우리는 분석 개발이 원고에 대한 비판적 의견과 관련하여 도움이 알베르토 Severini과 바네사 Goleski 감사드립니다. 이 작품은 캐나다의 보건 기관 및 산업 연구 지원 프로그램 (캐나다 국립 연구위원회)에 의해 재정 지원되었다. 추가 지원은 서스캐처원 출판물 기금의 대학에서 얻은 것입니다.

이 방법은 Dumonceaux 외에 보고된 연구에 사용되었습니다. J. Clin. . Microbiol 47 4067-4077, 간접 : 10.1128/jcm.00112-09 (2009). 전체 절차를 묘사한 도식 다이어그램 그림 1에 표시됩니다. 1. 비드 커플링 이것은 (표 2 참조) 폴리스티렌 Luminex 비즈에 oligonucleotide 프로브를 연결에 사용할 방법을 설명합니다. 볼륨은 시험 기준에 대한 새로운 캡처 프로브의 평가를위한 약간 적응되며 이러한 볼륨은 괄호 안에 표시됩니다. <ol><li> -20 ° C의 dessicator에서 1 - 에​​틸 -3 - (3 - dimethylamiopropyl) carbodiimide HCL (EDC) 분말을 제거하고 실내 온도로 따뜻하게. </li><li> 그리고 약 20 초 vortexing 20 초 동안 waterbath sonicator에서 sonciation하여 microspheres를 Resuspend. </li><li> (이것은 5x10 6 또는 1.25x에 해당 Eppendorf 튜브에 microspheres 400 μl (100 μl)를 전송10 6 microspheres). Luminex는 튜브에 고집과 구슬 복구를 방해에서 uncoupled 구슬을 방지하기 위해 낮은 단백질 바인딩 microcentrifuge 튜브 (예 : Eppendorf 단백질 LoBind 튜브, 카탈로그 번호 0030 108.094)의 사용을 제안합니다. 우리는 우리가 일반적으로 사용하는 표준 폴리 프로필렌의 microcentrifuge 튜브를 (예 : VWR 카탈로그 번호 87003-298)을 사용하여 문제를 발견하지 않았습니다. </li><li> 1 분 14,000 XG에 펠릿. 제거하고 뜨는 폐기하십시오. </li><li> (N - Morpholino) ethanesulfonic 산성 (MES) 산도 4.5 - 방 - 온도가 0.1 M이 50 μl의 microspheres (12.5 μl)를 Resuspend. </li><li> 10 MG / 물 속에 ML에서 EDC의 새로운 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 다음 10 MG / ML 물을 추가 분석 규모 EDC의 50-10 MG 무게하여이 솔루션의보다 한 ML을 준비합니다. </li></ol></li><li> 5&#39; - 아미노 C12 - 수정한 캡처 microspheres에 oligonucleotide (표 2)와 vortexing으로 섞어 1 nmol을 추가합니다. 1 nmol 200 μm의 oligo 5 μl입니다뉴클레오 티드. </li><li> 5 초 동안 vortexing하여 microspheres과 혼합 신선한 EDC 솔루션 2.5 μl를 추가합니다. </li><li> 어둠 속에서 30 분 동안 상온에서 부화. </li><li> EDC 솔루션 (단계 1.6) 취소하고 (단계 1.6) 위와 같이 물 10 밀리그램 / ML EDC의 새로운 샘플을 준비합니다. </li><li> 5 초 동안 microspheres과 와동 신선한 EDC 솔루션의 또 다른 2.5 μl를 추가합니다. </li><li> 어둠 속에서 30 분 동안 상온에서 부화. </li><li> 십대 초반 0.02 % 20 일 ML을 추가하여 비즈 씻으십시오. 구슬을 resuspend하는 소용돌이 (선택뿐만 아니라 20 초 동안 sonicate). </li><li> 14,000 XG 1 분 원심 분리기. 제거하고 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 0.1 %의 나트륨 dodecyl 황산 (SDS) 1 ML를 추가하여 다시 비즈 씻으십시오. 구슬을 resuspend하는 소용돌이 (선택뿐만 아니라 20 초 동안 sonicate). </li><li> 14,000 XG 1 분 원심 분리기. 제거하고 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 트리스 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 100 μl (25 μl) (TE) 버퍼 [10m에 비즈를 ResuspendM 트리스 - CL 산도 8.0, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0]. </li><li> 주식 농도를 결정하는 혈구계이나 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 카운터에서 구슬을 열거합니다. </li><li> 100 구슬 / TE 버퍼에 μl의 최종 농도 각 비드를 diluting하여 Microsphere 마스터 믹스를 준비합니다. 수영장은 분석의 원하는 플렉스 (예 : 10 - 플렉스 분석에 대한 각 비드의 100/μl의 최종 농도 10 가지 결합 구슬을 혼합)에 해당하는 구슬을 결합. </li><li> 4 Microsphere 마스터 믹스를 저장 ° C를 어둠 속이라서. 이러한 조건 하에서 보관하면 혼합물은 몇 달 동안 저장할 수 있습니다. </li></ol> 2. Chaperonin 60 보편적인 대상 (cpn60 UT) 단일 가닥의 amplicon 생산 및 생성. <ol><li> 각 샘플에 대한 중합 효소 사슬 반응 (PCR) 제품를 생성합니다. phosphorothioate과 비오틴 - 수정 5 &#39;프라이머 세트 (표 1) 포함합니다. 믹스에 볼륨과 농도에 대한 표 3을 참조하십시오. </li><li> PCR이 완료 직후, T7 전 2 μl를 (20 세대) 추가각 PCR 튜브 (PCR 버퍼는 T7 반응으로 충분)로 onuclease. 상온에서 반응 품어 (를 ~ 22-25 ° C) 40 분. </li><li> 이 부화의 끝에서, 0.5 M의 에틸렌의 12.5 μl를 추가 tetraacetic 산성 (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 산도 8.0 믹스를 디아민. 이것은 단일 좌초 PCR 제품의 ~ 64.5μl 총을 제공합니다. </li></ol> 3. oligonucleotide 결합 폴리스티렌 비즈로 단일 좌초 PCR 제품의 하이브 리다이 제이션. <ol><li> 60 Prewarm 악기 ° C 분석 중에 하이브 리다이 제이션 온도를 유지합니다. 악기의 소프트웨어를 사용하여 플랫폼 히터 전원을 켜고 hybridized 비드 혼합을 포함하는 PCR 스타일의 번호판을 맞는 황동 가열 블록을 사용해야합니다. </li><li> 피펫과 Resuspend Microsphere 마스터 믹스 (단계 1.20)는, Eppendorf 튜브에 해당하는 금액을 분배 캡 튜브, 2 분 waterbath sonicator에 sonicate. 양자 택일로, 비드 resuspe에서 절대 일관성을 보장하기 위해nsion은 microsphere 마스터 믹스는 다음 폴리 프로필렌 Eppendorf 튜브에 원하는 금액을 분배, 위와 같이 sonication을 vortexing 후, pipetting하여 resuspended 수 있습니다. </li><li> 로우 프로파일 96 - 웰 플레이트 Thermowell PCR (표 2)의 적절한 우물에 단일 좌초 PCR 제품 17 μl (단계 2.2) 분배. 각 자에게 resuspended, sonciated 비드 혼합 33 μl를 추가합니다. 실리콘 커버 (표 2)와 커버하고 부드럽게 누릅니다. </li><li> 의 프로그램 thermocycler에 접시를 넣고 10 분, 5 분, 60 ° C에 대해 95 ° C 60 ° C 잠깐 만요, 60 ° C 5 분, 끝. 프로그램을 시작합니다. </li><li> streptavidin - phycoerythrin (SA - PE) 솔루션 신선하게, 당신은 (여러 우물이 추가 확인) 물론 당 25 μl가 필요합니다. 0.1 %의 Sarkosyl,, 50 MM 트리스 - HCL, pH를 8.0 주식 SA - PE (1 MG / ML) 1X tetramethylammonium 염화 (TMAC) 버퍼 (3 M TMAC와 1시 50분 20 μg / ML을 diluting하여 SA - PE 솔루션을 확인하십시오 , 4 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0). </li><li> thermocycler가 60 ° C 대기 단계에 도달하면,, 뚜껑을 열고 실리콘 커버와 (thermocycler의 접시를 잡아 당기지 말라) 각 잘 직접 SA - PE 솔루션을 추가, 제거. , 실리콘 커버를 교체 thermocycler의 뚜껑을 닫고 프로그램을 재개한다. </li><li> 프로그램이 완료되면, 접시를 꺼내 빠르게 읽을 수 BioPlex 컴퓨터로 전송할 수 있습니다. 플레이트는 10 분 이내에 읽을 수 있어야합니다. 60 ° C에서 읽기, BioPlex이 온도 prewarmed되었는지 확인하십시오. 프로브 높이로 사용 악기에 대한 사용자 설명서에 설명된 활용 접시를 수용할 수 있도록 조정되었음을 확신한다. </li><li> 정확한 비드 및 신호 감지, BioPlex에있는 게이트 설정은 사용중인 microspheres의 종류에 따라 설정해야합니다. 자기 microspheres는 5,000-25,000의 설정을 요구하면서 BioRad의 폴리스티렌 구슬은 4,335-10,000의 게이트 설정을 필요로합니다. 기자 게인 값을 증가 고등 PMT 설정을 사용하여 번호판을 실행하는 옵션도 있습니다. 이것이 내가 할 수배경 신호도 증가 될 것이다 ncrease 낮은 신호의 강도 그러나 그것이 중요하다고는 적절한 대조군을 포함합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 : 이 분석을 개발하고 구현하는 우리의 목표 중 하나는 가능한 한 간단하고 유선형으로 만드는 것이었다. 따라서 합리적인 기간에 완료할 수 분석을 개발하기 위해 T7의 exonuclease 처리 시간과 하이브 리다이 제이션 시간을 포함하여, 중요한 포스트 증폭 단계를 최적화. 그림 2A에 나타난 amplicon의 T7 처리는 대부분의 프로브이 짧은 또는 전혀 T7 치료로 거의 신호를했다 등, 신호 생성을 위해 필수적입니다. 신호는 신호 증가 둔화되는 시간에, 약 40 분까지 선형적으로 증가했다. 신호의 저하는 primers의 phosphorothioate 수정이 targe을 방지하는 매우 효과적인 것을 나타내는 T7 처리 시간이 2 시간에서 심지어는 관찰되지 않았습니다t 스트랜드의 저하는 15 설명했다. 우리는 전체 프로토콜 시간을 최소화하기 위해 T7 처리 시간 40 분 선택,하지만 T7 치료가 훨씬 오래 갈 수있는 그림 2A에서 분명하다. 우리는 또한 신호 생성 (그림 2B)에 하이브 리다이 제이션 시간의 효과를 결정하고 10 분 최대 신호에 대한 충분한 것을 발견, 신호에 아니 더 증가로 심지어 하이브 리다이 제이션 4 시간 후에 관찰되었다. 따라서 10 분 하이브 리다이 제이션 단계는 전반적인 분석 시간을 최소화하기 위해 다시 선정되었습니다. 마음에와 같은 InstaGene (바이오 - RAD)로 신속한 DNA 추출 기술과 함께 이러한 결과로, DNA 추출, PCR, 그리고 Luminex 분석을 포함한 전반적인 분석은 4-5시간에 완료하실 수 있습니다. 경계의 메모에서 Luminex 또는 BioPlex 실행하는 동안 폴리스티렌 구슬 집합의 수준은 분석의 효율성에 큰 영향을 줄 수 있습니다. BioPlex 소프트웨어는 발생 비즈 집합의 수준을 표시합니다하나 이상의 구슬이 레이저 경로와 집계에서 하이브 리다이 제이션 신호의 배제의 결과에 감지됩니다. 명백한 비드 집계는 하나의 구슬에 맞는 크기를하지 않은 미립 물질로 인해 수 있으며, 심지어는 공기 방울로 인해 발생할 수 있습니다. 이러한 이벤트 중 하나에서 비드 집계, 공기 방울, 또는 입자의 신호가 삭제됩니다. 대부분의 경우, 우리는 그 구슬 집합이 최소한의 것입니다 (그림 3A)와 각 구슬 100 집계 이벤트의 타겟 레벨이 쉽게 달성됩니다 찾습니다. 때때로, 그러나, 구슬은 집합의 중간 (그림 3B) 또는 심각한 (그림 3C) 수준을 보여줍니다. 이러한 경우에는 데이터의 대부분은 무시되기 때문에, 악기는 100 종류의 구슬 당 행사와 그 결과를 도달 문제가 의심 수 있습니다. sonication 단계 (단계 3.2) 비드 집계를 최소화하기위한 것입니다. 또한, 희석 microsphere 마스터 믹스 (단계 1.20)로 비즈를 저장하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 우리는 hybri로부터 제외 TMAC을 알고있다dization 버퍼는 - 대신 SA - PE의 희석제 (3.5 단계)에 추가하면 - 비드 집계를 최소화하는 데 도움이됩니다. 더욱이, 우리는 이것을 테스트하지 않은 반면, Luminex 또는 BioRad에서 사용할 수있는 최신 자기 비즈가 집계하는 경향이보다 적게 표시 것으로 생각되고 있습니다. G.을 대상으로 5 플렉스 Luminex 배열의 응용 프로그램의 결과 vaginalis, A. vaginae, L. iners, L. crispatus, 그리고 L. 해당 그람 스테인드 질 면봉은 얼룩과 함께 gasseri는 그림 4에 표시됩니다. 이 샘플은 여러 시간 지점에서 한 개인에서 찍은. 시간 0에서, 개인은 그램 얼룩에 따라 BV 진단 (그림 4A)과 배열, G.의 대표 생물의 같은 샘플에서 Luminex 결과 (그림 4B)가 표시되었습니다 vaginalis은 가장 널리 동안 A. vaginae와 L. iners도 긍정했다. 9 일 후, 개인은 여전히​​ BV 긍정과 S되었다G.위한 ignal vaginalis가 대폭 증가가 있었을 때, A. vaginae와 L. iners은 여전히 긍정했다. 그람 양성 bacilli가 뭉개진에서 감지되기로 G.에 대한 신호를하면서 중요한 것은,이 시간 이후에 개인은 (그림 4A) 정상 microbiota로 전환 시작 vaginalis은 감소하고 L.위한 신호 iners (그림 4B) 증가했다. 그램이 G.을 감지하는 데 실패 얼룩 있지만,이 방법 (G.의 vaginalis 및 / 또는 A. vaginae에 대한 긍정적인 샘플 BV는 긍정적인 것으로 간주되었다) 13 BV 우리의 원래 정의에 의해,이 개인은 모든 시간 지점에서 긍정적인 BV되었습니다 후자의 두 시간 포인트에서 vaginalis. Luminex 방법은 여기서 설명으로 동향에 쉽게 시퀀싱 기반 방법에 비해 수 있으며, 유기체의 정체성과 풍부한에 대한 추가 정보를 제공하면서 Luminex 분석의 결과는 일반적으로 그램 얼룩 13 증명할. <img src=고도 유지를 &quot;/ files/ftp_upload/3344/3344fig1.jpg&quot;= &quot;그림 1&quot;/&gt; 그림 1. 복잡한 임상이나 환경 시료의 microbiota 프로필을 결정하기위한 Luminex 프로토콜의 도식 다이어그램. 프로토콜은 관심의 샘플에서 추출되었습니다 템플릿 DNA와 함께 시작합니다. (1)을 사용하여 템플릿 DNA에서 PCR 제품을 생성 스트랜드 특정 biotinylated, 수정되지 않은 cpn60 UT PCR primers (표 1)과 함께 phosphorothioate - 수정 cpn60 UT PCR의 primers, (2)이있는 microbiota 대표하는 PCR 제품 풀을 생성 비오틴을 한 가닥의 수정을 phosphorothioate (3) phosphorothioate - 수정 가닥을 저하되므로 비오틴과 5 &#39;끝에 수정 단일 좌초된 DNA를 생성 수 없습니다 T7의 exonuclease와 이중 좌초 PCR 제품을 다이제스트 (4) 커플 종 특정 cpn60 UT 프로브로 폴리스티렌 비즈 - 각 구슬은 고유한 스펙트럼 주소 (구슬 색깔로 표시)를 갖는다는 것 ILuminex 또는 바이오 플렉스 계기로 뚜렷한 S는 (5) 관심이 샘플에서 종 특정 oligonucleotide 결합 구슬의 제품군에 생성된 단일 좌초 PCR 제품을 잡종 (6)에 바인딩 streptavidin - phycoerythrin 공액 추가 biotinylated 단일 좌초 PCR 제품 및 하이브 리다이 제이션의 지표 역할을하고 있지만, (7) Luminex 또는 바이오 플렉스 악기를 사용하여 스펙트럼 주소 (구슬 정체성)와 하이브리드화 신호 강도를 확인합니다. 최소한 100 구슬은 각 구슬 정체성에 대한 집계되고 phycoerythrin 신호의 평균 형광 강도 (MFI)은 출력으로보고됩니다. 최대 100 개의 서로 다른 종류의 구슬을 동시에 평가할 수 있지만 세 비드 종류의 차별을 보여주는 분석이 그림입니다. (8) PCR의 MFI가 동일한 예제에서 생성된 복제하는 경우는 (1 꼬리 학생의 T - 테스트, P &lt;0.05) 주어진 구슬에 대한 부정적인 컨트롤보다 훨씬 큰, 예제는 그 생물에 대해 긍정적인 것으로 간주됩니다.<html><img src="/files/ftp_upload/3344/3344fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. Luminex 분석 매개 변수의 최적화. Peptostreptococcus의 anaerobius을 타겟으로하는 다섯 가지 프로브는 P. 포함하여 질과 연관된 것으로 알려진 20 박테리아의 복제된 cpn60 UT를 포함 plasmids를 구성된 혼합 템플릿에서 생성된 amplicons과 함께 사용되었다 anaerobius. (A). T7의 exonuclease 처리 시간의 효과. 위에서 설명한 프로토콜은 다음했지만 T7의 exonuclease과 치료 시간 전에 하이브 리다이 제이션 및 평균 형광 강도 (MFI) 모든 프로브에 대한 결정되었습니다하기 위해 다양한되었습니다. (B). 하이브 리다이 제이션 시간의 효과. 위에서 설명한 프로토콜은 하이브 리다이 제이션 시대의 다양한 이어했다. 프로브의 동일한 세트 및 평균 형광 강도 (MFI)가 모든 프로브에 대한 결정되었다에서 같은 템플릿에서 생성된 amplicon와 함께 사용되었습니다. &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3344/3344fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. BioPlex 소프트웨어를 사용하여 비드 집합의 결정. 세 가지 예제는 비드 집합의 수준 (5 %) (A) 허용되는 BioPlex의 실행에 주어집니다, (B) 경계선 (50 %) 및 ​​(C) 허용되지 않는 (80 %). <img src="/files/ftp_upload/3344/3344fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. 동일한 개인에서 가져온 샘플에서 순차 BV 진단에 5 플렉스 Luminex 배열의 응용. (A). BV 각 샘플을 평가하는 데 사용되는 전통적인 진단을 보여주는 그람 스테인드 슬라이드. (B). 5 플렉스 Luminex 배열의 응용 프로그램 준비하고 (A)에 표시된 동일한 사 샘플이 프로토콜에 설명된대로 실행. 그의 MFI 신호 박테리아 타겟은 우리의 정의 (1 꼬리 학생의 T - 테스트, P &lt;0.05)이 별표 (*)로 표시됩니다에 의해 상당히 긍정했다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

신호 생성의 특이성은 매우 중요합니다, 당신은 신호가 진정되는 유기체에서 발생 amplicon의 검출을 반영 관찰 확신해야합니다. 이러한 PrimerPlex (프리미어 Biosoft)와 같은 소프트웨어는 효율적으로 잡종을 것입니다 프로브를 설계하는 데 도움이 될 수 있습니다,하지만 그들은 나 이외의 대상 종에 간 잡종 수도 있고 그렇지 않을 수도 있습니다. 범용 PCR primers의이 프로토콜에 설명된대로 사용하면 ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Oligonucleotide 이름 </td><td> 회사 </td><td> 순서 1 </td></tr><tr><td> H279BP </td><td rowspan="3"> Invitrogen, IDT, 또는 기타 </td><td> 비오틴 - OEFO GAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC </td></tr><tr><td> H280 </td><td> YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT </td></tr><tr><td> H1612BP </td><td> 비오틴 - OEFO GAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC </td></tr><tr><td> H1613 </td><td></td><td> CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT </td></tr><tr><td colspan="3"> 1O, phosphorothioate - C, E, phosphorothioate - G, F, phosphorothioate - A, I, 이노신, Y, C 또는 T, R, A 또는 G, K, T 또는 G, S, C 또는 G. </td></tr></tbody></table> 범용 cpn60 PCR에 대한 수정 oligonucleotides의 표 1. 시퀀스. <table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름</td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 1 - 에​​틸 -3 - (3 - dimethylamiopropyl) carbodiimide HCL (EDC) </td><td> 찌르다 </td><td> 22,980 </td><td></td></tr><tr><td> 형광등 폴리스티렌 비즈 : MicroPlex Microspheres (Luminex) 또는 바이오 플렉스 COOH 비드 (바이오 RAD) </td><td> Luminex 또는 바이오 RAD </td><td> 바이오 방사선 : 171 - 506xxx 엑스 비드 식별자에 해당하는 위치를 </td><td> 자기 구슬이 oligonucleotide 커플링 사용할지고 있으며 특정 이점을 제공할 수 있습니다. 이 작가에 의해 시도되지 않았습니다. </td></tr><tr><td> 캡처 oligonucleotides (5 &#39;아미노산 C12 수정) </td><td> Invitrogen, IDT, 또는 기타 </td><td> 여러 </td><td> Desalted 순도 수준이 허용됩니다. 질 면봉을 특징하는 데 사용되는 캡처 프로브의 시퀀스는이 프로토콜은 13의 기반이되는 원고에 제공됩니다. </td></tr><tr><td> T7exonuclease </td><td> 뉴 잉글랜드 Biolabs </td><td> M0263S </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin - R - phycoerythrin (SA - PE) </td><td> Invitrogen </td><td> S - 866 </td><td> 고순도 SA - PE를 구하는주의, 본 카탈로그 번호 권장합니다 </td></tr><tr><td> Thermowell 96 잘 PCR 플레이트 </td><td> 어부 </td><td> CS006509 </td><td> 96 - 웰 thermocycler 및 BioPlex 기계 모두에 맞게 </td></tr><tr><td> Thermowell 밀봉 매트 </td><td> 어부 </td><td> CS006555 </td><td> 다시 사용할 수 있으며, 비눗물로 씻어도 잘 린스 및 건조 </td></tr><tr><td> 5M TMAC </td><td> 시그마 </td><td> T3411 </td><td></td></tr><tr><td> 바이오 플렉스 또는 Luminex 악기 </td><td> 바이오 방사선 또는 Luminex </td><td> 바이오 방사선 : 171-000201 </td><td></td></tr><tr><td> 프로브 설계를위한 PrimerPlex 소프트웨어 </td><td> 프리미어 Biosoft </td><td> www.premierbiosoft.com </td><td> Luminex 프로브 드를위한 제안다른 소프트웨어 플랫폼을 사용할 수 있지만, 서명 </td></tr></tbody></table> 표 2. 특정 시약과 장비. <table border="1"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> μl / 분석 </td><td> μl/100 assays </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td> 10X PCR 버퍼 (Invitrogen) </td><td> 5 </td><td> 500 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> 50 MM MgCl 2 (Invitrogen) </td><td> 2.5 </td><td> 250 </td><td> 2.5 MM </td></tr><tr><td> 10 MM dNTP </td><td> 일 </td><td> 100 </td><td> 0.2 MM 각 </td></tr><tr><td> H279BP, 25 μm의 </td><td> 0.25 </td><td> 25 </td><td> 375 NM </td></tr><tr><td> H1612BP, 25 μm의 </td><td> 0.75 </td><td> 75 </td><td> 125 NM </td></tr><tr><td> H280, 25 μm의 </td><td> 0.25 </td><td> 25 </td><td> 375 NM </td></tr><tr><td> H1613,25 μm의 </td><td> 0.75 </td><td> 75 </td><td> 125 NM </td></tr><tr><td> 물 </td><td> 34 </td><td> 3400 </td><td> --- </td></tr><tr><td> 합계 </td><td> 44.5 </td><td> 4450 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 3. 수정된 cpn60 UT primers (표 1) PCR을위한 혼합을 제안했다. 분석은 템플릿 DNA와 DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소 (Invitrogen) 0.5 μl (2.5U) 5 μl에 대해 설정되어 있습니다. 일반적으로 대량의 준비 (100 assays에 대한 충분한 예) 및 -20 ° C.에 저장됩니다

multiplex detection of bacteria in complex clinical and environmental samples using oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres

세균성 vaginosis (BV)는 Gardnerella vaginalis에, Atopobium vaginae 포함한 세균 종의 숫자에 의해 지배 microbiota에 락토 - 지배와 다른 1-3에서 &quot;정상적인&quot;microbiota에 변화가 특징입니다 되풀이 polymicrobial 증후군이다. 이 조건은 HIV 취득 사를 포함하여 부정적인 건강 결과의 범위와 관련된이며, 그것은 임상 오 관리하기 어려울 수 있습니다. 또한, BV의 진단은 다양한 수치 기준 6,7에 대한 채점 아르 질 면봉 얼룩의 그램 얼룩의 사용에 의존하고 있습니다. 이 진단은 간단하고 저렴하고, 자원 제한 설정에 잘 적합하지만, 그것은 주관적인 해석에 관련된하고 질 microbiota 8 구성에 대한 자세한 프로파일을 제공하지 않는 문제를 고생하실 수 있습니다. 최근 깊은 순서 노력과 함께 풍부하고 다양한 질 microbiota 감을 잡을수있다BV 11,12의 분자 진단에 대한 잠재적인 공격 대상 숫자의 식별 결과가 정상 9,10 간주됩니다 그 개인에 비해 BV 진단 아르 개인에서 가져온 샘플 사이의 명확한 차이. 이러한 연구는 유용한 정보의 부를 제공하지만, 깊은 시퀀싱 아직 임상 설정에서 진단 방법으로 실용적되지 않습니다. 우리는 최근 빠르게 Luminex 플랫폼 13 감지 oligonucleotide - 결합 형광 구슬을 사용하여 멀티 플렉스 형식으로 질 microbiota를 프로 파일링하는 방법을 설명합니다. 이 방법은, 현재 그램 얼룩 기반의 방법처럼 신속하고 간단하지만 프로브 디자인 연구 순서에서 발생하는 분자 지식을 악용의 추가 이점을 추가합니다. 이 방법은 따라서 높은 특이성과 민감도 광고와 BV를 진단하는 데 사용할 수있는 질 면봉에 존재하는 주요 미생물을 프로파일하는 방법을 제공한다세미 양적 및 빠른 방법으로 종의 존재와 풍부한에 대한 추가 정보를 제공하면서 그램 얼룩이 ared. 이 멀티 플렉스 방식은 물론 현재 단일 샘플 14 5 ~ 6 가지 assays 제한됩니다 특히 생물에 대한 현재의 양적 PCR의 assays의 시야 밖으로 확장됩니다. 중요한 것은 방법이 질 면봉에 박테리아의 검출에 국한되지 않고 쉽게 빠르게 관심 거의 모든 미생물 커뮤니티의 프로필에 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 최근 폐수 처리 공장에 사용하기 위해 진단 도구의 개발이 방법론을 적용하기 시작했다.

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Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

우리는 oligonucleotide 결합 형광 구슬을 사용하여 샘​​플 내에 미생물의 검출을위한 다양한 방법을 설명합니다. 샘플 내의 모든 생물에서 Amplicon는 프로브 결합 구슬의 패널에 hybridized입니다. Luminex 또는 바이오 플렉스 악기는 비드 타입과 하이브 리다이 제이션 신호를 각 비드를 쿼리하는 데 사용됩니다.

Oligonucleotide - 결합 형광등 Microspheres를 사용하여 복잡한 임상 및 환경 샘플에서 박테리아의 멀티 플렉스 감지

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

multiplex-detection-bacteria-complex-clinical-environmental-samples

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.1K 조회수.  Agriculture and Agri-Food Canada. 우리는 oligonucleotide 결합 형광 구슬을 사용하여 샘​​플 내에 미생물의 검출을위한 다양한 방법을 설명합니다. 샘플 내의 모든 생물에서 Amplicon는 프로브 결합 구슬의 패널에 hybridized입니다. Luminex 또는 바이오 플렉스 악기는 비드 타입과 하이브 리다이 제이션 신호를 각 비드를 쿼리하는 데 사용됩니다.

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Multiplexed Fluorescent Microarray for Human Salivary Protein Analysis Using Polymer Microspheres and Fiber-optic Bundles

Herein, we describe a protocol for simultaneously measuring six proteins in saliva using a fiber-optic microsphere-based antibody array. The immuno-array technology employed combines the advantages of microsphere-based suspension array fabrication with the use of fluorescence microscopy. As described in the video protocol, commercially available 4.5 &#956;m polymer microspheres were encoded into seven different types, differentiated by the concentration of two fluorescent dyes physically trapped inside the microspheres. The encoded microspheres containing surface carboxyl groups were modified with monoclonal capture antibodies through EDC/NHS coupling chemistry. To assemble the protein microarray, the different types of encoded and functionalized microspheres were mixed and randomly deposited in 4.5 &#956;m microwells, which were chemically etched at the proximal end of a fiber-optic bundle. The fiber-optic bundle was used as both a carrier and for imaging the microspheres. Once assembled, the microarray was used to capture proteins in the saliva supernatant collected from the clinic. The detection was based on a sandwich immunoassay using a mixture of biotinylated detection antibodies for different analytes with a streptavidin-conjugated fluorescent probe, R-phycoerythrin. The microarray was imaged by fluorescence microscopy in three different channels, two for microsphere registration and one for the assay signal. The fluorescence micrographs were then decoded and analyzed using a homemade algorithm in MATLAB.

We describe a procedure for profiling salivary proteins using multiplexed microsphere-based antibody arrays. Monoclonal antibodies were covalently linked to fluorescent dye-encoded 4.5 &#x03BC;m polymer microspheres using carbodiimide chemistry. The modified microspheres were deposited in fiber-optic microwells to measure protein levels in saliva using fluorescence sandwich immunoassays.

고분자 마이크로 스피어 및 광섬유 번들을 사용하여 인간의 타액 단백질 분석을위한 다중 형광 마이크로 어레이

Herein, we describe a protocol for simultaneously measuring six proteins in saliva using a fiber-optic microsphere-based antibody array. The immuno-array ...

연구

화학

Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different downstream patient-to-patient transmission potentials, and require very different patient treatments. Thus, recent Zika outbreaks make it urgent to develop tools that rapidly discriminate these viruses in patients and trapped mosquitoes, to select the correct patient treatment, and to understand and manage their epidemiology in real time.
Unfortunately, current diagnostic tests, including those receiving 2016 emergency use authorizations and fast-track status, detect viral RNA by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), which requires instrumentation, trained users, and considerable sample preparation. Thus, they must be sent to &#34;approved&#34; reference laboratories, requiring time. Indeed, in August 2016, the Center for Disease Control (CDC) was asking pregnant women who had been bitten by a mosquito and developed a Zika-indicating rash to wait an unacceptable 2 to 4 weeks before learning whether they were infected. We very much need tests that can be done on site, with few resources, and by trained but not necessarily licensed personnel.
This video demonstrates an assay that meets these specifications, working with urine or serum (for patients) or crushed mosquito carcasses (for environmental surveillance), all without much sample preparation. Mosquito carcasses are captured on paper carrying quaternary ammonium groups (Q-paper) followed by ammonia treatment to manage biohazards. These are then directly, without RNA isolation, put into assay tubes containing freeze-dried reagents that need no chain of refrigeration. A modified form of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification with target-specific fluorescently tagged displaceable probes produces readout, in 30 min, as a three-color fluorescence signal. This is visualized with a handheld, battery-powered device with an orange filter. Forward contamination is prevented with sealed tubes, and the use of thermolabile uracil DNA glycosylase (UDG) in the presence of dUTP in the amplification mixture.

Current multiplexed diagnostics to detect Zika, chikungunya, and dengue viruses require complex sample preparation and expensive instrumentation, and are difficult to use in low resource environments. We show a diagnostic that uses isothermal amplification with target-specific strand displaceable probes to detect and differentiate these viruses with high sensitivity and specificity.

멀티플렉스 등온 증폭 Zika, Chikungunya, 뎅 그 열의 1 감지 진단 플랫폼을 기반으로

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different ...

생화학

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

물방울 미세 유체에 대한 여러 가지 빛깔의 형광 검출 광학 섬유를 사용하여

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

생체공학

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

입자의 공간 추적을위한 멀티 플렉스 전자 감지와 미세 유체 플랫폼

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

모 세관 배열에 여러 개의 핵 산의 비주얼 검색

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and water-screening methods used currently. While conventional bacterial detection methods, such as polymerase chain reaction (PCR) and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) can specifically detect pathogenic contaminants, they require extensive sample preparation and lengthy waiting periods. In addition, these practices demand sophisticated laboratory instruments and settings, and must be executed by trained professionals. Herein, a protocol is proposed for a simpler diagnostic technique that features the unique combination of magnetic and fluorescent parameters in a nanoparticle-based platform. The proposed multiparametric magneto-fluorescent nanosensors (MFnS) can detect E. coli O157:H7 contamination with as little as 1 colony-forming unit present in solution within less than 1 h. Furthermore, the ability of MFnS to remain highly functional in complex media such as milk and lake water has been verified. Additional specificity assays were also used to demonstrate the ability of MFnS to only detect the specific target bacteria, even in the presence of similar bacterial species. The pairing of magnetic and fluorescent modalities allows for the detection and quantification of pathogen contamination in a wide range of concentrations, exhibiting its high performance in both early- and late-stage contamination detection. The effectiveness, affordability, and portability of the MFnS make them an ideal candidate for point-of-care screening for bacterial contaminants in a wide range of settings, from aquatic reservoirs to commercially packaged foods.

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

The overall goal of this protocol is to synthesize functional nanosensors for the portable, cost-effective, and rapid detection of specifically targeted pathogenic bacteria through a combination of magnetic relaxation and fluorescence emission modalities.

E. 콜라이 O157:H7의 Foodborne 병원 체 검사를 사용 하 여 자기 형광 Nanosensor: 신속한 감지

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and ...

면역학 및 감염병학

A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample that can provide information about antigen coexpression and spatial distribution of the markers. However, a lack of suitable antibodies for formalin-fixed tissues may restrict the nature of markers that can be detected. In addition, the staining method is time-consuming. Here we describe a rapid method to perform multispectral fluorescence imaging on frozen tissues. The method includes the fluorophore combinations used, detailed steps for the staining of mouse and human frozen tissues, and the scanning, acquisition, and analysis procedures. For staining analysis, a commercially available semiautomated multispectral fluorescence imaging system is used. Through this method, up to six different markers were stained and detected in a single frozen tissue section. The machine learning analysis software can phenotype cells that can be used for quantitative analysis. The method described here for frozen tissues is useful for the detection of markers that cannot be detected in FFPE tissues or for which antibodies are not available for FFPE tissues.

We describe a rapid staining method to perform multispectral imaging on frozen tissues.

냉동 조직 섹션의 다스펙트럼 형광 이미징을위한 신속한 방법

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample ...

혈청 내 Borrelia 특이적 IgG 및 IgM에 대한 다중 면역분석

Simultaneous Detection of Different Antibody Classes in a Multiplexed Serological Test

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different antibody isotypes because they appear at different stages of the host immune response. With Lyme borreliosis, the pathogenic agent can be one of the multiple members of the Borrelia species. Therefore, correct sample classification requires evaluating the immunoreactivity against different antigens of different Borrelia species. Additionally, anti-pathogen IgG and IgM responses can have different elicitation time courses during disease progression. Here we demonstrate the development of a two-reporter multiplex immunoassay that has utility in identifying Borrelia-specific immune response in human serum samples by simultaneously evaluating both IgG and IgM immunoreactivity against different bacterial antigens in the same reaction well. This dual-reporter approach retains the analytical performance of single-reporter methods while conserving time and resources and reducing sample size requirements. This assay allows essentially double the serological information to be generated from a blood sample in half the time.

저자 스포트라이트: Extending the Scope of Multiplex Immunoassay for Lyme Borreliosis Diagnostics and Pathogen Research (라임 보렐리오증 진단 및 병원체 연구를 위한 멀티플렉스 면역분석의 범위 확장) 

A three-channel dual-reporter fluorescence flow analysis system was used to develop a bead-based multiplex immunoassay that simultaneously evaluates serum samples for IgG and IgM elicited against multiple antigens of different Borrelia species that cause Lyme borreliosis in Europe and North America.

다중 혈청학적 검사에서 다양한 항체 등급의 동시 검출

To monitor the progression of infectious diseases, it is useful to assess immunoreactivity against various antigenic determinants, and measure different ...

Oligonucleotide - 결합 형광등 Microspheres를 사용하여 복잡한 임상 및 환경 샘플에서 박테리아의 멀티 플렉스 감지

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멀티플렉스 등온 증폭 Zika, Chikungunya, 뎅 그 열의 1 감지 진단 플랫폼을 기반으로

물방울 미세 유체에 대한 여러 가지 빛깔의 형광 검출 광학 섬유를 사용하여

입자의 공간 추적을위한 멀티 플렉스 전자 감지와 미세 유체 플랫폼

모 세관 배열에 여러 개의 핵 산의 비주얼 검색

E. 콜라이 O157:H7의 Foodborne 병원 체 검사를 사용 하 여 자기 형광 Nanosensor: 신속한 감지

냉동 조직 섹션의 다스펙트럼 형광 이미징을위한 신속한 방법

다중 혈청학적 검사에서 다양한 항체 등급의 동시 검출

다중 혈청학적 검사에서 다양한 항체 등급의 동시 검출

다중 혈청학적 검사에서 다양한 항체 등급의 동시 검출