PhenoImager HT, Radboud Üniversitesi Tıp Merkezi ve Radboud Mikroskopi Teknoloji Merkezi tarafından sağlanan fonlarla satın alındı. CF, Hollanda Kanser Derneği hibesi (10673) ve ERC Adv hibesi ARTimmune (834618) tarafından finansal olarak desteklenmektedir. JT, bir NWO Vidi hibesi (VI.Vidi.192.084) tarafından finansal olarak desteklenmektedir. Yazarlar, multipleks IHC verilerini depolamak için iş akışları oluşturmadaki yardımları için Eric van Dinther ve Ankur Ankan'a teşekkür eder ve ROI çizimi için QuPath'te multipleks IHC verilerinin nasıl uygulanacağına ilişkin talimatlar için Bengt Phung'a teşekkür eder.

Tümör Bağışıklık Manzarasının Haritalanması: Derinlemesine Bir Multipleks IHC Analiz Protokolü

<ol>
	<li>Dunn, G. P., Bruce, A. T., Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunoediting:+from+immunosurveillance+to+tumor+escape.">Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape.</a> Nature Immunology. 3 (11), 991-998 (2002).</li><li>van der Woude, L. L., Gorris, M. A. J., Halilovic, A., Figdor, C. G., de Vries, I. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migrating+into+the+tumor:+a+roadmap+for+T+cells.">Migrating into the tumor: a roadmap for T cells.</a> Trends in Cancer. 3 (11), 797-808 (2017).</li><li>Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+contexture+in+human+tumours:+impact+on+clinical+outcome.">The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.</a> Nature Reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).</li><li>Fridman, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+microenvironment+of+human+tumors:+general+significance+and+clinical+impact.">The immune microenvironment of human tumors: general significance and clinical impact.</a> Cancer Microenvironment. 6 (2), 117-122 (2013).</li><li>Pages, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+validation+of+the+consensus+Immunoscore+for+the+classification+of+colon+cancer:+a+prognostic+and+accuracy+study.">International validation of the consensus Immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study.</a> Lancet. 391 (10135), 2128-2139 (2018).</li><li>Angell, H. K., Bruni, D., Barrett, J. C., Herbst, R., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Immunoscore:+colon+cancer+and+beyond.">The Immunoscore: colon cancer and beyond.</a> Clinical Cancer Research. 26 (2), 332-339 (2020).</li><li>Angell, H., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+immune+contexture+to+the+Immunoscore:+the+role+of+prognostic+and+predictive+immune+markers+in+cancer.">From the immune contexture to the Immunoscore: the role of prognostic and predictive immune markers in cancer.</a> Current Opinion in Immunology. 25 (2), 261-267 (2013).</li><li>Galon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+classification+using+the+Immunoscore:+a+worldwide+task+force.">Cancer classification using the Immunoscore: a worldwide task force.</a> Journal of Translational Medicine. 10, 205 (2012).</li><li>Galon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=World-wide+Immunoscore+Task+Force:+meeting+report+from+the+34;Melanoma+Bridge&amp;#34,+Napoli,+November+30th-December+3rd,+2016.">World-wide Immunoscore Task Force: meeting report from the 34;Melanoma Bridge&amp;#34, Napoli, November 30th-December 3rd, 2016.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 212 (2017).</li><li>Tumeh, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+blockade+induces+responses+by+inhibiting+adaptive+immune+resistance.">PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance.</a> Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).</li><li>Creemers, J. H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tipping+point+in+cancer-immune+dynamics+leads+to+divergent+immunotherapy+responses+and+hampers+biomarker+discovery.">A tipping point in cancer-immune dynamics leads to divergent immunotherapy responses and hampers biomarker discovery.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002032 (2021).</li><li>Blank, C. U., Haanen, J. B., Ribas, A., Schumacher, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CANCER+IMMUNOLOGY.+The+&amp;#34;cancer+immunogram&amp;#34;.">CANCER IMMUNOLOGY. The &amp;#34;cancer immunogram&amp;#34;.</a> Science. 352 (6286), 658-660 (2016).</li><li>Teruya-Feldstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunohistochemistry+laboratory+looking+at+molecules+and+preparing+for+tomorrow.">The immunohistochemistry laboratory looking at molecules and preparing for tomorrow.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 134 (11), 1659-1665 (2010).</li><li>Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+tissue+antigens+and+antibodies+get+along:+revisiting+the+technical+aspects+of+immunohistochemistry--the+red,+brown,+and+blue+technique.">When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry--the red, brown, and blue technique.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).</li><li>Hegde, P. S., Karanikas, V., Evers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+where,+the+when,+and+the+how+of+immune+monitoring+for+cancer+immunotherapies+in+the+era+of+checkpoint+inhibition.">The where, the when, and the how of immune monitoring for cancer immunotherapies in the era of checkpoint inhibition.</a> Clinical Cancer Research. 22 (8), 1865-1874 (2016).</li><li>Parra, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+platforms+of+multiplexed+immunofluorescence+for+study+of+paraffin+tumor+tissues.">Novel platforms of multiplexed immunofluorescence for study of paraffin tumor tissues.</a> Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).</li><li>Gorris, M. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eight-color+multiplex+immunohistochemistry+for+simultaneous+detection+of+multiple+immune+checkpoint+molecules+within+the+tumor+microenvironment.">Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment.</a> Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).</li><li>Roelofsen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+regression+of+ovarian+carcinoma+after+septic+peritonitis;+a+unique+case+report.">Spontaneous regression of ovarian carcinoma after septic peritonitis; a unique case report.</a> Frontiers in Oncology. 8, 562 (2018).</li><li>van den Brand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-mediated+delivery+of+therapeutic+mRNA+in+ovarian+cancer.">Peptide-mediated delivery of therapeutic mRNA in ovarian cancer.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 141, 180-190 (2019).</li><li>van den Brand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpCAM-binding+DARPins+for+targeted+photodynamic+therapy+of+ovarian+cancer.">EpCAM-binding DARPins for targeted photodynamic therapy of ovarian cancer.</a> Cancers. 12 (7), 1762 (2020).</li><li>Di Blasio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumour+microenvironment+shapes+dendritic+cell+plasticity+in+a+human+organotypic+melanoma+culture.">The tumour microenvironment shapes dendritic cell plasticity in a human organotypic melanoma culture.</a> Nature Communications. 11 (1), 2749 (2020).</li><li>van Beek, J. J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pDCs+are+superior+to+cDC2s+in+attracting+cytolytic+lymphocytes+in+melanoma+patients+receiving+DC+vaccination.">Human pDCs are superior to cDC2s in attracting cytolytic lymphocytes in melanoma patients receiving DC vaccination.</a> Cell Reports. 30 (4), 1027-1038 (2020).</li><li>Rodriguez-Rosales, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+aged+neutrophils+are+augmented+in+blood+and+skin+of+psoriasis+patients.">Immunomodulatory aged neutrophils are augmented in blood and skin of psoriasis patients.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 148 (4), 1030-1040 (2021).</li><li>Hoeijmakers, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+composition+in+the+endometrium+of+patients+with+a+complete+molar+pregnancy:+Effects+on+outcome.">Immune cell composition in the endometrium of patients with a complete molar pregnancy: Effects on outcome.</a> Gynecologic Oncology. 160 (2), 450-456 (2021).</li><li>van Ravensteijn, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+and+genomic+analysis+reveals+clinically+relevant+distinctions+between+angiosarcoma+subgroups.">Immunological and genomic analysis reveals clinically relevant distinctions between angiosarcoma subgroups.</a> Cancers. 14 (23), 5938 (2022).</li><li>van der Woude, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment+shows+an+immunological+abscopal+effect+in+patients+with+NSCLC+treated+with+pembrolizumab-radiotherapy+combination.">Tumor microenvironment shows an immunological abscopal effect in patients with NSCLC treated with pembrolizumab-radiotherapy combination.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (10), e005248 (2022).</li><li>Graham Martinez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+microenvironment+landscape+shows+treatment-specific+differences+in+rectal+cancer+patients.">The immune microenvironment landscape shows treatment-specific differences in rectal cancer patients.</a> Frontiers in Immunology. 13, 1011498 (2022).</li><li>Cortenbach, K. R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+of+immune+cell+infiltration+in+different+stages+of+coronary+atherosclerosis+revealed+by+multiplex+immunohistochemistry.">Topography of immune cell infiltration in different stages of coronary atherosclerosis revealed by multiplex immunohistochemistry.</a> International Journal of Cardiology. Heart &amp; Vasculature. 44, 101111 (2023).</li><li>van Wilpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+repair+deficient+prostate+cancer+represents+an+immunologically+distinct+subtype.">Homologous recombination repair deficient prostate cancer represents an immunologically distinct subtype.</a> Oncoimmunology. 11 (1), 2094133 (2022).</li><li>Gorris, M. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+primary+and+metastatic+lesions+of+patients+with+ipilimumab-treated+melanoma:+high+variation+in+lymphocyte+infiltration+and+HLA-ABC+expression+whereas+tumor+mutational+load+is+similar+and+correlates+with+clinical+outcome.">Paired primary and metastatic lesions of patients with ipilimumab-treated melanoma: high variation in lymphocyte infiltration and HLA-ABC expression whereas tumor mutational load is similar and correlates with clinical outcome.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (5), e004329 (2022).</li><li>van Wilpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral+T+cell+depletion+following+neoadjuvant+chemotherapy+in+patients+with+muscle-invasive+bladder+cancer+is+associated+with+poor+clinical+outcome.">Intratumoral T cell depletion following neoadjuvant chemotherapy in patients with muscle-invasive bladder cancer is associated with poor clinical outcome.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 72 (1), 137-149 (2023).</li><li>Sultan, S., Gorris, M. A. J., Buytenhuijs, F., Lvan de Woude, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Segmentation-free+machine+learning+architecture+for+immune+land-scape+phenotyping+in+solid+tumors+by+multichannel+imaging.">A Segmentation-free machine learning architecture for immune land-scape phenotyping in solid tumors by multichannel imaging.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-profiling+and+cellular+spatial+analysis+using+five+immune+oncology+multiplex+immunofluorescence+panels+for+paraffin+tumor+tissue.">Immuno-profiling and cellular spatial analysis using five immune oncology multiplex immunofluorescence panels for paraffin tumor tissue.</a> Scientific Reports. 11 (1), 8511 (2021).</li><li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues.">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380 (2017).</li><li>Sun, Z., Nyberg, R., Wu, Y., Bernard, B., Redmond, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+an+enhanced+7-color+multiplex+IHC+protocol+to+dissect+immune+infiltration+in+human+cancers.">Developing an enhanced 7-color multiplex IHC protocol to dissect immune infiltration in human cancers.</a> PLoS One. 16 (2), e0247238 (2021).</li><li>LeicaBiosystems. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BOND+RX+Fully+Automated+Research+Stainer+Protocols.">BOND RX Fully Automated Research Stainer Protocols.</a> , (2022).</li></ol>

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

TME'nin mekansal analizi, immün hücre bölmesi hakkında daha fazla bilgi edinmek ve özellikle immüno-onkoloji alanında yeni prognostik ve prediktif biyobelirteçleri keşfetmek için aranan bir tekniktir16. Bu amaçla, 100-1.000 hedefe kadar tahminlerle proteinlerin, mRNA transkriptlerinin veya ikisinin bir kombinasyonunun tespitini içeren birçok farklı teknik geliştirilmektedir. Bununla birlikte, daha yüksek çoğullama, daha az yüksek verimli deneyler, daha yüksek deneysel maliyetler ve teknik zorluklar pahasına gelir ve çoğu zaman TME'nin yalnızca küçük bir kısmı analiz edilebilir. Burada anlattığımız TSA tabanlı yöntemi kullanan multipleks IHC, aynı anda altı farklı belirteç + DAPI'yi tespit eder, gerçekleştirmesi nispeten daha ucuzdur ve tüm doku kesitleri 20 dakikadan kısa sürede tam olarak analiz edilmeye hazır olarak görüntülenir. Bu teknik, boyama prosedürünün otomasyonu ile daha az karmaşık hale geldi. İki ekstra filtrenin eklenmesini içeren multispektral mikroskoptaki iyileştirmeler, spektral karıştırma ve tarama sürelerini büyük ölçüde iyileştirdi. Aynı anda sekiz farklı işaretleyici + DAPI'yi tespit etmek mümkündür. Bununla birlikte, çoğullamayı daha fazla işaretleyici ile genişleterek, spektral karıştırmanın çözülmesi daha zor hale geldikçe ve tüm slaytlar için tarama süreleri önemli ölçüde arttıkça yukarıda belirtilen faydalar ortadan kalkar. Tanı ortamında uygulamayı daha kolay kolaylaştırmak için multipleks IHC'yi farklı kurumlar arasında standartlaştırmak için çabalar sarf edilmektedir. Multipleks IHC'nin bu standardizasyonu için, kullanıcılara altı farklı işaretleyici + DAPI ile daha erişilebilir protokole uymalarını tavsiye ediyoruz. Bununla birlikte, yine de oldukça fazla teknik bilgi birikimi gereklidir ve aşağı akış analizi zor olabilir, bunun için bu protokolde açıklanan metodolojileri geliştirdik.
Standardizasyon, multipleks IHC panel geliştirme ile başlar. Belirli protein hedeflerini tespit eden primer antikorların seçiminin önemi17'den önce vurgulanmıştır. Multipleks IHC panellerimiz çoğunlukla, teşhis departmanımızda IHC için de kullanılan ve doğrulanan primer antikor klonları ile geliştirilmiştir. Bununla birlikte, dendritik hücre multipleks IHC paneli durumunda, çoğu antikor tanı ortamında kullanılmamıştır (van der Hoorn ve diğerleri, gönderimdeki el yazması). Özgüllüğü sağlamak ve parti farklılıklarını en aza indirmek için, poliklonal antikorlar yerine monoklonal antikorları kullanmayı seçtik ve ayrıca transfekte hücre hatları ve birincil hücreler kullanarak çoğu antikoru doğruladık. Yıllar boyunca, Vectra 3 sistemi kullanılarak yapılan çok sayıda çalışmada multipleks IHC panellerin farklı versiyonları kullanılmıştır 18,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. Bu multipleks IHC panellerini PhenoImager HT sistemine en iyi şekilde uygulamak için, birincil antikor ve florofor kombinasyonlarında bazı ayarlamalar yapılması gerekiyordu. Tüm doku bölümlerinin daha iyi spektral karıştırma ve daha hızlı tarama sürelerinden yararlanmak için, en yeni Opal480 ve Opal780 floroforlarının uygulanması ve yedi renkli multipleks IHC panellerinde Opal540 ve Opal650 floroforların kullanılmasından kaçınılması gereklidir. Tarama süreleri, doku bölümünün boyutuna bağlı olarak ~ 3-10 kat daha hızlıdır. Multipleks IHC panel ayarlarının gerçekleştirilmesi oldukça kolaydı, ancak bazı hususların akılda tutulması gerekiyor. Opal480'in floresan spektrumu, otofloresan spektrumu ile çok örtüşür ve bu nedenle eritrositlerin ve diğer otofloresan yapıların spektral olarak karıştırılmasına müdahale eder. Opal480 ile eşleştirilmiş primer antikorun artan konsantrasyonunun kullanılması çoğu durumda bu sorunu çözmüştür. PhenoImager HT üzerinde tescilli Örnek AF filtresinin uygulanması, Opal480 ve otofloresansın karıştırılmasını kolaylaştırır. Bununla birlikte, Opal480 ile birlikte kullanıldığında net bir sinyal veren bir birincil antikor kullanmak en iyisidir, böylece sinyali otofloresandan daha yüksek olur.
Bu multipleks IHC panelleri kurulmuş olsa da, partiden partiye varyasyon dikkate alınması gereken bir şeydir. Tam multipleks IHC deneyine başlamadan önce monopleks IHC kontrolleri yaparak, bazen primer antikorların deneyden deneye daha güçlü veya daha zayıf performans gösterdiğini gözlemledik. Bunun nedenleri pipetleme hataları, yetersiz reaktif saklama koşulları ve raf ömrü olabilir. Bunu, deneyimlerimize dayanarak birincil antikor solüsyonunu ayarlayarak çözdük. Yukarıda belirtilen ayarlamaların hiçbirinin yapılması gerekmese bile, her multipleks IHC toplu deneyinde, monopleks IHC lekeli kontrol slaytlarına dayalı olarak maruz kalma sürelerinin ayarlanması önemlidir.
Araştırmamız başlangıçta farklı karsinom ve melanom tiplerine odaklandığından, multipleks IHC panellerinin minimal ayarlamalarla tümör tipleri arasında değiştirilebilir olması gerekiyordu. Bu nedenle, optimizasyon sürecine her zaman birden fazla (tümör) doku tipini dahil ettik ve immün hücre belirteçleri için primer antikorlar için seyreltmelerin farklı tümör tipleri arasında benzer tutulabileceğini gözlemledik. Bununla birlikte, karsinomlar ve melanom arasındaki tümör dokusu tespiti, farklı tümör belirteçlerine ihtiyaç duyar. Buna göre, tümör markörü her zaman her bir multipleks IHC panelinin sonunda çalışacak şekilde optimize edilmiştir ve şu anda her zaman Opal780 ile birlikte kullanılmaktadır, bu da tesadüfen bir multipleks IHC boyama prosedüründe son floroforda olması gerekir. Sonuç olarak multipleks IHC'nin sonunda tümör markörünü kullanarak, bu multipleks IHC panelleri, glioblastoma (yani GFAP) ve Hodgkin lenfoma (yani CD30) gibi diğer tümör tipleri ile kolayca değiştirilebilir. Anjiyosarkom için, sadece iki optimizasyon deneyi ile tümör belirteci olarak eritroblast transformasyonuna özgü ilişkili gen (ERG) ile bu lenfosit multipleks IHC panelini kullandık25. Optimizasyon, ERG primer antikorunun titrasyonunu ve sonunda ERG ile multipleks IHC panelinin test edilmesini içeriyordu.
Bu multipleks IHC panellerinde yapılan diğer ayarlamalar, belirli bir bağışıklık hücresi belirtecinin başka bir bağışıklık veya fonksiyonel belirteç ile değiştirilmesiyle de yapılabilir. Her değişiklik optimizasyon gerektirir. Optimizasyon protokolü daha önce açıklandığı gibi takip edilebilir17. Önerilen multipleks IHC panellerinde yapılan bazı değişiklikler, oluşturduğumuz ImmuNet algoritmalarına müdahale edecektir. Yeterli veri üretilmeli ve bu değişiklikleri algoritmaya uygulamak için zaman harcanmalıdır (her yeni belirteç ve/veya hücre fenotipi için en az 750 ek açıklama ve önceden eğitilmiş belirteçlerin doğrulanması için 150 ek açıklama). Burada sunulan paneller fonksiyonel belirteçler içermemektedir, ancak PD-1 ve PD-L1 gibi immün kontrol noktası belirteçlerinin çoğullama IHC panellerine uygulanması laboratuvarımızda yapılmaktadır. Bununla birlikte, negatif ve pozitif sinyallerde daha az ikili olan belirteçlerin analizinin daha zor olduğu kanıtlanmıştır ve grubumuzda aktif bir araştırma alanıdır.
Multipleks IHC ile eş zamanlı olarak değerlendirilebilen belirteç sayısı diğer yeni tekniklere göre sınırlıdır. Bu, bir FFPE bloğunun ardışık dilimleri üzerindeki farklı panelleri analiz ederek aşılabilirken, bu dilimleri uzamsal olarak karşılaştırmak zor olacaktır. Yönlendirme ve katlanmış artefaktlar, slayt hazırlığından sonra büyük olasılıkla aynı değildir. Bununla birlikte, multipleks IHC oldukça erişilebilirdir, bu da onu daha fazla kurum ve araştırmacı için çekici bir araç haline getirir ve bu nedenle, bir teşhis ortamında gelecekteki uygulamalar için daha uygundur. Çoklu tümör tipleri ve aşağı akış analiz boru hatları için multipleks IHC immün hücre panellerinin standardizasyonu ile, hastalar ve tümör tipleri arasındaki TME farklılıkları hakkında daha fazla bilgi edinilebilir. Bu, örneğin, TME'nin spesifik tedavilere antitümör yanıtındaki rolü hakkında daha fazla bilgi edinilmesine yol açabilir. Bu, tedaviye yanıt ve beklenen sağkalım gibi faktörleri tahmin etmek için yeni biyobelirteçlere bile yol açabilir. Genel olarak, bu, multipleks IHC'nin kişiselleştirilmiş bir tıp yaklaşımında klinik karar vermeye yardımcı olacak klinik bir araç haline gelmesini sağlayabilir. Kuşkusuz, analiz prosedürünün daha fazla adımı, günlük bir teşhis ortamında kullanım için uygun olması için muhtemelen otomatikleştirilmeli ve standartlaştırılmalıdır, bu nedenle henüz çoğunlukla fütüristik bir bakış açısıdır.
Tek bir numune slaytı üzerinde birden fazla işaretleyicinin analizi, teknik zorluklarına rağmen çok güçlü bir araç olabilir. Standartlaştırılmış deneysel protokoller ve sağlam bir analiz yöntemiyle, burada ImmuNet kullanarak tanımladığımız gibi, çoklu belirteçlerin nicelleştirilmesi onu klasik IHC'den daha bilgilendirici hale getirirken, multipleks IHC, yeni yüksek pleks deneysel yöntemlere kıyasla nispeten yüksek verim sağlar.

Bağışıklık hücreleri, virüsler ve bakteriler gibi patojenlere karşı korunmada çok önemli bir rol oynar, aynı zamanda kanserli hücrelere karşıda önemlidir 1. Bu nedenle, tümör mikroçevresi (TME) içindeki bağışıklık sistemi, prognostik ve prediktif biyobelirteçleri keşfetmek için çok şey vaat etmektedir2. İmmün hücre infiltratları, çeşitli kanser türlerinde prognoz ile ilişkilendirilmiştir, ancak bu henüz klinik bakımda uygulanmamıştır 3,4. Çoğu tümör tipinde, yüksek sayıda sitotoksik T hücresi ve T yardımcı 1 hücresi ve/veya düşük sayıda düzenleyici T hücresi iyi prognozlarla bağlantılıdır. Kolorektal kanserin TNM evrelemesine "İmmünoskor" adı verilen bir hastalığın dahil edilmesi ve TNM-I evrelemesinin 5,6 haline getirilmesi için çabalar devam etmektedir. İmmünoskor, iki farklı tümör bölgesindeki toplam T hücresi (CD3 ile tespit edilir) ve sitotoksik T hücresi (CD8 ile tespit edilir) sayısından türetilir: tümör çekirdeğine karşı tümörlerin invaziv sınırına (IM). İmmünoskor'un ayrıca melanom, akciğer kanseri ve meme kanserigibi diğer kanser türlerinde de prognostik değere sahip olduğu öne sürülmüştür 6,7,8,9. Ayrıca, immün hücre infiltratları, kontrol noktası blokajı immünoterapisine10 verilen yanıtla da ilişkili olabilir. Bununla birlikte, bu prediktif biyobelirteçler, klinik uygulamada rutin olarak uygulanmadan önce prospektif çalışmalarda doğrulanmalıdır. Ayrıca, anlamlı bir tahmin için tek bir biyobelirteçin yetersiz kalacağı da öne sürülmüştür11. Bu nedenle, farklı biyobelirteçleri birleştirerek bir hasta örneğinin tam bir haritasını oluşturmak, "kanser immünogramı" olarak adlandırılan bir durumda daha kapsamlı bir öngörücü biyobelirteç olarak önerilmiştir12.
TME içindeki bağışıklık hücrelerini incelemek için kullanılan yöntemler arasında, en eski ve en iyi bilinen teknik, başta kanser olmak üzere çeşitli hastalıklarda tanı testleri için rutin olarak kullanılan immünohistokimyadır (IHC)13. Bu teknik, uzun bir süre boyunca bir veya sadece birkaç belirteçin14 kullanımı ile sınırlıydı ve bu nedenle, araştırma ortamlarında akış sitometrisi ve gen ekspresyon profili oluşturma (GEP) gibi diğer tekniklerle rekabet etmedi. Bununla birlikte, rutin teşhis ve araştırmalarda tipik olarak kullanılan formalinle sabitlenmiş ve parafine gömülü (FFPE) tümör dokuları, akış sitometrisi ve GEP için (optimal olarak) uygun değildir. Ayrıca, GEP ve akış sitometrisi, hücre fenotipi ve işlevi hakkında çok fazla bilgi sağlasa da, mekansal bilgi eksikliği önemli bir dezavantajdır. Bu nedenle, bir tümörün bağışıklık hücresi ile infiltre edilen ve bağışıklık hücresi tarafından dışlanan bölgelerindeki farklılıklar gibi bir numune içindeki heterojenlik tespit edilemeyebilir15. FFPE dokularının multipleks analizi için, multipleks IHC, görüntüleme kütle sitometrisi ve bir doku kesiti16 içinde aynı anda birden fazla belirteci tespit etmek için kullanılabilen indEXing ile CO-Algılama (CODEX) gibi yeni platformlar geliştirilmiştir. TME'deki bağışıklık hücreleri, immünoterapi için en iyi biyobelirteçleri bulmak için geniş çapta incelenmektedir. Bununla birlikte, multipleks teknikler ve otomatik görüntü analizi kendi başlarına engeller ortaya çıkarmaktadır.
Laboratuvarımız, Opal/Tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) yöntemini kullanarak multipleks IHC boyama konusunda geniş deneyime sahiptir ve bunu bir IHC platformunda otomatikleştirmiştir (Malzeme Tablosuna bakınız)17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28, 29,30,31. Lenfositlerin, miyeloid hücrelerin ve dendritik hücrelerin (DC'ler) farklı alt kümelerinin tespiti için bağışıklık hücresi panellerini optimize ettik. Lenfositler veya karmaşık hücre morfolojileri (yani miyeloid hücreler ve DC'ler) için yoğun bağışıklık hücresi alanları içeren dokuların analiz edilmesi özellikle zordur ve mevcut bağışıklık hücrelerinin sayısını fazla veya küçümseme riski vardır. Bu sorunun üstesinden gelmek için, ImmuNet analiz yazılımı32 numaralı grubumuz tarafından geliştirildi ve bu makine öğrenimi hattı, bu farklı türdeki bağışıklık hücrelerinin tespit kalitesini büyük ölçüde artırdı. FFPE materyalinin elde edilmesinden, farklı doku bölmelerindeki bağışıklık hücresi yoğunluklarının ve bağışıklık hücresi tipleri arasındaki mesafelerin analizine kadar ayrıntılı bir protokol burada açıklanmaktadır.
Bu protokol, 2022'de dijital patoloji görüntüleyicinin uygulanmasından bu yana Radboud Üniversitesi Tıp Merkezi'nde multipleks IHC panellerinin nasıl gerçekleştirildiğini özetlemektedir. Tarif edilen multipleks IHC panelleri, tümör belirteci olarak bir pan-sitokeratin antikoru kullanılarak farklı karsinomlar (örneğin, akciğer, prostat, kolorektal, mesane, meme) veya tümör belirteçleri olarak melanosit ile ilişkili antikorların kullanılmasıyla melanom için kullanılabilir. Bu multipleks IHC protokolleri, primer antikor konsantrasyonu, florofor kombinasyonları ve boyama prosedürünün sırası açısından dikkatlice optimize edilmiştir. Biz ve diğerleri, multipleks IHC panel optimizasyonunu daha önce 17,33,34,35 olarak tanımladık. Multipleks IHC panelleri uyarlanabilir, ancak açıklanan analiz boru hatlarının değerlendirilmesi ve potansiyel olarak buna göre ayarlanması veya yeniden eğitilmesi gerekir. Açıklanan yedi renkli multipleks IHC protokolleri, Opal floroforlar Opal480, Opal520, Opal570, Opal620, Opal690, Opal780 ve 4 ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) kullanır, böylece görüntüleyicide kolay karıştırma ve hızlı tarama "Multispektral Tek Dokunuşla İmmünofloresan" (MOTiF) ile sağlanır. Dokuz renkli boyama ve tarama bu protokolde açıklanmamıştır, çünkü bu, deney düzeneğinin daha da ince ayarını ve sıvı kristal ayarlanabilir filtreyi kullanan görüntüleyicide başka bir tarama modunu gerektirir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>anti-CD14</td>
			<td>Cell Marque&#160;</td>
			<td>114R-16</td>
			<td>section 3, clone EPR3653</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD163</td>
			<td>Cell Marque&#160;</td>
			<td>163M-15</td>
			<td>section 3, clone MRQ-26</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD19</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab134114</td>
			<td>section 3, clone EPR5906</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD1c (BDCA1)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TA505411</td>
			<td>section 3, clone OTI2F4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD20</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MS-340-S</td>
			<td>section 3, clone L26</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD3</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>RM-9107</td>
			<td>section 3, clone sp7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD303/BDCA2</td>
			<td>Dendritics via Enzo Lifesciences/Axxora</td>
			<td>DDX0043</td>
			<td>section 3, clone 124B3.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD56</td>
			<td>Cell Marque&#160;</td>
			<td>156R-94</td>
			<td>section 3, clone MRQ-42</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD66b</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555723</td>
			<td>section 3, clone G10F5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD68</td>
			<td>Dako Agilent</td>
			<td>M087601</td>
			<td>section 3, clone PG-M1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD8</td>
			<td>Dako Agilent</td>
			<td>M7103</td>
			<td>section 3, clone C8/144B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Foxp3</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>14-4777</td>
			<td>section 3, clone 236A/E7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Gp100</td>
			<td>Dako Agilent</td>
			<td>M063401</td>
			<td>section 3, clone HMB45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HLA-DR, DP, DQ</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53302</td>
			<td>section 3, clone CR3/43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-MART-1</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MS-799</td>
			<td>section 3, clone A103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-pan cytokeratin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab86734</td>
			<td>section 3, clone AE1/AE3 + 5D3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-SOX10</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>383R</td>
			<td>section 3, clone EP268</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Tyrosinase</td>
			<td>Sanbio</td>
			<td>MONX10591</td>
			<td>section 3, clone T311</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-XCR1</td>
			<td>Cell Signaling Technologies via Biok&#233;</td>
			<td>44665S</td>
			<td>section 3, clone D2F8T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibody diluent</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>SKU&#160;ARD1001EA</td>
			<td>section 3, from Opal 7-Color Automation IHC Kit 50 slide (can optionally also be replaced by TBST with 10% BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond Aspirating Probe</td>
			<td>Leica Biosciences</td>
			<td>S21.0605</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond Aspirating Probe Cleaning</td>
			<td>Leica Biosciences</td>
			<td>CS9100</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond Dewax Solution</td>
			<td>Leica Biosciences</td>
			<td>AR9222</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond Objectglas label + print lint</td>
			<td>Leica Biosciences</td>
			<td>S21.4564.A</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond Research Detection System 2</td>
			<td>Leica Biosciences</td>
			<td>DS9777</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond RX autostainer&#160;</td>
			<td>Leica Biosciences</td>
			<td>-</td>
			<td>section 3, automated platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond TM Epitope Retrieval 1 - 1 L</td>
			<td>Leica Biosciences</td>
			<td>AR9961</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond TM Epitope Retrieval 2 - 1 L</td>
			<td>Leica Biosciences</td>
			<td>AR9640</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond TM Wash Solution 10x - 1 L</td>
			<td>Leica Biosciences</td>
			<td>AR9590</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BOND Universal Covertile</td>
			<td>Leica Biosciences</td>
			<td>S21.4611</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bond(TM) Titration Kit</td>
			<td>Leica Biosciences</td>
			<td>OPT9049</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip 24 x 32 mm #1 (0.13-0.16 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15717592</td>
			<td>section 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslip 24 x 50 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0146</td>
			<td>section 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI Fluoromount-G</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0100-20</td>
			<td>section 3, whenever monoplex slides need to be quickly checked, not for official analysis, then DAPI is stained seperately for better results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>section 2, home made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 99.5%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>4099.9005</td>
			<td>section 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>section 3&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>haematoxyline</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>section 2, home made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmuNet</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>immune cell detection and phenotyping pipeline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm software 2.4.10</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>-</td>
			<td>section 4 &#38; 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPAL 480 reagent pack</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>FP1500001KT</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPAL 520 reagent pack</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>FP1487001KT</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPAL 570 reagent pack</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>FP1488001KT</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPAL 620 reagent pack</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>FP1495001KT</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPAL 690 reagent pack</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>FP1497001KT</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPAL 780 reagent pack</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>FP1501001KT</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 7-Color Automation IHC Kit 50 slide</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>NEL821001KT</td>
			<td>section 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhenoChart 1.1.0</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>-</td>
			<td>section 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhenoImagerHT</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>CLS143455</td>
			<td>section 4, digital pathology imager with slide viewer and imaging software (formerly known as Vectra Polaris)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-D mounting medium</td>
			<td>Klinipath</td>
			<td>7280</td>
			<td>section 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuPath 0.3.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>whole slide image analysis software platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R 4.1.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide boxes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0737</td>
			<td>section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus</td>
			<td>Thermo Scientific through VWR</td>
			<td>631-9483</td>
			<td>section 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectra Polaris software 1.0.13</td>
			<td>Akoya BioSciences</td>
			<td>-</td>
			<td>section 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>4055-9005</td>
			<td>section 2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplex immunohistochemical analysis of the spatial immune cell landscape of the tumor microenvironment

Tümör mikroçevresinin bağışıklık hücresi manzarası, potansiyel olarak prognostik ve öngörücü biyobelirteçlerin keşfi için bilgi içerir. Multipleks immünohistokimya, mekansal bilgilerini korurken tümör dokularındaki farklı bağışıklık hücresi türlerini görselleştirmek ve tanımlamak için değerli bir araçtır. Burada, doku kesitlerindeki lenfosit, miyeloid ve dendritik hücre popülasyonlarını analiz etmek için ayrıntılı protokoller sunuyoruz. Formalinle sabitlenmiş parafine gömülü bölümlerin kesilmesinden, otomatik bir platformda otomatik multipleks boyama prosedürlerine, slaytların multispektral görüntüleme mikroskobunda taranmasına ve şirket içinde geliştirilen bir makine öğrenimi algoritması olan ImmuNet kullanılarak görüntülerin analizine kadar. Bu protokoller, numunenin farklı bölmelerindeki (tümör ve invaziv sınır) bağışıklık hücrelerini analiz etmek ve en yakın komşu analizini uygulamak için tümör belirteçlerini basitçe değiştirerek çeşitli tümör örneklerine uygulanabilir. Bu analiz tümör örnekleriyle sınırlı değildir, aynı zamanda diğer (olmayan) patojenik dokulara da uygulanabilir. Son birkaç yılda ekipman ve iş akışında yapılan iyileştirmeler, üretim sürelerini önemli ölçüde kısalttı ve bu da bu prosedürün teşhis ortamında gelecekteki uygulamasını kolaylaştırdı.

Immune cells play a crucial role in the protection against pathogens such as viruses and bacteria, but also against cancerous cells1. Therefore, the immune system within the tumor microenvironment (TME) holds a lot of promise for discovering prognostic and predictive biomarkers2. Immune cell infiltrates have been correlated to prognosis in various types of cancer, although this has not been implemented in clinical care yet3,4. In most tumor types, high numbers of cytotoxic T cells and T helper 1 cells and/or low numbers of regulatory T cells are linked to good prognoses. Efforts are ongoing to incorporate a so-called &#34;Immunoscore&#34; into the TNM staging of colorectal cancer, turning it into TNM-I staging5,6. The Immunoscore is derived from the total number of T cells (detected with CD3) and cytotoxic T cells (detected with CD8) in two different tumor regions: the tumor core versus the invasive margin (IM) of tumors. The Immunoscore has also been proposed to be of prognostic value in other cancer types, such as melanoma, lung cancer, and breast cancer6,7,8,9. Furthermore, immune cell infiltrates may also correlate to response to checkpoint blockade immunotherapy10. However, these predictive biomarkers must be validated in prospective studies before they can be routinely implemented in clinical practice. Moreover, it has also been proposed that a single biomarker will be insufficient for meaningful prediction11. Therefore, creating a complete map of a patient sample by combining different biomarkers has been proposed as a more comprehensive predictive biomarker in a so-called &#34;cancer immunogram&#34;12.
Among the methods for studying immune cells within the TME, the oldest and most well-known technique is immunohistochemistry (IHC), routinely used for diagnostic testing in several diseases, especially cancer13. This technique was limited to the use of one or only a few markers14 for a long time and therefore, was outcompeted in research settings by other techniques such as flow cytometry and gene expression profiling (GEP). However, the formalin-fixed and paraffin-embedded (FFPE) tumor tissues typically used in routine diagnostics and research are not (optimally) suitable for flow cytometry and GEP. Furthermore, although GEP and flow cytometry provide a lot of insight into cell phenotype and function, the lack of spatial information is a major disadvantage. Therefore, heterogeneity within a sample, such as differences in immune cell-infiltrated versus immune cell-excluded areas of a tumor, could go undetected15. Novel platforms have been developed for multiplex analysis of FFPE tissues, such as multiplex IHC, imaging mass cytometry, and CO-Detection by indEXing (CODEX) that can be used to detect multiple markers simultaneously within a tissue section16. Immune cells in the TME are being widely studied to find the best biomarkers for immunotherapy. However, multiplex techniques and automated image analysis pose hurdles of their own.
Our laboratory has extensive experience in multiplex IHC staining using the Opal/Tyramide signal amplification (TSA) method and has automated this on a&#160;IHC platform (see the Table of Materials)17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. We have optimized immune cell panels for the detection of different subsets of lymphocytes, myeloid cells, and dendritic cells (DCs). Tissues that contain dense immune cell areas - for lymphocytes or complex cell morphologies (i.e., myeloid cells and DCs) - are particularly challenging to analyze, with a risk of over- or underestimating the number of immune cells present. To overcome this problem, ImmuNet analysis software was developed by our group32, and this machine-learning pipeline improved the quality of the detection of these different types of immune cells immensely. A detailed protocol from obtaining the FFPE material to the analysis of immune cell densities in different tissue compartments and distances between immune cell types is described here.
This protocol outlines how the multiplex IHC panels are performed at the Radboud University Medical Center since the implementation of the digital pathology imager in 2022. The described multiplex IHC panels can be used for different carcinomas (e.g., lung, prostate, colorectal, bladder, breast) with the use of a pan-cytokeratin antibody as a tumor marker or for melanoma with the use of melanocyte-associated antibodies as tumor markers. These multiplex IHC protocols have been carefully optimized in terms of primary antibody concentration, fluorophore combinations, and the sequence of the staining procedure. We and others have described multiplex IHC panel optimization earlier17,33,34,35. Multiplex IHC panels can be adapted, but the described analysis pipelines need to be evaluated and potentially adjusted or retrained accordingly. The described seven-color multiplex IHC protocols make use of the Opal fluorophores Opal480, Opal520, Opal570, Opal620, Opal690, Opal780, and 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), so that easy unmixing and fast scanning on the imager is enabled with &#34;Multispectral One Touch ImmunoFluorescence&#34; (MOTiF). Nine-color staining and scanning is not described in this protocol as this requires even more finetuning of the experimental setup and another mode of scanning on the imager that uses the liquid crystal tunable filter.

Yazar Spotlight: Tümörlerin Bağışıklık Hücresi Manzarasına İlişkin İçgörülerin Kilidini Açmak

Tümör Mikroçevresinin Mekansal İmmün Hücre Manzarasının Multipleks İmmünohistokimyasal Analizi

Our aim is to identify the amount, type, and location of immune cells within the tumor microenvironments. In the field of immunochemistry, there have been major advance in technology in recent years. Advance in multiplex immunochemistry technology allow for more markers to be reliably studied.Current experimental challenges are visualize specific types of immune cells within tumor samples, which have been overcome by using the multiplex immunochemistry methods. However, accurate automatic analysis of these images is still a challenge that we're working on. The differences between immune cell landscape between primary and metastatic tumors generate questions such as, what tumor intrinsic properties drive these differences, and what do these differences mean for therapies that target the immune system?Next to our exploratory work, we will also focus on clinically relevant questions such as how the immune cell landscape of the tumor is affected by different types of anti-cancer therapies and whether the immune cell landscape could predict the outcome of therapy.

Read this Scientific Article Protocol about Multiplex Immunohistochemical Analysis of the Spatial Immune Cell Landscape of the Tumor Microenvironment at JoVE.com

Bu protokol, multipleks immünohistokimya kullanılarak tümör mikroçevresinin immün hücre karakterizasyonunun nasıl yapıldığını ayrıntılı olarak açıklar.

The immune cell landscape of the tumor microenvironment potentially contains information for the discovery of prognostic and predictive biomarkers. ...

Amacımız, tümör mikroçevreleri içindeki bağışıklık hücrelerinin miktarını, türünü ve yerini belirlemektir. İmmünokimya alanında, son yıllarda teknolojide büyük ilerlemeler olmuştur. Multipleks immünokimya teknolojisindeki ilerleme, daha fazla markörün güvenilir bir şekilde çalışılmasına olanak tanır.Mevcut deneysel zorluklar, multipleks immünokimya yöntemleri kullanılarak üstesinden gelinen tümör örneklerinde spesifik immün hücre tiplerini görselleştirmektir. Bununla birlikte, bu görüntülerin doğru bir şekilde otomatik olarak analiz edilmesi, üzerinde çalıştığımız bir zorluktur. Primer ve metastatik tümörler arasındaki bağışıklık hücresi manzarası arasındaki farklar, bu farklılıkları hangi tümörün içsel özelliklerinin yönlendirdiği ve bu farklılıkların bağışıklık sistemini hedef alan tedaviler için ne anlama geldiği gibi sorular üretir.Keşif çalışmalarımızın yanı sıra, tümörün bağışıklık hücresi manzarasının farklı anti-kanser tedavilerinden nasıl etkilendiği ve bağışıklık hücresi manzarasının tedavinin sonucunu tahmin edip edemeyeceği gibi klinik olarak ilgili sorulara da odaklanacağız.

multiplex-immunohistochemical-analysis-spatial-immune-cell-landscape

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Multiplex Immunohistochemical Analysis of the Spatial Immune Cell Landscape of the Tumor Microenvironment

1.3K Görüntüleme.  Radboudumc. Amacımız, tümör mikroçevreleri içindeki bağışıklık hücrelerinin miktarını, türünü ve yerini belirlemektir. İmmünokimya alanında, son yıllarda teknolojide büyük ilerlemeler olmuştur. Multipleks immünokimya teknolojisindeki ilerleme, daha fazla markörün güvenilir bir şekilde çalışılmasına olanak tanır.Mevcut deneysel zorluklar, multipleks immünokimya yöntemleri kullanılarak üstesinden gelinen tümör örneklerinde spesifik immün hücre tiplerini g?...

Video: Yazar Spotlight: Tümörlerin Bağışıklık Hücresi Manzarasına İlişkin İçgörülerin Kilidini Açmak

The immune cell landscape of the tumor microenvironment potentially contains information for the discovery of prognostic and predictive biomarkers. Multiplex immunohistochemistry is a valuable tool to visualize and identify different types of immune cells in tumor tissues while retaining its spatial information. Here we provide detailed protocols to analyze lymphocyte, myeloid, and dendritic cell populations in tissue sections. Starting from cutting formalin-fixed paraffin-embedded sections, automatic multiplex staining procedures on an automated platform, scanning of the slides on a multispectral imaging microscope, to the analysis of images using an in-house-developed machine learning algorithm ImmuNet. These protocols can be applied to a variety of tumor specimens by simply switching tumor markers to analyze immune cells in different compartments of the sample (tumor versus invasive margin) and apply nearest-neighbor analysis. This analysis is not limited to tumor samples but can also be applied to other (non-)pathogenic tissues. Improvements to the equipment and workflow over the past few years have significantly shortened throughput times, which facilitates the future application of this procedure in the diagnostic setting.

This protocol describes in detail how immune cell characterization of the tumor microenvironment using multiplex immunohistochemistry is carried out.

Kanser Araştırmaları

Workflow for Immune Cells Detection Using the Machine Learning Algorithm ImmuNet

After performing immunohistochemistry on the FFPE tissues, image the sections using the digital pathology imager. Launch the software to perform spectral unmixing of the annotated images. Select File, then click Open Image, and choose the QPTIFF files to upload the images into the software.Allow the stamps marked as informed projects to upload into the project. Load the QPTIFF files prepared for the autofluorescence compensation. Select the autofluorescence on the image tool to draw a line on the image from the unstained slide through autofluorescent structures like erythrocytes and collagen to compensate for autofluorescence.Then navigate to the Edit Markers and Colors section. Assign marker names that match the Opal fluorophore, and adjust the color settings to your preferred option. Select Prepare All located in the lower left corner of the interface to initiate the unmixing of fluorophores.Examine all images to check the visibility of all signals and the successful completion of the unmixing process. Select the eyeball icon to turn off and on all the markers one by one to check the quality. Now navigate to the Export tab and create a new empty export directory by clicking the Browse button located under the Export directory.Select composite image and component images multi-image TIFF under the images to export tab. Navigate to the Batch Analysis tab found vertically on the left for batch processing of slides and select create separate directories for each item under the export options. To add slides for analysis, select QPTIFF files under the Add Slides button and load these into the batch analysis.Select Run to commence the batch processing of slides. Create a new folder containing only the component files from spectral unmixing, ensuring the hierarchical folder structure remains intact. Launch the whole slide viewer software.Click Create Project on the left side and create or select a new empty folder with an appropriate name. Then click Automate and choose Show script editor. Copy and paste the existing script and modify the location to direct it toward the folder that contains all the slide component files.Select Run to begin the process of batch stitching slides, and then allow it to complete. Now move the recently generated OME TIFF files into the QuPath project and save them as a new project. When a new window appears, select set image type as fluorescence, then click the Import button.Navigate to the menu on the left, select a sample from the list and double click to open the chosen sample. Adjust the intensity of the channels by clicking the Contrast icon to enhance visibility. Select all channels and opt to reset.Ensure the autofluorescence is toggled off. To draw a region of interest or ROI for the tumor, click the contrast icon again then select Show grayscale. After that, select the tumor marker channel and adjust the intensity for optimal visibility.Click the brush tool to draw an ROI around the tumor. Click the one tool and adjust the ROI while pressing the alt key to smooth the ROI from the outside. When finished, merge any separated parts of the tumor into the same ROI.Right click the ROI annotation in the list on the left, select Set Properties, and provide a suitable name. For instance, Tumor. Expand the ROI for the invasive margin from the tumor region by selecting Objects, then Annotations, followed by Expand Annotations.Choose the desired size for the expansion radius. Select remove interior and constrain to parent. Click on the contrast icon, select the autofluorescence channel and adjust the intensity for optimal visibility.Click the wand and adjust the ROI while pressing the alt key to smooth the ROI from the outside and remove any background that should not be part of this ROI. Right click the annotation in the list on the left. Then select Set Properties to assign a suitable name, such as invasive margin or IM to the ROI.If desired, change its color. To export the annotations, navigate to the File option, click Object Data, Export as GeoJSON, and select Export All Objects. Continue with the default selection on export as feature collection, and save it in a preferred location.