Alberto Severini ve Vanessa Goleski tahlil geliştirme ve bu yazının üzerine eleştirel yorumlar yardım için teşekkür ederim. Bu çalışma, Kanada Halk Sağlığı Ajansı ve Endüstriyel Araştırma Destek Programı (Kanada Ulusal Araştırma Konseyi) tarafından finanse edildi. Saskatchewan Üniversitesi Yayın Fonu Ek destek elde edildi.

Bu yöntem Dumonceaux ark bildirilen araştırma kullanılmıştır. J. Clin. Microbiol 47, 4067-4077, DOI: 10.1128/jcm.00112-09 (2009). Genel prosedürü anlatan şematik diyagramı Şekil 1&#39;de sunulmaktadır. 1. Boncuk kaplin (Bkz. Tablo 2) polistiren LUMINEX boncuk oligonükleotid problar kaplin için kullanılacak yöntemler açıklanmıştır. Hacimler yeni yakalama probları bir deneme olarak değerlendirilmesi için biraz adapte; bu miktarlar parantez içinde belirtilmiştir. <ol><li> -20 ° C desikatöre 1-Etil-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimide HCl (EDC) toz çıkarın ve oda sıcaklığına kadar sıcak. </li><li> , Daha sonra yaklaşık 20 saniye karıştırın, 20 saniye boyunca bir su banyosunda sonikatör sonciation mikroküreler tekrar </li><li> (5x10 6 veya 1.25x karşılık gelen bir Eppendorf tüpüne Transfer ul mikroküre 400 (100 ul)10 6 mikroküreler). LUMINEX tüpler yapışmasını ve boncuk kurtarma ile müdahale Kuplajsız boncuk önlemek için düşük protein bağlama mikrosantrifüj tüpleri (örneğin Eppendorf Protein LoBind tüpler, katalog numarası 0030 108,094) kullanılmasını önerir. Bunu biz genellikle standart polipropilen mikrosantrifüj tüpleri, (örn. VWR katalog sayısı 87.003-298) kullanılarak bir sorun bulamadı. </li><li> Pelet az 1 dakika süreyle 14000 xg. Süpernatantı çıkarın ve atın. </li><li> Ethanesulfonic asit (MES), pH 4,5 - (N-morfolino) oda sıcaklığında 0,1 M 2 50 ul mikroküreler (12,5 ul) tekrar </li><li> 10 mg / ml su EDC taze bir çözüm hazırlayın. <ol><li> Sonra 10 mg / ml su ekleyerek, analitik bir ölçekte EDC 5-10 mg ağırlığındaki bu çözümün en az 1 ml hazırlayın. </li></ol></li><li> 5&#39;-amino C12 modifiye yakalama mikroküreler oligonükleotid (Tablo 2) ve vorteks karışım 1 nmol ekleyin. 1 nmol 200 mcM oligo 5 ulnükleotid. </li><li> 5 saniye boyunca karıştırın mikrosferler ve karışık taze EDC çözüm 2,5 ul ekleyin. </li><li> Karanlıkta 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> EDC çözüm atın (adım 1.6) ve (adım 1.6) yukarıdaki gibi suda 10 mg / ml EDC taze bir örnek hazırlamak. </li><li> 5 saniye süreyle mikroküreler ve vorteks taze EDC çözüm başka bir 2.5 ul ekleyin. </li><li> Karanlıkta 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> % 0.02 Tween 20 1 ml ekleyerek boncuk yıkayın. Boncuklar tekrar süspansiyon Vortex (isteğe bağlı olarak 20 saniye sonikasyon). </li><li> 14000 xg 1 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı çıkarın ve atın. </li><li> % 0,1 sodyum dodesil sülfat (SDS) 1 ml ekleyerek boncuk tekrar yıkayın. Boncuklar tekrar süspansiyon Vortex (isteğe bağlı olarak 20 saniye sonikasyon). </li><li> 14000 xg 1 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı çıkarın ve atın. </li><li> 100 ul (25 ul) Tris-EDTA (TE) tampon [10 m boncuk süspanse edinM Tris-Cl, pH 8.0, 1 mM EDTA, pH 8,0]. </li><li> Stok konsantrasyonunu belirlemek için bir haemocytometer veya Coulter sayacı boncuk numaralandırmak. </li><li> Her boncuk 100 boncuk / ul TE tampon bir son konsantrasyona seyreltilmesi Microsphere Master Mix hazırlayın. Havuzu testinin istenen karmaşık (örneğin 10-karmaşık bir tahlil için, her boncuk 100/μl bir nihai konsantrasyonu 10 farklı birleştiğinde boncuk karışımı) karşılık gelen boncuklar birleştiğinde. </li><li> 4 Microsphere Master Mix Mağaza ° C karanlıkta. Eğer bu koşullar altında tutulur karışımı ay boyunca saklanabilir. </li></ol> 2. Chaperonin 60 evrensel hedef tek iplikçikler Amplikon üretim ve üretim (cpn60 UT). <ol><li> Her bir örnek için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ürün üretin. Phosphorothioate ve biyotin modifiye 5 &#39;astar seti (Tablo 1) ekleyin. Tablo 3 karıştırmak için hacimleri ve konsantrasyonları için Bkz. </li><li> PCR işlemi tamamlandıktan hemen sonra, 2 T7 ex ul (20 adet)her PCR tüpü (PCR tampon T7 reaksiyon için yeterli olacaktır) onuclease. Reaksiyon oda sıcaklığında inkübe (~ 22-25 ° C) 40 dakika. </li><li> Bu inkübasyon sonunda, 0,5 M etilen 12.5 ul eklemek tetraasetik asit (EDTA) pH 8.0 ve karıştırın diamine. Bu tek iplikli PCR ürün ~ 64.5μl bir toplam verir. </li></ol> 3. Oligonükleotid çiftli polistiren boncuklar tek iplikli PCR ürün Hibridizasyon. <ol><li> 60 Prewarm alet ° C, analiz sırasında hibridizasyon ısısını korumak için. Platformu ısıtıcı cihazın yazılımını kullanarak açın ve melezleşmiş boncuk karışımı içeren PCR tarzı plaka uygun pirinç ısıtma bloğu kullandığınızdan emin olun. </li><li> Bir pipet yardımıyla yeniden süspanse Microsphere Master Mix (adım 1.20), Eppendorf tüpe uygun bir miktar vazgeçmek kap tüp ve su banyosunda sonikatör 2 dakika boyunca sonikasyon. Alternatif olarak, boncuk resuspe mutlak tutarlılık sağlamak içinnsion, Microsphere ana karışımı, sonra bir polipropilen Eppendorf tüp içine istenilen miktarda dağıtılması, yukarıdaki gibi sonication vorteks ve, sonra pipetleme yeniden süspanse edilebilir. </li><li> 17 ul tek iplikli PCR ürünü (adım 2.2) düşük profilli 96-iyi termo PCR plate (Tablo 2) uygun kuyu içine koyun. Her bir kuyunun 33 ul yeniden süspanse sonciated boncuk karışımı ekleyin. Silikon kapak (Tablo 2) ile kaplayın ve hafifçe dokunun. </li><li> Bir program ile PCR plaka koyun: 5 dk, 10 dk, 60 ° C - 95 ° C - 60 ° C tutun, 60 ° C de 5 dakika, son. Programı başlatın. </li><li> Streptavidin fikoeritrin (SA-PE) çözümü taze olun; (ekstra birkaç kuyu olun) ortalama 25 ul gerekecektir. % 0.1 Sarkosyl; 50 mM Tris-HCl, pH 8.0 stok SA-PE (1 mg / ml), 1x tetramethylammonium klorür (TMAC) tampon (3 M TMAC 01:50 20 mg / ml seyreltilmesiyle SA-PE çözüm olun 4 mM EDTA, pH 8.0). </li><li> Termalcycler 60 ° C tutun adım alır.kapağı açın, silikon kapak ve her iyi (PCR plaka dikkate almayınız) SA-PE doğrudan çözüm eklemek kaldırmak. Silikon kapağını yerine takın PCR kapağını kapatın ve program kaldığı yerden devam. </li><li> Program tamamlandığında, plaka ve hızlı bir şekilde okumak için Bioplex makineye aktarmak. Plaka 10 dakika içinde okumak gerekir. 60 ° C&#39;de okuyun; Bioplex bu sıcaklık prewarmed olduğundan emin olun. Prob yükseklik olarak kullanılan araç için kullanım kılavuzuna açıklanan kullanılan plaka, uyum sağlamak için ayarlanabilir edildiğine emin olmak. </li><li> Bioplex kapı ayarlarını doğru boncuk ve sinyal tespiti için, kullanılan mikroküreler türüne göre ayarlanmış olmalıdır. Manyetik mikroküreler 5,000-25,000 bir ayar gerektiren BioRad polistiren boncuklar 4,335-10,000 bir kapı ayarı gerektirir. Plaka muhabiri kazanç değerini artırır Yüksek PMT ayarını kullanarak çalışan seçeneği de vardır. Bu i canArtış düşük sinyallerin yoğunluğunu ancak önemli arka plan sinyali artacaktır uygun bir negatif kontrol içerir. </li></ol> 4. Temsilcisi sonuçları: Geliştirilmesi ve uygulanması bu testte amaçlarından biri, mümkün olduğunca basit ve düzenli olarak bunu yapmak için. Bu nedenle makul bir zaman çerçevesi içinde tamamlanabilir bir test geliştirmek için T7 eksonükleaz tedavi süresi ve hibridizasyon süresi de dahil olmak üzere, kritik amplifikasyon sonrası adımları optimize edilmiş. Şekil 2A gösterildiği gibi, Amplikon T7 tedavisi çoğu probları T7 tedavi ile kısa ya da çok az ya da hiç sinyal olduğu gibi, sinyal üretimi için esastır. Sinyal sinyal artışı yavaşladı, hangi zamanda, yaklaşık 40 dakika kadar doğrusal bir artış göstermiştir. Primerlerin phosphorothioate değişiklik küçük kalkan önlenmesinde son derece etkili olduğunu gösteren sinyal hiçbir bozulma, T7 tedavi süresi 2 saat bile gözlendit iplikçik bozulması 15 nitelendirdi. Biz genel protokol süresini en aza indirmek için T7 tedavi süresi için 40 dakika seçti, ama T7 tedavi çok daha uzun süre devam edebilir Şekil 2A açıktır. Ayrıca sinyal nesil (Şekil 2B) hibridizasyon zaman etkisi belirlenir ve 10 dakika maksimum sinyal için yeterli olduğunu, melezleşme 4 saat sonra bile sinyal daha fazla artış gözlendi. Bu nedenle, genel test süresini en aza indirmek için 10 dakika hibridizasyon adım tekrar seçildi. Göz önünde bulundurarak, InstaGene (Bio-Rad) gibi hızlı DNA ekstraksiyon teknikleri ile bu sonuçlar ile, DNA ekstraksiyonu, PCR, ve LUMINEX analizleri de dahil olmak üzere genel bir tahlil, 4-5 saat içinde tamamlanabilir. Dikkat edilmesi gereken bir nokta, bir LUMINEX veya Bioplex çalışması sırasında polistiren boncuklar agregasyonunun düzeyi testin verimliliği üzerinde büyük bir etkiye sahip olabilir. Bioplex yazılımı oluşur boncuk kümeleme seviyesi gösterecektirBirden fazla boncuk lazer yolu ve agrega hibridizasyon sinyali dışlama sonuçları tespit edilmiştir. Görünür boncuk agregasyon tek bir boncuk için uygun boyutta olmayan herhangi bir partikül madde neden olabilir ve hatta hava kabarcıkları neden olabilir. Bu olaylar herhangi bir boncuk agrega, hava kabarcığı veya partikül sinyal atılır. Çoğu durumda, biz o boncuk agregasyonu az (Şekil 3A) ve her boncuk için 100 sayma olayların hedeflenen düzeyin kolayca ulaşılabilir. Bununla birlikte, bazen boncuk, orta (Şekil 3B) ya da şiddetli bir agregasyon (Şekil 3C) düzeyi göstermektedir. Bu durumlarda, verilerin çoğu atılır, cihaz 100 boncuk tipine göre olaylar ve sonuçları ulaşmada sorun tartışmalı olabilir olabilir. Sonication adım (adım 3.2) boncuk agregasyonu en aza indirmek içindir. Buna ek olarak boncuk, seyreltilmiş Microsphere ana karışımlar (adım 1.20) olarak saklamak yardımcı olabilir. Biz hybri, bu hariç TMAC fark vardization tampon yerine SA-PE seyreltici (adım 3.5) ekleyerek boncuk agregasyonu en aza indirmek için yardımcı olur. Ayrıca, bu test değil ise, LUMINEX veya BioRad yeni manyetik boncuk agrega için bir eğilim daha az göstermek için düşünülmektedir. G. hedefleyen bir 5-karmaşık LUMINEX dizi uygulama sonuçları vaginalis, A. vaginae, L. iners, L. crispatus, ve L. ilgili Gram boyanan çubukla vajinal smear ile birlikte gasseri Şekil 4&#39;te gösterilmiştir. Bu örnekler, tek bir bireyin birden fazla zaman noktalarında alınmıştır. 0 zamanında, bireysel Gram boyama dayalı BV tanısı (Şekil 4A) ve dizi, G. temsil edilen organizmaların bu aynı örnek LUMINEX sonuçları (Şekil 4B) gösterisi vaginalis, en yaygın iken A. vaginae ve L. iners da pozitifti. Dokuz gün sonra, bireysel hala BV pozitif ve sG. için ignal vaginalis önemli ölçüde artmıştır ise A. vaginae ve L. iners hala pozitifti. Gram pozitif basil smear saptanabilir oldu önemlisi, G. için sinyal ise, bu süreden sonra bireysel (Şekil 4A), normal bir Mikrobiyota geçiş başladı vaginalis azaldı ve L. için sinyal iners (Şekil 4B) artmıştır. Gram G. algılamak için başarısız leke rağmen, bu yöntem (BV pozitif olarak kabul edildi G. vaginalis ve / veya A. vaginae için olumlu örnekleri) 13 BV orijinal tanımı olarak, bu birey, tüm zaman noktalarında olumlu BV Son iki zaman noktalarında vaginalis. Burada anlatılan LUMINEX yöntemi ile, eğilimleri kolayca sıralama tabanlı yöntemlerle karşılaştırıldığında olabilir ve organizma kimliğini ve bolluk hakkında ek bilgi sağlarken LUMINEX testinin sonuçları genellikle Gram boyama 13 doğrulamak. <img src=Alt &quot;/ files/ftp_upload/3344/3344fig1.jpg&quot; = &quot;Şekil 1&quot; /&gt; Şekil 1 LUMINEX karmaşık bir klinik ya da çevresel örnek Mikrobiyota profili belirlemek için protokol şematik. Protokol ilgi örnekten elde edilmiştir DNA ile başlar. (1) kullanarak DNA PCR ürünü oluşturun iplikçik özel biotinlenmiş, değiştirilmemiş cpn60 UT PCR primerleri (Tablo 1) ile birleştiğinde phosphorothioate modifiye cpn60 UT PCR primerleri; (2) Bu Mikrobiyota temsil eden bir PCR ürünü havuzu oluşturur biotin bir iplikçik üzerinde değişiklik phosphorothioate; (3) phosphorothioate modifiye iplikçik düşürebilir ve bu nedenle tek iplikli DNA biotin 5 &#39;sonunda güncellenmiştir oluşturur T7 eksonükleaz, çift zincirli PCR ürününün Digest; (4) Çift türe özgü cpn60 UT probları polistiren boncuklar her boncuk eşsiz bir spektral adresi (boncuk renk ile gösterilen) bu iLUMINEX veya Bio-Plex alet tarafından ayırt edilebilir (5) faiz örnek türe özgü oligonükleotid çiftli boncuk paketi için oluşturulan tek iplikli PCR ürünü melezleşme; (6) bağlanır streptavidin fikoeritrin konjuge ekle biotinlenmiş tek iplikli PCR ürünü ve melezleşme bir göstergesi olarak görür; (7) bir LUMINEX ya da Bio-Plex alet kullanarak spektral adresi (boncuk kimlik) ve hibridizasyon sinyal yoğunluğu belirler. En az 100 boncuk boncuk her kimlik için sayılır ve fikoeritrin sinyal ortalama floresan yoğunluğu (MFI) çıktı olarak rapor edilir. 100 farklı boncuk türleri için aynı anda değerlendirilebilir ancak üç boncuk türleri ayrımcılık gösteren bir tahlil gösterilmiştir. (8) PCR MFI aynı örnekten üretilen çoğaltır zaman (tek-kuyruklu öğrenci Kullanıcı t-testi, p &lt;0.05) bir verilen boncuk negatif kontrolü göre önemli ölçüde daha fazla olduğunu, örnek bu organizma için pozitif olması için kabul edilir.<html><img src="/files/ftp_upload/3344/3344fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 LUMINEX tahlil parametreleri optimizasyonu. Beş farklı prob Peptostreptococcus anaerobius hedefleyen P. de dahil olmak üzere klonlanmış cpn60 UT vajina ile ilişkili olduğu bilinen 20 bakteri içeren plazmid oluşan karışık bir şablondan oluşturulan amplikonlarının kullanıldı anaerobius. (A). T7 eksonükleaz tedavi süresi Etkisi. Yukarıda açıklanan protokol izledi ama T7 eksonükleaz ile tedavi süre önce hibridizasyon ve medyan floresan yoğunluğu (MFI) tüm problar için belirlenen değişmekteydi. (B). Hibridizasyon zaman Etkisi. Yukarıda açıklanan protokol çeşitli hibridizasyon kez izledi. A ve tüm problar için medyan floresan yoğunluğu (MFI) olarak tespit edilmiştir aynı şablondan oluşturulan bir Amplikon probları aynı setleri kullanıldı. &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3344/3344fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 Bioplex yazılım kullanarak boncuk agregasyonunun belirlenmesi. Üç örnekleri boncuk agregasyon seviyesi (A) kabul edilebilir (% 5) olduğu Bioplex çalışır verilmiştir; (B) borderline (% 50) ve (C) kabul edilemez (% 80). <img src="/files/ftp_upload/3344/3344fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4 BV tanısı, aynı kişiden alınan sıralı numuneler 5-karmaşık LUMINEX dizi Uygulama . (A). BV her numune değerlendirmek için kullanılan geleneksel teşhis gösteren Gram-lekeli slaytlar. (B). Uygulama 5-karmaşık LUMINEX dizi hazırlanmış ve bu protokol (A) gösterilen aynı dört örnek açıklandığı gibi yürütülür. MFI sinyal Bakteriyel hedefler bizim tanımı (tek kuyruklu Student t-testi, p &lt;0.05) bir yıldız (*) ile gösterilir anlamlı pozitif oldu.

<ol>
	<li>Hale, L. P., Swidsinski, A., Mendling, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+associated+with+bacterial+vaginosis.">Bacteria associated with bacterial vaginosis.</a> N. Engl. J. Med. 354, 202-203 (2006).</li><li>Hay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+in+the+littoral+zone:+lactobacilli+losing+the+plot.">Life in the littoral zone: lactobacilli losing the plot.</a> Sex. Transm. Infect. 81, 100-102 (2005).</li><li>Morris, M., Nicoll, A., Simms, I., Wilson, J., Catchpole, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+vaginosis:+a+public+health+review.">Bacterial vaginosis: a public health review.</a> Brit. J. Obstet. Gynecol. 108, 439-450 (2001).</li><li>Myer, L., Kuhn, L., Stein, Z. A., Wright, T. C., Denny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravaginal+practices,+bacterial+vaginosis,+and+women's+susceptibility+to+HIV+infection:+epidemiological+evidence+and+biological+mechanisms.">Intravaginal practices, bacterial vaginosis, and women's susceptibility to HIV infection: epidemiological evidence and biological mechanisms.</a> Lancet. Infect. Dis. 5, 786-794 (2005).</li><li>Wilson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+recurrent+bacterial+vaginosis.">Managing recurrent bacterial vaginosis.</a> Sex. Transm. Infect. 80, 8-11 (2004).</li><li>Nugent, R. P., Krohn, M. A., Hillier, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+diagnosing+bacterial+vaginosis+is+improved+by+a+standardized+method+of+gram+stain+interpretation.">Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardized method of gram stain interpretation.</a> J. Clin. Microbiol. 29, 297-301 (1991).</li><li>Ison, C. A., Hay, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+simplified+grading+of+Gram+stained+vaginal+smears+for+use+in+genitourinary+medicine+clinics.">Validation of a simplified grading of Gram stained vaginal smears for use in genitourinary medicine clinics.</a> Sex. Transm. Infect. 78, 413-415 (2002).</li><li>Money, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laboratory+diagnosis+of+bacterial+vaginosis.">The laboratory diagnosis of bacterial vaginosis.</a> Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. 16, 77-79 (2005).</li><li>Schellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+of+the+chaperonin-60+universal+target+as+a+tool+for+determining+microbial+community+composition.">Pyrosequencing of the chaperonin-60 universal target as a tool for determining microbial community composition.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 2889-2898 (2009).</li><li>Spear, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+diversity+of+the+vaginal+microbiota+in+HIV-infected+and+HIV-uninfected+women+with+or+without+bacterial+vaginosis.">Comparison of the diversity of the vaginal microbiota in HIV-infected and HIV-uninfected women with or without bacterial vaginosis.</a> J. Infect. Dis. 198, 1131-1140 (2008).</li><li>Brotman, R. M., Ravel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ready+or+not:+the+molecular+diagnosis+of+bacterial+vaginosis.">Ready or not: the molecular diagnosis of bacterial vaginosis.</a> Clin. Infect. Dis. 47, 44-46 (2008).</li><li>Fredricks, D. N., Fiedler, T. L., Marrazzo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+bacteria+associated+with+bacterial+vaginosis.">Molecular identification of bacteria associated with bacterial vaginosis.</a> N. Engl. J. Med. 353, 1899-1911 (2005).</li><li>Dumonceaux, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+bacteria+associated+with+normal+microbiota+and+with+bacterial+vaginosis+in+vaginal+swabs+by+use+of+oligonucleotide-coupled+fluorescent+microspheres.">Multiplex detection of bacteria associated with normal microbiota and with bacterial vaginosis in vaginal swabs by use of oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 4067-4077 (2009).</li><li>Molenkamp, R., van der Ham, A., Schinkel, J., Beld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+five+different+DNA+targets+by+real-time+Taqman+PCR+using+the+Roche+LightCycler480:+Application+in+viral+molecular+diagnostics.">Simultaneous detection of five different DNA targets by real-time Taqman PCR using the Roche LightCycler480: Application in viral molecular diagnostics.</a> J. Virol. Meth. 141, 205-211 (2007).</li><li>Nikiforov, T. T., Rendle, R. B., Kotewicz, M. L., Rogers, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+phosphorothioate+primers+and+exonuclease+hydrolysis+for+the+preparation+of+single-stranded+PCR+products+and+their+detection+by+solid-phase+hybridization.">The use of phosphorothioate primers and exonuclease hydrolysis for the preparation of single-stranded PCR products and their detection by solid-phase hybridization.</a> PCR. Methods. Appl. 3, 285-291 (1994).</li><li>Hill, J. E., Penny, S. L., Crowell, K. G., Goh, S. H., Hemmingsen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cpnDB:+A+Chaperonin+Sequence+Database.">cpnDB: A Chaperonin Sequence Database.</a> Genome. Res. 14, 1669-1675 (2004).</li><li>Bradshaw, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+of+Atopobium+vaginae+and+Gardnerella+vaginalis+with+bacterial+vaginosis+and+recurrence+after+oral+metronidazole+therapy.">The association of Atopobium vaginae and Gardnerella vaginalis with bacterial vaginosis and recurrence after oral metronidazole therapy.</a> J. Infect. Dis. 194, 828-836 (2006).</li><li>Dumonceaux, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+specific+bacterial+populations+in+complex+intestinal+communities+using+quantitative+PCR+based+on+the+chaperonin-60+target.">Enumeration of specific bacterial populations in complex intestinal communities using quantitative PCR based on the chaperonin-60 target.</a> J. Microbiol. Meth. 64, 46-62 (2006).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Özgüllük sinyal nesil kritik öneme sahiptir; sinyal gerçekten, o organizmanın elde Amplikon tespiti yansıtan gözlenen emin olmak gerekir. Yazılım PrimerPlex (Premier Biosoft) gibi verimli bir melezleşme olan problar tasarım için yardımcı olabilir, ancak kendilerinin veya hedef olmayan türler çapraz melezleşme değil olabilir. Bu protokol evrensel PCR primerleri açıklandığı gibi kullanıldığı zaman, üretilen Amplikon örnek mevcut organizmaların tümünü temsil ettiğini akılda tutmak öneml...

<table border="1"><tbody><tr><td> Oligonükleotid adı </td><td> Şirket </td><td> Sıra 1 </td></tr><tr><td> H279BP </td><td rowspan="3"> Invitrogen, IDT, ya da diğer </td><td> Biotin-OEFO GAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC </td></tr><tr><td> H280 </td><td> YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT </td></tr><tr><td> H1612BP </td><td> Biotin-OEFO GAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC </td></tr><tr><td> H1613 </td><td></td><td> CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT </td></tr><tr><td colspan="3"> 1O, phosphorothioate-C, E, phosphorothioate-G, F, phosphorothioate-A, I, inozin Y, C veya T, R, A ya da G, K, T, G, S, C veya G. </td></tr></tbody></table> Evrensel cpn60 PCR için modifiye oligonükleotidler Tablo 1: Diziler. <table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı</td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> 1-Etil-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimide HCl (EDC) </td><td> Delmek </td><td> 22980 </td><td></td></tr><tr><td> Floresan polistiren boncuklar: MicroPlex Mikroküreler (LUMINEX), ya da Bio-Plex COOH Boncuk (Bio-Rad) </td><td> LUMINEX veya Bio-Rad </td><td> Bio-Rad: 171-506xxx xxx boncuk tanımlayıcı tekabül </td><td> Manyetik boncuk oligonükleotid bağlamak için kullanılabilir hale geliyor ve bazı avantajlar sunabilir. Bu yazarlar tarafından denenmiş değil. </td></tr><tr><td> Yakalama oligonükleotidler (5 &#39;amino C12 modifiye) </td><td> Invitrogen, IDT, ya da diğer </td><td> çeşitli </td><td> Desalted saflık derecesi kabul edilir. Vajinal bezlerden karakterize etmek için kullanılan yakalama probları dizileri, bu protokolü 13 dayandığı el yazması sağlanır . </td></tr><tr><td> T7eksonükleaz </td><td> New England Biolabs </td><td> M0263S </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-R-fikoeritrin (SA-PE) </td><td> Invitrogen </td><td> S-866 </td><td> Yüksek saflıkta SA-PE elde etmek için dikkatli olun; bu katalog numarası önerilir. </td></tr><tr><td> Termo 96 PCR plakaları </td><td> Balıkçı </td><td> CS006509 </td><td> 96-iyi PCR ve Bioplex makine sığacak </td></tr><tr><td> Termo sızdırmazlık mat </td><td> Balıkçı </td><td> CS006555 </td><td> Yeniden kullanılabilir; sabunlu su ile yıkayın, iyice durulayın ve kuru </td></tr><tr><td> 5M TMAC </td><td> Sigma </td><td> T3411 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Plex veya LUMINEX aracı </td><td> Bio-Rad veya LUMINEX </td><td> Bio-Rad: 171-000201 </td><td></td></tr><tr><td> Prob tasarım PrimerPlex yazılımı </td><td> Premier Biosoft </td><td> www.premierbiosoft.com </td><td> LUMINEX prob de için önerilendiğer yazılım platformlarında kullanılan olsa da, işaret </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Belirli reaktifler ve ekipmanları. <table border="1"><tbody><tr><td> bileşen </td><td> ul / tahlil </td><td> μl/100 deneyleri </td><td> nihai konsantrasyonu </td></tr><tr><td> 10x PCR buffer (Invitrogen) </td><td> 5 </td><td> 500 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 50 mM MgCl 2 (Invitrogen) </td><td> 2,5 </td><td> 250 </td><td> 2.5 mM </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP </td><td> 1 </td><td> 100 </td><td> Her biri 0.2 mM </td></tr><tr><td> H279BP, 25 mcM </td><td> 0,25 </td><td> 25 </td><td> 375 nM </td></tr><tr><td> H1612BP, 25 mcM </td><td> 0,75 </td><td> 75 </td><td> 125 nM </td></tr><tr><td> H280, 25 mcM </td><td> 0,25 </td><td> 25 </td><td> 375 nM </td></tr><tr><td> H1613,25 mcM </td><td> 0,75 </td><td> 75 </td><td> 125 nM </td></tr><tr><td> Su </td><td> 34 </td><td> 3400 </td><td> --- </td></tr><tr><td> Toplamları </td><td> 44,5 </td><td> 4450 </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 3: Önerilen modifiye cpn60 UT primerleri ile PCR (Tablo 1) karışımları. Testi DNA ve Taq DNA polimeraz (Invitrogen) 0.5 ul (2.5U) 5 ul için ayarlanır. Normalde büyük miktarlarda hazırlanır (örneğin 100 deneyleri için yeterli) ve -20 ° C&#39;de saklanır

multiplex detection of bacteria in complex clinical and environmental samples using oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres

Bakteriyel vajinozis (BV), &quot;normal&quot; Mikrobiyota Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae de dahil olmak üzere çok sayıda bakteri türlerinin hakim olduğu bir Mikrobiyota Lactobacillus-egemen, ve diğerleri 1-3 bir değişiklik ile karakterize tekrarlayan polimikrobiyal bir sendromdur. Bu durum, HIV satın alma 4 de dahil olmak üzere, olumsuz sağlık sonuçları, bir dizi ile ilişkili olup, klinik olarak 5 yönetmek için zor olabilir. Ayrıca, BV tanısı, çeşitli sayısal kriterleri 6,7 puan vajinal sürüntü smear Gram boyama güvendi . Bu tanı, basit, ucuz ve kaynak sınırlı ayarları iyi uygun olmasına rağmen, sübjektif ve vajinal Mikrobiyota 8 kompozisyon ayrıntılı bir profilini vermez sorunları muzdarip olabilir. Yeni derin sıralama çabaları ile zengin, çeşitli vajinal Mikrobiyota ortaya koymuşturbir dizi BV 11,12 moleküler tanı için potansiyel hedefler belirlenmesi sonuçlandı Normal 9,10 olarak bireylere kıyasla BV tanısı kişilerden alınan örnekler arasında belirgin farklılıklar. Bu çalışmalar yararlı bilgiler bir zenginlik var, ama derin sıralama henüz klinik bir ortamda bir tanı yöntemi olarak pratik değildir. Biz son zamanlarda hızla LUMINEX platformu 13 algılama oligonükleotid çiftli florasan boncuklar kullanılarak, çok katlı bir biçimi vajinal Mikrobiyota profil için bir yöntem tanımlanmıştır. Bu yöntem, mevcut Gram boyama tabanlı yöntemler gibi basit ve hızlı ama prob tasarım çalışmaları sıralama kaynaklanan moleküler bilgi sömürmek için ek bir avantaj katıyor. Bu yöntem, bu nedenle, BV, spesifite ve duyarlılığı yüksek comp ile teşhis etmek için kullanılabilecek bir vajinal sürüntü bulunan önemli mikroorganizmalar profil bir yol sağlaryarı-kantitatif ve hızlı bir şekilde türlerin varlığı ve bolluk hakkında ek bilgi sağlarken Gram boyama ared. Bu çoklama yöntemi, şu anda tek bir örnek 14 5 veya 6 farklı deneyleri ile sınırlı belirli organizmalar için geçerli kantitatif PCR testleri aralığının dışında genişletilebilir. Önemlisi, bu yöntem vajinal bezlerden bakteri tespit sınırlı değil ve hızla ilgi hemen hemen her mikrobik bir topluluk profil kolayca adapte edilebilir. Örneğin, son zamanlarda, atıksu arıtma tesislerinde kullanım için tanı araçları geliştirme metodolojisini uygulamak için başladı.

Watch this Scientific Journal Video about Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres at JoVE.com

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Oligonükleotid çiftli florasan boncuklar kullanarak bir örnek içinde mikroorganizmaların tespiti için çoklama yöntemi açıklar. Bir örnek içindeki tüm organizmalar Amplikon bir panel prob-çiftli boncuk melezleşmiştir. LUMINEX veya Bio-Plex enstrüman, boncuk, boncuk türü ve hibridizasyon sinyali için her bir sorgu için kullanılır.

Oligonükleotid çiftli Floresan Mikroküreler kullanarak Kompleksi Klinik ve Çevre Örneklerinde Bakterilerin Multiplex Algılama

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

multiplex-detection-bacteria-complex-clinical-environmental-samples

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.1K Görüntüleme.  Agriculture and Agri-Food Canada. Oligonükleotid çiftli florasan boncuklar kullanarak bir örnek içinde mikroorganizmaların tespiti için çoklama yöntemi açıklar. Bir örnek içindeki tüm organizmalar Amplikon bir panel prob-çiftli boncuk melezleşmiştir. LUMINEX veya Bio-Plex enstrüman, boncuk, boncuk türü ve hibridizasyon sinyali için her bir sorgu için kullanılır.

Video: Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Viral Patojenler Klinik Örnekler Ekranına bir Pan-Viral Mikroarray Testi (Virochip)

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to the best of these authors' knowledge, no method has been developed to allow for the in situ visualization of the 
bacteria in histological sections.
While bacterial localization has been determined in vivo in previous studies using plate counts 3, radiometric labeled 4, 
or bioluminescent bacteria 5, most of these studies have only been performed at the gross organ level, with one exception 6. This limitation 
is of particular concern because E. ictaluri has a complex infection cycle 1,7, and it has a variety of virulence factors 8,9. 
The complex interaction of E. ictaluri with its host is similar in many respects to Salmonella typhi 10, which is in the same taxonomic family.
Here we describe a technique allowing for the detection of bacteria using indirect immuno-histochemistry using the monoclonal Ed9 antibody described by Ainsworth et al.11.
Briefly, a blocking serum is applied to paraffin embedded histological sections to prevent non-specific biding. Then, the 
sections are incubated with the primary antibody: E. ictaluri specific monoclonal antibody Ed9. Excess antibodies are rinsed away and the FitC 
labeled secondary antibodies are added. After rinsing, the sections are mounted with a fluorescent specific mounting medium. 
This allowed for the detection of E. ictaluri in situ in histological sections of channel catfish tissues.

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish I. punctatus samples

Here we describe a procedure allowing the labeling of Edwardsiella ictaluri in situ in histological sections from channel catfish Ictalurus punctatus using indirect immunohistochemistry with monoclonal antibodies Ed9 as a primary, and fluorescent FitC labeled antibodies as a secondary. This allowed for the detection of the bacterium using fluorescent microscopy.

Floresan immuno-Kimya tespiti için kullanılması Edwardsiella ictaluri Kanal kedibalığı ( I. punctatus) Örnekleri

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to ...

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as pathology of disease. While the properties of the variable domains of antibodies have long been considered critical to in vivo function, the ability of antibodies to recruit innate immune cells via their Fc domains has become increasingly appreciated as a major factor in their efficacy, both in the setting of recombinant monoclonal antibody therapy, as well as in the course of natural infection or vaccination1-3.
Importantly, despite its nomenclature as a constant domain, the antibody Fc domain does not have constant function, and is strongly modulated by IgG subclass (IgG1-4) and glycosylation at Asparagine 2974-6. Thus, this method to study functional differences of antigen-specific antibodies in clinical samples will facilitate correlation of the phagocytic potential of antibodies to disease state, susceptibility to infection, progression, or clinical outcome.
Furthermore, this effector function is particularly important in light of the documented ability of antibodies to enhance infection by providing pathogens access into host cells via Fc receptor-driven phagocytosis7. Additionally, there is some evidence that phagocytic uptake of immune complexes can impact the Th1/Th2 polarization of the immune response8.
Here, we describe an assay designed to detect differences in antibody-induced phagocytosis, which may be caused by differential IgG subclass, glycan structure at Asn297, as well as the ability to form immune complexes of antigen-specific antibodies in a high-throughput fashion. To this end, 1 &mu;m fluorescent beads are coated with antigen, then incubated with clinical antibody samples, generating fluorescent antigen specific immune complexes. These antibody-opsonized beads are then incubated with a monocytic cell line expressing multiple Fc&gamma;Rs, including both inhibitory and activating. Assay output can include phagocytic activity, cytokine secretion, and patterns of Fc&gamma;Rs usage, and are determined in a standardized manner, making this a highly useful system for parsing differences in this antibody-dependent effector function in both infection and vaccine-mediated protection9.

We present a high-throughput flow cytometric assay to determine the phagocytic activity of antigen-specific antibodies from clinical samples, utilizing fluorescent antigen-coated beads and a monocytic cell line expressing multiple Fc receptors&#x2014;providing receptor usage and phagocytic activity determinations in a standardized and reproducible fashion for any antigen of interest.

Klinik Antikor Örnekleri fagositik Aktivitesi Belirlenmesi

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses each and every year. Prevention of such outbreaks and minimization of the impact of an ongoing epidemic place an ever-increasing demand for analytical methods that can accurately identify culprit pathogens at the earliest stage. Although there is a large array of effective methods for pathogen detection, none of them can satisfy all the following five premier requirements embodied for an ideal detection method: high specificity (detecting only the bacterium of interest), high sensitivity (capable of detecting as low as a single live bacterial cell), short time-to-results (minutes to hours), great operational simplicity (no need for lengthy sampling procedures and the use of specialized equipment), and cost effectiveness. For example, classical microbiological methods are highly specific but require a long time (days to weeks) to acquire a definitive result.1 PCR- and antibody-based techniques offer shorter waiting times (hours to days), but they require the use of expensive reagents and/or sophisticated equipment.2-4 Consequently, there is still a great demand for scientific research towards developing innovative bacterial detection methods that offer improved characteristics in one or more of the aforementioned requirements. Our laboratory is interested in examining the potential of DNAzymes as a novel class of molecular probes for biosensing applications including bacterial detection.5
DNAzymes (also known as deoxyribozymes or DNA enzymes) are man-made single-stranded DNA molecules with the capability of catalyzing chemical reactions.6-8 These molecules can be isolated from a vast random-sequence DNA pool (which contains as many as 1016 individual sequences) by a process known as "in vitro selection" or "SELEX" (systematic evolution of ligands by exponential enrichment).9-16 These special DNA molecules have been widely examined in recent years as molecular tools for biosensing applications.6-8
Our laboratory has established in vitro selection procedures for isolating RNA-cleaving fluorescent DNAzymes (RFDs; Fig. 1) and investigated the use of RFDs as analytical tools.17-29 RFDs catalyze the cleavage of a DNA-RNA chimeric substrate at a single ribonucleotide junction (R) that is flanked by a fluorophore (F) and a quencher (Q). The close proximity of F and Q renders the uncleaved substrate minimal fluorescence. However, the cleavage event leads to the separation of F and Q, which is accompanied by significant increase of fluorescence intensity.
More recently, we developed a method of isolating RFDs for bacterial detection.5 These special RFDs were isolated to "light up" in the presence of the crude extracellular mixture (CEM) left behind by a specific type of bacteria in their environment or in the media they are cultured (Fig. 1). The use of crude mixture circumvents the tedious process of purifying and identifying a suitable target from the microbe of interest for biosensor development (which could take months or years to complete). The use of extracellular targets means the assaying procedure is simple because there is no need for steps to obtain intracellular targets.
Using the above approach, we derived an RFD that cleaves its substrate (FS1; Fig. 2A) only in the presence of the CEM produced by E. coli (CEM-EC).5 This E. coli-sensing RFD, named RFD-EC1 (Fig. 2A), was found to be strictly responsive to CEM-EC but nonresponsive to CEMs from a host of other bacteria (Fig. 3).
Here we present the key experimental procedures for setting up E. coli detection assays using RFD-EC1 and representative results.

We have recently reported a novel approach for generating fluorogenic DNAzyme probes that can be applied to set up a simple, "mix-and-read" fluorescent assay for bacterial detection. These special DNA probes catalyze the cleavage of a chromophore-modified DNA-RNA chimeric substrate in the presence of crude extracellular mixture (CEM) produced by a specific bacterium, thereby translating bacterial detection into fluorescence signal generation. In this report we will describe key experimental procedures where a specific DNAzyme probe denoted "RFD-EC1" is employed for the detection of the model bacterium, Escherichia coli (E. coli).

Flourogenik DNAzymes kullanarak Bakterilerin Tespiti

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

MALDI-TOF kütle spektrometrisi kullanılarak kan kültür besi yerinden, Gram negatif bakterilerin hızlı belirlenmesi

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

The protocol to detect self-reactive CD4 T cells in brain and heart by direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers has been described in this report. For comprehensive analysis, a reliable method to enumerate the frequencies of antigen-specific CD4+ T cells in situ is also devised.

Majör Histo-uyum Kompleks sınıf II Dextramers kullanarak Beyin ve Heart reaktif CD4 T hücrelerinin in situ tespiti

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

16S rRNA Hedefleme Digoksin-etiketli DNA probu kullanılarak Parafine gömülmüş dokular içinde Bakterilerin in situ tespiti

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant viruses may be potentially pathogenic for many species of protists. They belong to the recently described order of Megavirales. The new lineage Faustovirus that has been isolated from sewage samples is distantly related to the mammalian pathogen African swine fever virus. This virus is also specific to its amoebal host, Vermamoeba vermiformis, a protist common in health care water systems. It is crucial to continue isolating new Faustovirus genotypes in order to enlarge its genotype collection and study its pan-genome. We developed new strategies for the isolation of additional strains by improving the use of antibiotic and antifungal combinations in order to avoid bacterial and fungal contaminations of the amoeba co-culture and favoring the virus multiplication. We also implemented a new starvation medium to maintain V. vermiformis in optimal conditions for viruses co-culture. Finally, we used flow cytometry rather than microscopic observation, which is time-consuming, to detect the cytopathogenic effect. We obtained two isolates from sewage samples, proving the efficiency of this method and thus widening the collection of Faustoviruses, to better understand their environment, host specificity and genetic content.

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

Kullanımı Çevre Örneklerinde Yeni Faustoviruses İzolasyonunda bir Hızlı Stratejisi<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and infections using cost effective, high-throughput approaches would be indispensable. This manuscript describes the development and analysis of a bead-based multiplex immunoassay capable of measuring the presence of antibodies in human saliva to multiple pathogens simultaneously. Saliva is particularly attractive in this application because it is noninvasive, cheaper and easier to collect than serum. Antigens from environmental pathogens were coupled to carboxylated microspheres (beads) and used to measure antibodies in very small volumes of human saliva samples using a bead-based, solution-phase assay. Beads were coupled with antigens from Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, noroviruses (G I.1 and G II.4) and hepatitis A virus. To ensure that the antigens were sufficiently coupled to the beads, coupling was confirmed using species-specific, animal-derived primary capture antibodies, followed by incubation with biotinylated anti-species secondary detection antibodies and streptavidin-R-phycoerythrin reporter (SAPE). As a control to measure non-specific binding, one bead set was treated identically to the others except it was not coupled to any antigen. The antigen-coupled and control beads were then incubated with prospectively-collected human saliva samples, measured on a high throughput analyzer based on the principles of flow cytometry, and the presence of antibodies to each antigen was measured in Median Fluorescence Intensity units (MFI). This multiplex immunoassay has a number of advantages, including more data with less sample; reduced costs and labor; and the ability to customize the assay to many targets of interest. Results indicate that the salivary multiplex immunoassay may be capable of identifying previous exposures and infections, which can be especially useful in surveillance studies involving large human populations.

In the current climate of scarce resources, new technologies are emerging that allow researchers to conduct studies cheaper, faster and with more precision. Here we describe the development of a bead-based salivary antibody multiplex immunoassay to measure human exposure to multiple environmental pathogens simultaneously.

Bir Tükürük Antikor Multiplex Immuoassay Gelişmekte Çevre Patojenler İnsan Pozlama&#39;yı Tedbir

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global prevalence and severity of this disease, V. cholerae has been extensively studied in both environmental and laboratory settings, requiring proper maintenance and culturing techniques. Classical and El Tor are two main biotypes that compose the V. cholerae O1 serogroup, each displaying unique genotypic and phenotypic characteristics that provide reliable mechanisms for biotype characterization, and require distinct virulence inducing culturing conditions. Regardless of the biotype of the causative strain for any given infection or outbreak, the standard treatment for the disease involves rehydration therapy supplemented with a regimen of antibiotics. However, biotype classification may be necessary for laboratory studies and may have broader impacts in the biomedical field. In the early 2000&#39;s clinical isolates were identified which exhibit genotypic and phenotypic traits from both classical and El Tor biotypes. The newly identified hybrids, termed El Tor variants, have caused clinical and environmental isolate biotype identification to become more complex than previous traditional single assay identification protocols. In addition to describing V. cholerae general maintenance and culturing techniques, this manuscript describes a series of gene specific (ctxB and tcpA) PCR-based genetic screens and phenotypic assays (polymyxin B resistance, citrate metabolism, proteolytic activity, hemolytic activity, motility, and glucose metabolism via Voges-Proskauer assay) collectively used to characterize and/or distinguish between classical and El Tor biotypes. Together, these assays provide an efficient systematic approach to be used as an alternative, or in addition, to costly, labor-intensive experiments in the characterization of V. cholerae clinical (and environmental) isolates.

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

This manuscript describes proper Vibrio cholerae maintenance techniques in addition to a series of biochemical assays, collectively utilized for quick and reliable differentiation between clinical and environmental V. cholerae biotypes in a laboratory setting.