Ce travail a été soutenu en partie par le Conseil écossais de financement (subvention Nombre HR07005; <a href="http://www.sfc.ac.uk/">http://www.sfc.ac.uk/</a> ), la recherche médicale en Ecosse ( <a href="http://www.medicalresearchscotland.org.uk/">http://www.medicalresearchscotland.org.uk/</a> ), le cancer recherche expérimentale contre le cancer au Royaume-Uni Centre de médecine ( <a href="http://www.cancerresearchuk.org/">http://www.cancerresearchuk.org/</a> ) et Breakthrough Breast Cancer ( <a href="http://breakthrough.org.uk/">http://breakthrough.org.uk/</a> ).

1. Préparation des tissus <ol class="lalpha"><li> Microtomie <ol class="lroman"><li> Section de paraffine fixes au formol intégrés blocs tumeur à 4 micron d&#39;épaisseur à l&#39;aide d&#39;un microtome rotatif. </li><li> Placer les sections sur des lames microscopiques chargées positivement. </li><li> Incuber les lames dans un four à 37 ° C la nuit. </li></ol></li><li> Stockage <ol><li> Sections Conserver dans un -18 ° C à -25 ° C congélateur, afin d&#39;éviter la perte d&#39;antigénicité. </li></ol></li></ol> 2. Immunofluorescence des coupes de tissus <ol class="lalpha"><li> Déparaffinage et réhydratation <ol class="lroman"><li> Déparaffinage diapositives dans le xylène à deux reprises pendant 5 min. </li><li> Réhydrater lames dans 99%, 99%, 80%, 50% d&#39;éthanol et d&#39;eau du robinet pendant 2 min de chaque dans l&#39;ordre. </li></ol></li><li> Récupération d&#39;antigène <ol class="lroman"><li> Effectuez la récupération d&#39;antigène de la chaleur induite, en utilisant 0,15 mM citrate de sodium, pH 6,0 tampon dans un autocuiseur pendant 5 min dans le microwave. </li><li> Refroidir diapositives pendant 20 min. </li><li> Rincer les lames dans PBST 0,05% pendant 5 min sur la bascule. </li></ol></li><li> Blocage procédure <ol class="lroman"><li> Traiter sections en peroxyde d&#39;hydrogène à 3% pendant 10 min. </li><li> Rincer les lames dans PBST 0,05% pendant 5 min sur la bascule. </li><li> Ajouter les sections à crémaillère Immunocoloration Sequenza. </li><li> Traiter des sections dans le bloc des protéines sériques gratuite pour 10 min. </li></ol></li><li> D&#39;incubation des anticorps primaires <ol class="lroman"><li> Incuber anticorps primaire dilué à une dilution optimale dans le diluant d&#39;anticorps Dako pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Rincer à 0,05% PBST trois fois pendant 5 min chacune. </li></ol></li><li> Épithéliales masque (cytokératine) d&#39;incubation <ol class="lroman"><li> Incuber de souris anti-cytokératine poêle, dilué à 1:50 dans le diluant d&#39;anticorps Dako nuit à 4 ° C. </li></ol></li><li> Visualisation de masque épithéliales <ol class="lroman"><li> Préparer une dilution 1:25 de la chèvre anti-souris Alexa555 sd&#39;anticorps dans le econdaires pré-dilué Envision de chèvre-lapin solution d&#39;anticorps HRP. Incuber les lames dans l&#39;obscurité pendant 1,5 heures à température ambiante. </li><li> Rincer à 0,05% PBST trois fois pour chaque 5min. </li></ol></li><li> Visualisation de la cible <ol class="lroman"><li> Transférer les diapositives de la Sequenza de la chambre de l&#39;humidité. </li><li> Combinez le diluant d&#39;amplification du signal cible (E baignoire HistoRx) et le tyramide Cy5 (tube F HistoRx) à 1:50 de concentration. Vortex pour bien mélanger. Incuber les lames dans l&#39;obscurité pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Rincer à 0,05% PBST trois fois pendant 5 min chacune. </li><li> Déshydrater lames dans l&#39;éthanol à 80% pendant 1 min. </li><li> Diapositives de l&#39;air sec dans l&#39;obscurité. </li></ol></li><li> Contre-coloration et de lamelles <ol class="lroman"><li> Appliquer moyennes DAPI montage sur les lamelles et les placer le couvre-fil des coupes de tissus. </li><li> Diapositives sécher toute la nuit dans l&#39;obscurité. </li><li> Après les diapositives ont séché, sécurisé avec du vernis à ongles à la norme ENassurer la préservation à long terme et conserver au réfrigérateur à 4 ° C. </li></ol></li></ol> 3. Capture d&#39;images à balayage section entière <ol class="lalpha"><li> Chargez jusqu&#39;à cinq diapositives dans la cassette glisser du scanner Aperio ScanScope glisser FL. </li><li> Pour chaque diapositive, sélectionnez la région en général à l&#39;image en utilisant l&#39;interface de la console ScanScope. Sélectionnez la région pour englober tous les tissus sur la diapositive, indépendamment du motif de coloration ou d&#39;autres aspects observables de l&#39;échantillon. </li><li> Utilisation de la console ScanScope, pour chaque canal (DAPI, Cy3 et Cy5) déterminent une exposition optimale comme suit: <ol class="lroman"><li> Sélectionnez une région de tissu pour interroger - ce domaine devrait, idéalement, être dans la région de la tumeur des tissus pour fournir la meilleure représentation. </li><li> Utilisation de la fonction ScanScope exposition automatique de la console, d&#39;évaluer le temps d&#39;exposition suggéré pour chaque canal, avec netteté de l&#39;image. </li><li> Répétez jusqu&#39;à 3-5 sur les régions de chaque échantillon de confirm stabilité de la valeur. </li></ol></li><li> Sélectionnez une région supplémentaire (comme indiqué par un losange bleu sur l&#39;image console ScanScope) loin du tissu, mais encore dans la région lamelle de la diapositive, de définir une zone de fond, où plane images de correction sur le terrain seront acquis pour chaque filtre. </li><li> Revoir ces images avant l&#39;acquisition de l&#39;image. Si les images semblent avoir de fond élevé ou d&#39;autres artifices, la région de l&#39;image doit être déplacé et les nouvelles images acquises. </li><li> Les images acquises diaporama numérique sont téléchargées automatiquement dans la base de données du spectre Aperio. </li></ol> 4. L&#39;analyse d&#39;image automatisée AQUA <ol class="lalpha"><li> Voir les images numériques diapositive entière dans la base de spectre et d&#39;annoter les zones tumorales d&#39;intérêt dans le contexte de l&#39;ensemble du tissu et le modèle de coloration (s). </li><li> Sélectionnez la diapositive à analyser à l&#39;aide de la liste AQUAnalysis diaporama numérique dans la base de données du spectre en double cliquant sur le poucel&#39;image des ongles (alternativement, sélectionnez la case à cocher à côté de l&#39;image, puis sélectionnez «Afficher les images&quot; dans le menu en haut de la liste). Cela ouvre automatiquement le logiciel et la ImageScope image couleur fusionnées de l&#39;échantillon de tissu. </li><li> Utilisez ce logiciel pour naviguer dans l&#39;image en utilisant les outils fournis. </li><li> Utilisation de l&#39;accompagnement H &amp; E (soit la diapositive physique ou une image annotée), annoter la région d&#39;intérêt sur l&#39;image fluorescente. Plusieurs régions d&#39;intérêt, individuel zones encerclées, peuvent être sélectionnés sur un seul échantillon. Il ya aussi un &quot;négatif&quot; outil qui est utilisé pour exclure des zones au sein d&#39;une région sélectionnée (c&#39;est à dire des tissus endommagés, les zones de mauvaise histologie, non tumoral domaines, débris, etc.) </li><li> Enregistrer la couche d&#39;annotation (s) sur l&#39;image. </li><li> Retour au menu principal de Spectrum et sélectionnez la case à côté de l&#39;image qui vient d&#39;être commentée. Sélectionnez &quot;Analyser&quot; de la bande de menu en haut de la liste. </li><li> Dans la fenêtre d&#39;analyse qui va arriver, select &quot;HistoRx AQUA Analyse&quot; dans le menu déroulant. </li><li> S&#39;il ya de multiples couches d&#39;annotations, utilisez les cases à cocher pour sélectionner la couche appropriée (s) pour analyse. </li><li> Appuyez sur le &quot;Analyser&quot; bouton lorsque vous êtes prêt à commencer. </li><li> À ce stade, une fenêtre de console minimisé apparaîtra dans la barre des tâches Windows. Cela permet d&#39;afficher la progression du transfert d&#39;images de la base de données du spectre à l&#39;ordinateur local (le «pull» de fonctionnement). </li><li> Une fois les données transférées, AQUAnalysis va se lancer. L&#39;utilisateur peut alors utiliser toutes les fonctions internes du logiciel pour visualiser, parcourir et analyser les images. </li><li> La région annotée de l&#39;image de la base du spectre est divisé en carreaux de 512x512 pixels d&#39;image - dont chacun sera marqué individuellement. </li><li> Pour cette étude, un algorithme non supervisé de cotation AQUA, basée sur le regroupement des données, a été utilisé 8. Dans cet algorithme, les scores sont générés AQUA comme suit: <ol class="lroman"><li> L&#39;image pan-cytokératine SIgnal est seuillé dessus du fond et de ces pixels sont utilisés pour définir une tumeur «masque» qui est ensuite utilisé pour les calculs ultérieurs. L&#39;expression de haute pan-cytokératine pixels définissent également les régions cytoplasmiques / non-nucléaires des cellules tumorales. </li><li> Pixels avec un signal élevé dans le canal DAPI qui sont dans le masque de la tumeur sont identifiés comme étant de nature nucléaire. </li><li> L&#39;algorithme de clustering examine également les pixels qui ont de faible intensité soit pour coloration DAPI ou expression cytokératine et tente de les attribuer en partie à l&#39;autre les compartiments nucléaires ou cytoplasmiques, ou de fond. </li><li> Une fois que tous les pixels sont attribués à l&#39;un des compartiments tumoraux ou de fond, l&#39;intensité du signal de la protéine cible (ER ou HER2) est alors calculé au sein de chacun des compartiments et normalisé à la taille des compartiments, produisant ainsi des scores AQUA. </li><li> Les images qui n&#39;ont pas de représentation suffisante des tumeurs n&#39;ont pas été marqués (tels que définis par ceux qui ont less de 5% de pixels représentant une tumeur). Ces régions produisent également la valeur d&#39;une «Résultat final» appelé «Fail» et peut donc être retiré dans les prochains analyses statistiques. </li><li> De plus, si après examen, un opérateur identifié des domaines qui n&#39;étaient pas adaptés pour la notation en raison de l&#39;échantillon ou des artefacts d&#39;imagerie (par exemple le tissu plié, débris), ces champs ont été expurgés de marquer et a produit un «résultat final» appelé «Fail». </li></ol></li><li> Les résultats de notation AQUA sont des tableaux de scores associés à chaque tuile pixel 512x512 dans la région d&#39;intérêt dans un échantillon coupe de tissu ensemble. Ces fichiers, au format. CSV, peut ensuite être utilisé pour l&#39;analyse statistique ultérieure. </li></ol> 5. Analyse statistique: Toutes les analyses statistiques sont réalisées dans SPSS (IBM) <ol><li> Lorsque c&#39;est possible, pour les grandes opérations, de générer des fichiers SPSS code de syntaxe (. SPS) pour effectuer des manipulations de données et les étapes d&#39;analyse. Un code de syntaxe exemple est fourni sous forme de fichiers supplémentaires. </li><li&gt; Lire les fichiers de données dans SPSS. Retirer des variables inutilisées dans les données brutes (paramètres de l&#39;instrument, par exemple précis, les scores d&#39;AQUA non utilisées compartiments). </li><li> Lorsque les régions ont un «résultat final» du «Fail» (voir ci-dessus), marquer ces valeurs comme SYSMIS, ce qui leur enlève de l&#39;analyse numérique. </li><li> Toutes les données agrégées pour toutes les diapositives pour chaque marqueur (ER ou HER2) dans un seul ensemble de données de base en format SPSS. Utilisez ce fichier maître pour tous les calculs ultérieurs. </li><li> En utilisant un fichier de syntaxe SPSS (un pour chaque marqueur: ER ou HER2 (voir la syntaxe des fichiers complémentaires) de données a ensuite été validée et les indices de diversité de Simpson calculé comme suit: <ol class="lroman"><li> Générer un fichier maître d&#39;analyse, afin d&#39;empêcher la modification des données de base mis généré précédemment. </li><li> Valider les données de base opposer les données brutes et les images générées. </li><li> Produire des statistiques sommaires pour les scores AQUA pour chaque échantillon (nombre de champs, le score moyen, le score médian, minimuScore m, le score maximum, et l&#39;écart-type des scores pour l&#39;échantillon). </li><li> Vérifier un échantillon aléatoire de résultats contre les fichiers originaux premières données de sortie et contre les données d&#39;image brutes marqué. </li></ol></li><li> Pour générer les images carte de la chaleur (figures 2 et 3): <ol class="lroman"><li> «Bin» les données pointage AQUA (en utilisant la fonction «Regroupement visuel&quot; dans SPSS) en huit niveaux différents. Pour ER, les scores nucléaires ont été utilisées, pour HER2, les scores cytoplasmiques ont été utilisés. </li><li> Dériver des bacs de telle sorte que chaque bac représente un pourcentage égal de cas disponibles à partir du jeu de données complet. </li><li> Utilisez &#39;Split File »la fonction de SPSS afin que toutes les sorties suivantes seraient sur un niveau de« l&#39;échantillon par diapositive /&#39;. </li><li> Parcelle de chaque région (correspondant à une tuile 512x512) par ses coordonnées x, y et couleur avec une valeur correspondant à la poubelle dans laquelle il a été attribué (voir figures 2 et 3). </li></ol></li><li> Pour générer les scores hétérogénéité, le code a été écrit pour générer un SimpsonIndice de la diversité en utilisant des scores AQUA. <ol class="lroman"><li> Indice de Simpson de la diversité, comme utilisée ici, est définie comme: <img alt="L&#39;équation 1" src="/files/ftp_upload/3334/3334eq1.jpg" /> Où N est le nombre total des scores / champs utilisés pour un échantillon donné et n est le nombre de scores / champs dans un groupe donné de résultats standardisés (telle que décrite ci-dessous). </li></ol></li><li> Utilisez le fichier maître d&#39;analyse décrites ci-dessus pour la source de données. Dans les exemples illustrés, tous les calculs ER utilisé le score AQUA nucléaire et HER2 calculs utilisés le score AQUA cytoplasmique. Effectuer les calculs ci-dessous pour chaque échantillon / diapositives. </li><li> Comme les données de fluorescence est soumise à l&#39;instabilité de variance, de sorte que l&#39;ampleur erreur se propage avec une intensité, appliquer logarithmique (base 2) la normalisation de tous les scores AQUA. </li><li> En outre transformer les normalisé (transformation logarithmique) les données en z-(standard) scores. <ol class="lroman"><li> La transformation du Z-score est calculé unes: Z = (score AQUA - moyenne de tous les scores d&#39;un échantillon) / écart-type des scores pour l&#39;échantillon. Cela se traduit par la distribution des scores dans une distribution des écarts autour de la valeur centrale de l&#39;écart zéro. </li></ol></li><li> Bin ces valeurs Z-score en six groupes (&lt;-2, -2 - -1, -1 - 0, 0 - 1, 1 - 2,&gt; 2). </li><li> Calculer le nombre de valeurs attribuées dans chaque bac et la somme pour chaque bac. Utilisez cette valeur, ainsi que le nombre total de champs, de calculer une valeur pour chacune des six bacs utilisés pour l&#39;indice. </li><li> Somme de ces valeurs et de soustraire de l&#39;un à produire de l&#39;indice de la diversité. </li><li> L&#39;indice de diversité est un indicateur de la dispersion des notes autour de la moyenne pour un échantillon donné. Ainsi, plus les indices indiquent une plus large diffusion des résultats, ou de l&#39;hétérogénéité accrue de l&#39;expression. Inversement, la baisse des indices, indiquent moins de variation dans la mesure expression et l&#39;expression homogène dans l&#39;échantillon. Ceci est illustré dans FigurES 2 et 3. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Thérapie ciblée avec des agents de toxicité relativement faible, tels que le tamoxifène et le trastuzumab, ne sont pas standard de soins pour les patients atteints de cancer de l&#39;ovaire. Il ya de bonnes preuves que le platine-taxane chimiothérapie de première ligne est supérieure à d&#39;autres schémas chimiothérapeutiques pour les 9-13 cancer des ovaires, et tandis que 70-80% des patients répondent initialement, la plupart vont rechuter et de mourir de leur maladie. Mesure de biomarqueurs qui pourraient prédire la réponse aux thérapies alternatives seraient utiles dans le choix thérapeutique individualisé pour chaque patient, et puisque la pression de chimiothérapie exerce sur la sélection d&#39;une tumeur, les cellules tumorales survivantes peuvent posséder des caractéristiques différentes et représentent une sous-population de la tumeur avant traitement; quantifier cette changement pourrait donc être utile. Nous avons appliqué notre approche de la cartographie hétérogénéité d&#39;expression ER et HER2 dans le cancer ovarien spécimens, avant et après la chimiothérapie, en Order pour mesurer les changements quantitatifs dans l&#39;expression, et d&#39;évaluer la relation entre l&#39;expression des biomarqueurs avant et après la thérapie. Les deux ER et HER2 démontrent une hétérogénéité marquée au sein des tumeurs individuelles, et dans certaines tumeurs, variations de l&#39;indice de Simpson après un traitement de l&#39;hétérogénéité relativement élevé à l&#39;hétérogénéité basse, représentée en diminuant scores de l&#39;indice de Simpson (voir figures 2 et 3). Ceci appuie l&#39;idée que la sélection clonale survient en réponse à la chimiothérapie cytotoxique; plus important encore, cela peut être exploité en utilisant une thérapie ciblée contre la population résiduelle, afin de mieux personnaliser le traitement pour les patients atteints de cancer. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig1.jpg" /> Figure 1. Photomicrographies hématoxyline et l&#39;éosine teinté de différents domaines de l&#39;ovaire montrant en même morphologie variable. (A) x40 photomicrographie montre deux zones adjacentes de la tumeur avec différents morphologie. Vues haute puissance (x200) révèlent des cellules avec compensation cytoplasmique et un modèle de croissance solide dans la partie supérieure de la tumeur (B), tandis que la partie inférieure du tissu (C) a plus homogène cytoplasme éosinophile et un modèle de croissance papillaire. Cette tumeur, cependant, être classés comme séreuse sous-type histologique papillaire à des fins de gestion supplémentaires. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig2.jpg" /> Figure 2. Heatmaps hétérogénéité d&#39;expression de protéines dans les ER cytokératine-positives tissus cancer de l&#39;ovaire, avant (partie supérieure) et après (en bas) une thérapie. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig3.jpg" /> Figure 3. Heatmaps hétérogénéité de HER2 expression des protéines dans les tissus cytokératine-positives cancer de l&#39;ovaire, avant (partie supérieure) et après (en bas) une thérapie.

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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoural+cytogenetic+heterogeneity+of+sporadic+colorectal+carcinomas+suggests+several+pathways+to+liver+metastasis.">Intratumoural cytogenetic heterogeneity of sporadic colorectal carcinomas suggests several pathways to liver metastasis.</a> J. Pathol. 221, 308-319 (2010).</li></ol>

JC, MG, CJ et CS sont des employés de HistoRx, Inc

Le procédé décrit ici la quantification permet d&#39;hétérogénéité moléculaire dans la norme fixés au formol et inclus en paraffine coupes histologiques de matériel tumoral. Le procédé permet une valeur à attribuer au degré d&#39;hétérogénéité dans une coupe de tissu, de sorte que cela peut alors être pris en compte comme une variable dans le développement de biomarqueurs et d&#39;analyse. Bien qu&#39;en général il est préférable que les biomarqueurs tissulaires sont homogènes par rapport à l&#39;expression, de sorte que le dosage est moins sensible aux erreurs d&#39;échantillonnage ou de partialité, il pourrait, dans certaines circonstances être utile pour quantifier l&#39;hétérogénéité comme un paramètre. Par exemple, comme le montre l&#39;exemple d&#39;illustration pour ER et HER2, les biomarqueurs communes montrent une hétérogénéité considérable d&#39;expression et il est actuellement inconnu si cela représente un facteur pronostique indépendant ou prédictive par rapport au résultat clinique ou la réponse au traitement, respectivement. De même, comme l&#39;illustre, la thérapie elle-même pourrait modifier dynamiquement lapopulations constituantes des cellules, et donc la mesure de l&#39;enrichissement cible pourrait être utile pour guider les décisions thérapeutiques. Cependant, la technique est limitée par les mêmes facteurs qui limitent traditionnelle analyses histopathologiques ou biomarqueur (comme immunohistochimiques). Le résultat est dépendant du type, la taille et la qualité du tissu en cours d&#39;analyse, et donc une section de tissu unique peut ne pas être représentatifs de toute la tumeur. En effet, l&#39;indice de Simpson peut être indûment biaisées par la taille du tissu (nombre d&#39;images capturées et les scores mesurés AQUA). L&#39;immunogénicité des épitopes mesurée peut être soumis à incontrôlables pré-analytique des facteurs qui modifient leur artifactually expression à travers la section de tissu (comme le temps d&#39;ischémie froide, ou la longueur de la fixation, et les artéfacts de bord). Ceci est particulièrement un problème pour les phospho-épitopes, qui sont notoirement instable 14, 15. Par conséquent, la technique pourrait être mieux adaptéeaux pièces d&#39;exérèse plutôt petites biopsies, et effectué sur plusieurs sections plutôt qu&#39;un seul. Finalement, les techniques d&#39;imagerie 3D peut offrir une occasion de mieux quantifier ce paramètre. La technique présentée peut également être limitée par des facteurs biologiques, tels que la variabilité dans l&#39;expression de l&#39;épitope de masquage cytokératine. Cela pourrait être une préoccupation particulière dans ces cancers, notamment de l&#39;ovaire et le cancer du sein, qui subissent épithélio-mésenchymateuses de transition (EMT) ou sont enrichis pour les non-épithéliales des composants ou des cellules souches 16, comme cela a été démontré récemment de se produire dans la chimiothérapie cancer de l&#39;ovaire traités in vitro, 17 ans, et chez les patients du cancer du sein dans la réponse au traitement 18. Cette limitation peut être surmontée en utilisant des anticorps de masquage alternative (ou un cocktail d&#39;anticorps), tels que la cytokératine ainsi vimentine, qui est régulée positivement dans EMT 16. En outre, depuis les autres composantes du tissu (le microroenvironment), telles que les fibroblastes ou les cellules endothéliales vasculaires sont également de plus en plus ciblé par les thérapies biologiques, la technique peut aussi être élargi pour marquer ces composants, en utilisant des masques spécifiques pour les compartiments de l&#39;intérêt, comme PECAM / CD31 à la coloration pendant les cellules endothéliales vasculaires . Bien que l&#39;adaptation de l&#39;indice de Simpson a été utilisé comme une mesure de l&#39;hétérogénéité dans le protocole actuel en raison de sa simplicité, d&#39;autres mesures d&#39;hétérogénéité pourrait être utilisé, comme de simples mesures de tendance centrale (moyenne, variance, médiane, etc.) En outre, les calculs d&#39;indice de Simpson pourrait être modifié pour mieux s&#39;adapter à une population test particulier. L&#39;utilisation de Z-score permet le pointage des transformations pour être plus applicable pour les marqueurs multiples depuis l&#39;hétérogénéité est basé sur l&#39;écart autour de la moyenne pour un ensemble de données. Cependant, la gamme globale de notation peut être limitée dans ce type de transformation. Certains modèles peuvent être mieux adaptésben tout simplement les scores AQUA réelle pour tous les échantillons d&#39;un ensemble marqueur particulier. Le choix du nombre de bacs et de seuils est aussi une limitation dans la fourchette de valeurs qui peuvent entraîner et peuvent être optimisées pour des modèles expérimentaux alternatifs. Nous avons utilisé ER et HER2 dans l&#39;étude actuelle comme biomarqueurs candidats, car ils sont déjà utilisés en clinique, aider à répondre à des questions pertinentes cliniques à l&#39;égard de l&#39;efficacité des thérapies ciblées, et sont connus pour présenter une hétérogénéité et le changement dans l&#39;enseignement primaire et lointain la maladie 19. Toutefois, le marqueur optimal de l&#39;hétérogénéité reste à déterminer. D&#39;autres possibilités pourraient inclure des marqueurs cytogénétiques de clonalité, tels que ceux utilisés précédemment dans des études FISH interphasique 20. L&#39;approche requiert une validation plus poussée dans les grandes, bien annotée cohortes cliniques ou essais cliniques afin de continuer à établir la pertinence de ce paramètre dans la biologie du cancer.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> ScanScope FL </td><td> Aperio </td><td> ScanScope FL </td><td> Utilisé comme équipés d&#39;un vendeur </td></tr><tr><td> Spectrum </td><td> Aperio </td><td> Spectrum </td><td> Numéros de configuration et de catalogue varient sur la façon dont les institutions locales établi leur base de données et la structure informatique. </td></tr><tr><td> AQUAnalysis, en conjonction avec AQUAjustment </td><td> HistoRx </td><td> V2.3 </td><td> Le forfait permet AQUAjustment AQUAnalysis d&#39;utiliser des images stockées dans Spectrum. </td></tr><tr><td> HER2 </td><td> Dako </td><td> A0485 </td><td> 1 sur 400 de dilution </td></tr><tr><td> de souris anti-pan cytokératine </td><td> Dako </td><td> M3515 </td><td> 1 sur 50 de dilution </td></tr><tr><td> Diluant Anticorps </td><td> Dako </td&gt; <td> S0809 </td><td></td></tr><tr><td> Envision de chèvre-lapin HRP </td><td> Dako </td><td> K4003 </td><td></td></tr><tr><td> Bloc de protéines </td><td> Dako </td><td> X0909 </td><td></td></tr><tr><td> Chèvre anti-souris Alexa555 </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI milieu de montage </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td> Cy5 tyramide </td><td> HistoRx </td><td> AQ-EMR1-00001 </td><td></td></tr><tr><td> Centre Immunocoloration Sequenza </td><td> Thermo Scientific Shandon </td><td> 73300001 </td><td> Utilisé ici pour immunofluorescence paillasse </td></tr></tbody></table>

heterogeneity mapping of protein expression in tumors using quantitative immunofluorescence

L&#39;hétérogénéité morphologique au sein d&#39;une tumeur individuelle est bien reconnu par histopathologistes dans la pratique chirurgicale. Bien que cela prend souvent la forme de zones de différenciation distincts en sous-types histologiques reconnues, ou différents de grade pathologique, souvent il ya des différences plus subtiles dans le phénotype qui défient classification précise (figure 1). En fin de compte, puisque la morphologie est dicté par le phénotype moléculaire sous-jacent, les zones avec des différences visibles sont susceptibles d&#39;être accompagnés par des différences dans l&#39;expression de protéines qui orchestrent la fonction cellulaire et le comportement, et donc, de l&#39;apparence. L&#39;importance de visible et invisible (moléculaire) l&#39;hétérogénéité pour le pronostic est inconnue, mais des données récentes suggèrent que, au moins au niveau génétique, l&#39;hétérogénéité existe dans la tumeur primaire 1,2, et certains de ces clones sous-donnent lieu à des métastases ( et donc mortel) de la maladie. En outre, certaines protéines sontmesurées en tant que biomarqueurs, parce qu&#39;ils sont les cibles de la thérapie (par exemple pour ER et HER2 pour le tamoxifène et le trastuzumab (Herceptin), respectivement). Si ces protéines montrent une expression variable au sein d&#39;une tumeur, puis les réponses thérapeutiques peuvent également être variable. Les régimes largement utilisé score histopathologique pour l&#39;immunohistochimie ou ignorer, ou numériquement homogénéiser la quantification de l&#39;expression des protéines. De même, dans les techniques destructrices, où les échantillons tumoraux sont homogénéisés (telles que le profilage d&#39;expression génique), les informations quantitatives peut être élucidé, mais l&#39;information spatiale est perdue. Approches de cartographie génétique hétérogénéité dans le cancer du pancréas ont compté ni sur la génération d&#39;une suspension cellulaire unique 3 ou le 4 macrodissection. Une récente étude a utilisé des boîtes quantiques dans le but de cartographier l&#39;hétérogénéité morphologique et moléculaire dans les tissus de la prostate 5, fournissant la preuve de principe que la cartographie morphologie et moléculaire est réalisable, mais la chute de lHort de quantifier l&#39;hétérogénéité. Depuis l&#39;immunohistochimie est, au mieux, que semi-quantitative et sujettes à des biais intra-et inter-observateur, plus sensibles et les méthodologies quantitatives sont nécessaires afin de cartographier avec précision et de quantifier l&#39;hétérogénéité des tissus in situ. Nous avons développé et appliqué une méthodologie expérimentale et statistiques afin de mesurer systématiquement l&#39;hétérogénéité d&#39;expression des protéines dans des coupes de tissus ensemble des tumeurs, basée sur l&#39;analyse automatisée quantitatives (AQUA) du système 6. Des sections de tissu sont marquées avec des anticorps spécifiques dirigés contre les cytokératines et des cibles d&#39;intérêt, couplée à un fluorophore anticorps secondaires marqués. Les lames sont imagées par un scanner de fluorescence entière-diapositive. Les images sont subdivisés en centaines de milliers de tuiles, et chaque carreau est ensuite attribué un score AQUA qui est une mesure de la concentration en protéines dans le épithéliales (tumeur) composante du tissu. Heatmaps sont générés afin de représenter l&#39;expression tissulaire des protéines et un score hétérogénéité affecté, en utilisant une mesure statistique de l&#39;hétérogénéité à l&#39;origine utilisée en écologie, basé sur l&#39;indice de Simpson biodiversité 7. À ce jour il n&#39;ya eu aucune tentative de cartographier systématiquement et quantifier cette variabilité en tandem avec l&#39;expression de protéines contenues dans des préparations histologiques. Ici, nous illustrons la première utilisation de la méthode appliquée à l&#39;ER et HER2 l&#39;expression de biomarqueurs dans le cancer de l&#39;ovaire. En utilisant cette méthode ouvre la voie à l&#39;analyse de l&#39;hétérogénéité comme une variable indépendante dans les études d&#39;expression de biomarqueurs dans les études translationnelles, afin d&#39;établir l&#39;importance de l&#39;hétérogénéité dans le pronostic et la prédiction des réponses au traitement.

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Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Nous décrivons ici une méthode pour quantifier l&#39;hétérogénéité moléculaire dans des coupes histologiques de matériel tumoral par immunofluorescence quantitative, analyse d&#39;image, et une mesure statistique de l&#39;hétérogénéité. La méthode est destinée à être utilisée dans le développement de biomarqueurs cliniques et analyses.

Cartographie hétérogénéité d&#39;expression des protéines dans les tumeurs par immunofluorescence quantitative

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

heterogeneity-mapping-protein-expression-tumors-using-quantitative

Research

JoVE Journal

Medicine

18.5K vues.  University of Edinburgh. Nous décrivons ici une méthode pour quantifier l'hétérogénéité moléculaire dans des coupes histologiques de matériel tumoral par immunofluorescence quantitative, analyse d'image, et une mesure statistique de l'hétérogénéité. La méthode est destinée à être utilisée dans le développement de biomarqueurs cliniques et analyses.

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Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Création et propagation des tumeurs de l&#39;homme en rétinoblastome immunitaire chez les souris déficientes

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Recherche

Médecine

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Evaluation de la fixation des nanoparticules dans les tumeurs en temps réel par imagerie intravitale

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

Détection MicroRNA dans les tumeurs prostatiques par quantitative PCR en temps réel (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome compared to matched normal tissue. Based on these analyses it is evident that there are many undiscovered genetic drivers of cancer1. Unfortunately these drivers are hidden within a much larger number of passenger anomalies in the genome that do not directly contribute to tumor formation. Another aspect of the cancer genome is that there is considerable genetic heterogeneity within similar tumor types. Each tumor can harbor different mutations that provide a selective advantage for tumor formation2. Performing an unbiased forward genetic screen in mice provides the tools to generate tumors and analyze their genetic composition, while reducing the background of passenger mutations. The Sleeping Beauty (SB) transposon system is one such method3. The SB system utilizes mobile vectors (transposons) that can be inserted throughout the genome by the transposase enzyme. Mutations are limited to a specific cell type through the use of a conditional transposase allele that is activated by Cre Recombinase. Many mouse lines exist that express Cre Recombinase in specific tissues. By crossing one of these lines to the conditional transposase allele (e.g. Lox-stop-Lox-SB11), the SB system is activated only in cells that express Cre Recombinase. The Cre Recombinase will excise a stop cassette that blocks expression of the transposase allele, thereby activating transposon mutagenesis within the designated cell type. An SB screen is initiated by breeding three strains of transgenic mice so that the experimental mice carry a conditional transposase allele, a concatamer of transposons, and a tissue-specific Cre Recombinase allele. These mice are allowed to age until tumors form and they become moribund. The mice are then necropsied and genomic DNA is isolated from the tumors. Next, the genomic DNA is subjected to linker-mediated-PCR (LM-PCR) that results in amplification of genomic loci containing an SB transposon. LM-PCR performed on a single tumor will result in hundreds of distinct amplicons representing the hundreds of genomic loci containing transposon insertions in a single tumor4. The transposon insertions in all tumors are analyzed and common insertion sites (CISs) are identified using an appropriate statistical method5. Genes within the CIS are highly likely to be oncogenes or tumor suppressor genes, and are considered candidate cancer genes. The advantages of using the SB system to identify candidate cancer genes are: 1) the transposon can easily be located in the genome because its sequence is known, 2) transposition can be directed to almost any cell type and 3) the transposon is capable of introducing both gain- and loss-of-function mutations6. The following protocol describes how to devise and execute a forward genetic screen using the SB transposon system to identify candidate cancer genes (Figure 1).

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

A method of identifying unknown drivers of carcinogenesis using an unbiased approach is described. The method uses the Sleeping Beauty transposon as a random mutagen directed to specific tissues. Genomic mapping of transposon insertions that drive tumor formation identifies novel oncogenes and tumor suppressor genes

Identification des<em&gt; Belle au Bois Dormant</em&gt; Insertions de transposons dans les tumeurs solides en utilisant l&#39;éditeur de liens médiée par PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

Several human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical polarity, ability to differentiate, and anoikis are not maintained in colon cancer derived cell lines. The present study demonstrates a method for culturing primary mouse colon tumor organoids adapted from Sato T et al. 1, which retains important physiologic features of colon tumors. This method consists of mouse colon tumor tissue collection, adjacent normal colon epithelium dissociation, colon tumor cells digestion into single cells, embedding colon tumor cells into matrigel, and selective culture based on the principle that tumor cells maintain growth on limiting nutrient conditions compared to normal epithelial cells.
The primary tumor organoids if isolated from genetically modified mice provide a very useful system to assess tumor autonomous function of specific genes. Moreover, the tumor organoids are amenable to genetic manipulation by virus meditated gene delivery; therefore signaling pathways involved in the colon tumorigenesis could also be extensively investigated by overexpression or knockdown. Primary tumor organoids culture provides a physiologic relevant and feasible means to study the mechanisms and therapeutic modalities for colon tumorigenesis.

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

A simple method to establish primary murine colon tumor organoid is described. This method utilizes the feature that colon tumor cells survive and grow into organoids in media containing limited growth factors, whereas normal colon epithelial do not.

In vitro Organoid Culture des primaires tumeurs du côlon de souris

Several  human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic  integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical ...

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment resistance is thought to be the molecular complexity of the disease 1. Targeted therapy such as the tyrosine kinase inhibitor (TKI)-sunitinib have been utilized, but only 40% of patients will respond, with the overwhelming majority of these patients relapsing within 1 year 2. As such the question of intrinsic and acquired resistance in renal cell cancer patients is highly relevant 3.
In order to study resistance to TKIs, with the ultimate goal of developing effective, personalized treatments, sequential tissue after a specific period of targeted therapy is required, an approach which had proved successful in chronic myeloid leukaemia 4. However the application of such a strategy in renal cell carcinoma is complicated by the high level of both inter- and intratumoral heterogeneity, which is a feature of renal cell carcinoma5,6 as well as other solid tumors 7. Intertumoral heterogeneity due to transcriptomic and genetic differences is well established even in patients with similar presentation, stage and grade of tumor. In addition it is clear that there is great morphological (intratumoral) heterogeneity in RCC, which is likely to represent even greater molecular heterogeneity. Detailed mapping and categorization of RCC tumors by combined morphological analysis and Fuhrman grading allows the selection of representative areas for proteomic analysis.
Protein based analysis of RCC8 is attractive due to its widespread availability in pathology laboratories; however, its application can be problematic due to the limited availability of specific antibodies 9. Due to the dot blot nature of the Reverse Phase Protein Arrays (RPPA), antibody specificity must be pre-validated; as such strict quality control of antibodies used is of paramount importance. Despite this limitation the dot blot format does allow assay miniaturization, allowing for the printing of hundreds of samples onto a single nitrocellulose slide. Printed slides can then be analyzed in a similar fashion to Western analysis with the use of target specific primary antibodies and fluorescently labelled secondary antibodies, allowing for multiplexing. Differential protein expression across all the samples on a slide can then be analyzed simultaneously by comparing the relative level of fluorescence in a more cost-effective and high-throughput manner.

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

RPPA enables the protein expression of hundreds of samples, printed on nitrocellulose slides to be interrogated simultaneously, using fluorescently labelled antibodies. This technique has been applied to study the effect of drug treatment heterogeneity within clear cell renal carcinoma.

L&#39;utilisation des puces à protéines de phase inversée (RPPA) Variation à explorer l&#39;expression des protéines dans les cancers à cellules rénales individuels

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

In Vivo L&#39;imagerie optique de tumeurs cérébrales et l&#39;arthrite Utilisation fluorescent SAPC-DOPS nanovésicules

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Coordinate Mapping of Hyolaryngeal Mechanics in Swallowing

Characterizing hyolaryngeal movement is important to dysphagia research. Prior methods require multiple measurements to obtain one kinematic measurement whereas coordinate mapping of hyolaryngeal mechanics using Modified Barium Swallow (MBS) uses one set of coordinates to calculate multiple variables of interest. For demonstration purposes, ten kinematic measurements were generated from one set of coordinates to determine differences in swallowing two different bolus types. Calculations of hyoid excursion against the vertebrae and mandible are correlated to determine the importance of axes of reference.
To demonstrate coordinate mapping methodology, 40 MBS studies were randomly selected from a dataset of healthy normal subjects with no known swallowing impairment. A 5 ml thin-liquid bolus and a 5 ml pudding swallows were measured from each subject. Nine coordinates, mapping the cranial base, mandible, vertebrae and elements of the hyolaryngeal complex, were recorded at the frames of minimum and maximum hyolaryngeal excursion. Coordinates were mathematically converted into ten variables of hyolaryngeal mechanics.
Inter-rater reliability was evaluated by Intraclass correlation coefficients (ICC). Two-tailed t-tests were used to evaluate differences in kinematics by bolus viscosity. Hyoid excursion measurements against different axes of reference were correlated. Inter-rater reliability among six raters for the 18 coordinates ranged from ICC = 0.90 - 0.97. A slate of ten kinematic measurements was compared by subject between the six raters. One outlier was rejected, and the mean of the remaining reliability scores was ICC = 0.91, 0.84 - 0.96, 95% CI. Two-tailed t-tests with Bonferroni corrections comparing ten kinematic variables (5 ml thin-liquid vs. 5 ml pudding swallows) showed statistically significant differences in hyoid excursion, superior laryngeal movement, and pharyngeal shortening (p &#60; 0.005). Pearson correlations of hyoid excursion measurements from two different axes of reference were: r = 0.62, r2 = 0.38, (thin-liquid); r = 0.52, r2 = 0.27, (pudding).
Obtaining landmark coordinates is a reliable method to generate multiple kinematic variables from video fluoroscopic images useful in dysphagia research.

Coordinate mapping is a method of documenting salient features of hyolaryngeal biomechanics in the pharyngeal phase of swallowing. This methodology uses image analysis software to record coordinates of anatomical landmarks. These coordinates are imported into an excel macro and translated into kinematic variables of interest useful in dysphagia research.

Coordonner la cartographie de Mécanique Hyolaryngeal à avaler

Characterizing hyolaryngeal movement is important to dysphagia research. Prior methods require multiple measurements to obtain one kinematic measurement ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic biomarkers. However, methods for quantitative proteomic characterization of patient-derived tumors and in particular their cellular subpopulations are largely lacking. Here we describe an experimental set-up that allows quantitative analysis of proteomes of cancer cell subpopulations derived from either liquid or solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry followed by bioinformatic data analysis. To enrich specific cellular subsets, liquid tumors are first immunophenotyped by flow cytometry followed by FACS-sorting; for solid tumors, laser-capture microdissection is used to purify specific cellular subpopulations. In a second step, proteins are extracted from the purified cells and subsequently combined with a tumor-specific, SILAC-labeled spike-in standard that enables protein quantification. The resulting protein mixture is subjected to either gel electrophoresis or Filter Aided Sample Preparation (FASP) followed by tryptic digestion. Finally, tryptic peptides are analyzed using a hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer, and the data obtained are processed with bioinformatic software suites including MaxQuant. By means of the workflow presented here, up to 8,000 proteins can be identified and quantified in patient-derived samples, and the resulting protein expression profiles can be compared among patients to identify diagnostic proteomic signatures or potential drug targets.

In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

Spectrométrie de masse quantitative de profilage Protéomes Cancer-cellulaires dérivées de liquide et de tumeurs solides

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA (Locked Nucleic Acid) probe. The probe was recognized by anti-DIG alkaline phosphatase antibodies and later developed using alkaline phosphatase substrate producing fluorescence signals. Here we utilized miRNA in situ hybridization (MISH) technique to analyze expression of miR-489 in tissues from breast cancer patients. This technique can detect the localization of miRNA of interest in individual tissue samples. This technique can be used to compare the expression of desired miRNA in tumor tissue with that in adjacent normal tissue and to identify the specific structures responsible for expressing this miRNA. This technique can be very useful in answering certain clinical questions, such as role of specific miRNA in the development of cancer. Our results indicate that mammary epithelial cells express significantly higher levels of miR-489 than adjacent tumor cells.

Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

Here we present a protocol to detect miRNA expression in breast cancer patient samples using miRNA in situ hybridization.

Analyse clinicopathologique de miRNA expression dans le cancer du sein à l&#39;aide de tissus miRNA<em&gt; In Situ</em&gt; hybridation

In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA ...