür, kullanarak, proteinlerin ve atanmış bir heterojenite puan doku ifadesini temsil etmek için üretilir. Histolojik preparatlar, bugüne kadar sistematik bir protein ekspresyonu ile birlikte bu değişkenliği harita ve ölçmek için hiçbir girişim olmamıştır. Burada, ER ve yumurtalık kanseri HER2 biyomarker ifade için uygulanan yöntemin ilk kullanımı göstermektedir. Bu yöntemi kullanarak, prognoz ve tedaviye yanıtları tahmin heterojenite önemini kurmak için heterojenite translasyonel çalışmalarda biyomarker ifade çalışmalarında bağımsız bir değişken olarak analiz etmek için yolu açıyor.

Watch this Scientific Journal Video about Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence at JoVE.com

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Burada kantitatif immünofloresan, görüntü analizi, ve heterojenlik istatistiksel bir ölçü kullanarak, tümör malzeme histolojik bölümlerde moleküler heterojenite ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, klinik biyomarker geliştirme ve analiz kullanım için tasarlanmıştır.

Kantitatif İmmünofloresan kullanarak Tümörler Protein İfade heterojenite Haritalama

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

heterogeneity-mapping-protein-expression-tumors-using-quantitative

Research

JoVE Journal

Medicine

18.5K Görüntüleme.  University of Edinburgh. Burada kantitatif immünofloresan, görüntü analizi, ve heterojenlik istatistiksel bir ölçü kullanarak, tümör malzeme histolojik bölümlerde moleküler heterojenite ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, klinik biyomarker geliştirme ve analiz kullanım için tasarlanmıştır.

Video: Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Bağışıklık Eksik Fare Kuruluş ve İnsan Retinoblastom Tümörler yayılımı

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Tıp

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Intravital Görüntüleme Gerçek Zamanlı tümörler Nanopartikül Alımı Değerlendirme

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR (qPCR) tarafından Prostat tümörlerinde mikroRNA Algılama

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome compared to matched normal tissue. Based on these analyses it is evident that there are many undiscovered genetic drivers of cancer1. Unfortunately these drivers are hidden within a much larger number of passenger anomalies in the genome that do not directly contribute to tumor formation. Another aspect of the cancer genome is that there is considerable genetic heterogeneity within similar tumor types. Each tumor can harbor different mutations that provide a selective advantage for tumor formation2. Performing an unbiased forward genetic screen in mice provides the tools to generate tumors and analyze their genetic composition, while reducing the background of passenger mutations. The Sleeping Beauty (SB) transposon system is one such method3. The SB system utilizes mobile vectors (transposons) that can be inserted throughout the genome by the transposase enzyme. Mutations are limited to a specific cell type through the use of a conditional transposase allele that is activated by Cre Recombinase. Many mouse lines exist that express Cre Recombinase in specific tissues. By crossing one of these lines to the conditional transposase allele (e.g. Lox-stop-Lox-SB11), the SB system is activated only in cells that express Cre Recombinase. The Cre Recombinase will excise a stop cassette that blocks expression of the transposase allele, thereby activating transposon mutagenesis within the designated cell type. An SB screen is initiated by breeding three strains of transgenic mice so that the experimental mice carry a conditional transposase allele, a concatamer of transposons, and a tissue-specific Cre Recombinase allele. These mice are allowed to age until tumors form and they become moribund. The mice are then necropsied and genomic DNA is isolated from the tumors. Next, the genomic DNA is subjected to linker-mediated-PCR (LM-PCR) that results in amplification of genomic loci containing an SB transposon. LM-PCR performed on a single tumor will result in hundreds of distinct amplicons representing the hundreds of genomic loci containing transposon insertions in a single tumor4. The transposon insertions in all tumors are analyzed and common insertion sites (CISs) are identified using an appropriate statistical method5. Genes within the CIS are highly likely to be oncogenes or tumor suppressor genes, and are considered candidate cancer genes. The advantages of using the SB system to identify candidate cancer genes are: 1) the transposon can easily be located in the genome because its sequence is known, 2) transposition can be directed to almost any cell type and 3) the transposon is capable of introducing both gain- and loss-of-function mutations6. The following protocol describes how to devise and execute a forward genetic screen using the SB transposon system to identify candidate cancer genes (Figure 1).

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

A method of identifying unknown drivers of carcinogenesis using an unbiased approach is described. The method uses the Sleeping Beauty transposon as a random mutagen directed to specific tissues. Genomic mapping of transposon insertions that drive tumor formation identifies novel oncogenes and tumor suppressor genes

Tanımlanması<em&gt; Sleeping Beauty</emLinker-aracılı PCR kullanarak Solid Tümörlerde&gt; Transposon Eklemeler

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

Several human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical polarity, ability to differentiate, and anoikis are not maintained in colon cancer derived cell lines. The present study demonstrates a method for culturing primary mouse colon tumor organoids adapted from Sato T et al. 1, which retains important physiologic features of colon tumors. This method consists of mouse colon tumor tissue collection, adjacent normal colon epithelium dissociation, colon tumor cells digestion into single cells, embedding colon tumor cells into matrigel, and selective culture based on the principle that tumor cells maintain growth on limiting nutrient conditions compared to normal epithelial cells.
The primary tumor organoids if isolated from genetically modified mice provide a very useful system to assess tumor autonomous function of specific genes. Moreover, the tumor organoids are amenable to genetic manipulation by virus meditated gene delivery; therefore signaling pathways involved in the colon tumorigenesis could also be extensively investigated by overexpression or knockdown. Primary tumor organoids culture provides a physiologic relevant and feasible means to study the mechanisms and therapeutic modalities for colon tumorigenesis.

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

A simple method to establish primary murine colon tumor organoid is described. This method utilizes the feature that colon tumor cells survive and grow into organoids in media containing limited growth factors, whereas normal colon epithelial do not.

Birincil Fare Colon Tümörler in vitro organoid Kültür

Several  human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic  integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical ...

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment resistance is thought to be the molecular complexity of the disease 1. Targeted therapy such as the tyrosine kinase inhibitor (TKI)-sunitinib have been utilized, but only 40% of patients will respond, with the overwhelming majority of these patients relapsing within 1 year 2. As such the question of intrinsic and acquired resistance in renal cell cancer patients is highly relevant 3.
In order to study resistance to TKIs, with the ultimate goal of developing effective, personalized treatments, sequential tissue after a specific period of targeted therapy is required, an approach which had proved successful in chronic myeloid leukaemia 4. However the application of such a strategy in renal cell carcinoma is complicated by the high level of both inter- and intratumoral heterogeneity, which is a feature of renal cell carcinoma5,6 as well as other solid tumors 7. Intertumoral heterogeneity due to transcriptomic and genetic differences is well established even in patients with similar presentation, stage and grade of tumor. In addition it is clear that there is great morphological (intratumoral) heterogeneity in RCC, which is likely to represent even greater molecular heterogeneity. Detailed mapping and categorization of RCC tumors by combined morphological analysis and Fuhrman grading allows the selection of representative areas for proteomic analysis.
Protein based analysis of RCC8 is attractive due to its widespread availability in pathology laboratories; however, its application can be problematic due to the limited availability of specific antibodies 9. Due to the dot blot nature of the Reverse Phase Protein Arrays (RPPA), antibody specificity must be pre-validated; as such strict quality control of antibodies used is of paramount importance. Despite this limitation the dot blot format does allow assay miniaturization, allowing for the printing of hundreds of samples onto a single nitrocellulose slide. Printed slides can then be analyzed in a similar fashion to Western analysis with the use of target specific primary antibodies and fluorescently labelled secondary antibodies, allowing for multiplexing. Differential protein expression across all the samples on a slide can then be analyzed simultaneously by comparing the relative level of fluorescence in a more cost-effective and high-throughput manner.

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

RPPA enables the protein expression of hundreds of samples, printed on nitrocellulose slides to be interrogated simultaneously, using fluorescently labelled antibodies. This technique has been applied to study the effect of drug treatment heterogeneity within clear cell renal carcinoma.

Bireysel Renal Hücreli Kanserlerde içinde Protein Ekspresyonu Varyasyon kaynakları için Ters Faz Protein Diziler (RPPA) ve Kullanımı

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

Floresan SapC-DOPS Nanovesicles kullanma Beyin Tümörleri ve Artrit Vivo Optik Görüntüleme

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Coordinate Mapping of Hyolaryngeal Mechanics in Swallowing

Characterizing hyolaryngeal movement is important to dysphagia research. Prior methods require multiple measurements to obtain one kinematic measurement whereas coordinate mapping of hyolaryngeal mechanics using Modified Barium Swallow (MBS) uses one set of coordinates to calculate multiple variables of interest. For demonstration purposes, ten kinematic measurements were generated from one set of coordinates to determine differences in swallowing two different bolus types. Calculations of hyoid excursion against the vertebrae and mandible are correlated to determine the importance of axes of reference.
To demonstrate coordinate mapping methodology, 40 MBS studies were randomly selected from a dataset of healthy normal subjects with no known swallowing impairment. A 5 ml thin-liquid bolus and a 5 ml pudding swallows were measured from each subject. Nine coordinates, mapping the cranial base, mandible, vertebrae and elements of the hyolaryngeal complex, were recorded at the frames of minimum and maximum hyolaryngeal excursion. Coordinates were mathematically converted into ten variables of hyolaryngeal mechanics.
Inter-rater reliability was evaluated by Intraclass correlation coefficients (ICC). Two-tailed t-tests were used to evaluate differences in kinematics by bolus viscosity. Hyoid excursion measurements against different axes of reference were correlated. Inter-rater reliability among six raters for the 18 coordinates ranged from ICC = 0.90 - 0.97. A slate of ten kinematic measurements was compared by subject between the six raters. One outlier was rejected, and the mean of the remaining reliability scores was ICC = 0.91, 0.84 - 0.96, 95% CI. Two-tailed t-tests with Bonferroni corrections comparing ten kinematic variables (5 ml thin-liquid vs. 5 ml pudding swallows) showed statistically significant differences in hyoid excursion, superior laryngeal movement, and pharyngeal shortening (p &#60; 0.005). Pearson correlations of hyoid excursion measurements from two different axes of reference were: r = 0.62, r2 = 0.38, (thin-liquid); r = 0.52, r2 = 0.27, (pudding).
Obtaining landmark coordinates is a reliable method to generate multiple kinematic variables from video fluoroscopic images useful in dysphagia research.

Coordinate mapping is a method of documenting salient features of hyolaryngeal biomechanics in the pharyngeal phase of swallowing. This methodology uses image analysis software to record coordinates of anatomical landmarks. These coordinates are imported into an excel macro and translated into kinematic variables of interest useful in dysphagia research.

Yutkunma içinde Hyolaryngeal Mekanik Koordinat Dönüşümü

Characterizing hyolaryngeal movement is important to dysphagia research. Prior methods require multiple measurements to obtain one kinematic measurement ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic biomarkers. However, methods for quantitative proteomic characterization of patient-derived tumors and in particular their cellular subpopulations are largely lacking. Here we describe an experimental set-up that allows quantitative analysis of proteomes of cancer cell subpopulations derived from either liquid or solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry followed by bioinformatic data analysis. To enrich specific cellular subsets, liquid tumors are first immunophenotyped by flow cytometry followed by FACS-sorting; for solid tumors, laser-capture microdissection is used to purify specific cellular subpopulations. In a second step, proteins are extracted from the purified cells and subsequently combined with a tumor-specific, SILAC-labeled spike-in standard that enables protein quantification. The resulting protein mixture is subjected to either gel electrophoresis or Filter Aided Sample Preparation (FASP) followed by tryptic digestion. Finally, tryptic peptides are analyzed using a hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer, and the data obtained are processed with bioinformatic software suites including MaxQuant. By means of the workflow presented here, up to 8,000 proteins can be identified and quantified in patient-derived samples, and the resulting protein expression profiles can be compared among patients to identify diagnostic proteomic signatures or potential drug targets.

In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

Sıvı ve Katı Tümörler Kaynaklanan Kanser hücre Proteomlar Kantitatif Kitle Spektrometrik Profil

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Quantitative Mapping of Specific Ventilation in the Human Lung using Proton Magnetic Resonance Imaging and Oxygen as a Contrast Agent

Specific ventilation imaging (SVI) is a functional magnetic resonance imaging technique capable of quantifying specific ventilation &#8213; the ratio of the fresh gas entering a lung region divided by the region&#8217;s end-expiratory volume &#8213; in the human lung, using only inhaled oxygen as a contrast agent. Regional quantification of specific ventilation has the potential to help identify areas of pathologic lung function. Oxygen in solution in tissue shortens the tissue&#8217;s longitudinal relaxation time (T1), and thus a change in tissue oxygenation can be detected as a change in T1-weighted signal with an inversion recovery acquired image. Following an abrupt change between two concentrations of inspired oxygen, the rate at which lung tissue within a voxel equilibrates to a new steady-state reflects the rate at which resident gas is being replaced by inhaled gas. This rate is determined by specific ventilation. To elicit this sudden change in oxygenation, subjects alternately breathe 20-breath blocks of air (21% oxygen) and 100% oxygen while in the MRI scanner. A stepwise change in inspired oxygen fraction is achieved through use of a custom three-dimensional (3D)-printed flow bypass system with a manual switch during a short end-expiratory breath hold. To detect the corresponding change in T1, a global inversion pulse followed by a single shot fast spin echo sequence was used to acquire two-dimensional T1-weighted images in a 1.5&#160;T MRI scanner, using an eight-element torso coil. Both single slice and multi-slice imaging are possible, with slightly different imaging parameters. Quantification of specific ventilation is achieved by correlating the time-course of signal intensity for each lung voxel with a library of simulated responses to the air/oxygen stimulus. SVI estimations of specific ventilation heterogeneity have been validated against multiple breath washout and proved to accurately determine the heterogeneity of the specific ventilation distribution.

Specific ventilation imaging is a functional magnetic resonance imaging technique that allows for quantification of regional specific ventilation in the human lung, using inhaled oxygen as a contrast agent. Here, we present a protocol to collect and analyze specific ventilation imaging data.

Proton manyetik rezonans görüntüleme ve oksijen kontrast ajan olarak kullanarak ınsan akciğerinde spesifik havalandırma niceliksel haritalama

Specific ventilation imaging (SVI) is a functional magnetic resonance imaging technique capable of quantifying specific ventilation &#8213; the ratio of ...